專利名稱：：高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法及其應(yīng)用，用于臨床病毒快速培養(yǎng)與鑒定。
背景技術(shù)：
：病毒性傳染病是當(dāng)今人類感染性疾病中的主要疾病。新近資料顯示，近30年新發(fā)現(xiàn)的傳染病中，已明確病原體的疾病中約有60%是由病毒引起的，而呼吸道疾病中約有50%由病毒引起，其中的典例就是SARS冠狀病毒和高致病性禽流感病毒。包括禽流感和SARS在內(nèi)的許多突發(fā)性呼吸系統(tǒng)傳染病在臨床上多以發(fā)熱或重癥肺炎的形式出現(xiàn)，需要依賴于病原學(xué)檢查才能做出明確診斷。這些疾病的病死率高，除了病毒本身具有高致病性外，診斷延誤亦是一個(gè)重要原因。呼吸疾病嚴(yán)重威脅人們身體健康，在我國(guó)加強(qiáng)呼吸系統(tǒng)傳染病的研究，尤其是臨床病原診斷學(xué)的研究，已經(jīng)成為社會(huì)發(fā)展面臨的一種迫切要求。傳染病的確定診斷依賴于病原學(xué)檢查，當(dāng)前該領(lǐng)域的重點(diǎn)之一是建立快速而敏感的病原學(xué)診斷方法。病原學(xué)診斷方法包括電鏡、組織病理學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)檢查、免疫熒光和免疫化學(xué)染色、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法、PCR分子檢測(cè)方法、血清學(xué)檢查等方法。其中，電鏡適用于一些難以培養(yǎng)的或者迄今尚不能培養(yǎng)的病毒，但電鏡檢查所需儀器昂貴、需要專門的技術(shù)人員，且敏感性和特異性不高。通常標(biāo)本中病毒含量要高達(dá)每毫升105_106，才會(huì)被電鏡有效地檢出。組織病理學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)檢查方法中，多數(shù)病毒感染造成的細(xì)胞學(xué)改變只能幫助診斷到科的水平，或僅能提示有病毒感染存在。盡管直接免疫熒光檢查快速，但其漏檢率較高，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)病毒。臨床病毒的分離培養(yǎng)及其鑒定需要以哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)，而常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)操作繁瑣，接種數(shù)量少，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、試劑消耗量大。這直接阻礙了臨床病毒診斷的發(fā)展，導(dǎo)致我國(guó)病毒實(shí)驗(yàn)診斷落后于世界上主要國(guó)家。常規(guī)病毒分離作為一種實(shí)驗(yàn)診斷手段，但對(duì)于有些病毒目前還沒有適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法，還有的因培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)而失去其早期診斷價(jià)值，或者方法過于繁瑣而不宜常規(guī)使用。分子檢測(cè)方法敏感性高，但可能造成假陽(yáng)性結(jié)果；不適用于未知病毒的檢測(cè)；不能知道病毒的死活；不能獲得活的病毒。近年來，一些營(yíng)利和非營(yíng)利性機(jī)構(gòu)在免疫學(xué)和分子診斷技術(shù)方面做了不少研究和開發(fā)，這些都是必要的。但是，作為〃金標(biāo)準(zhǔn)〃的病毒分離培養(yǎng)卻由于技術(shù)較為復(fù)雜、見效比較慢、要求投入比較高，而沒有受到應(yīng)有的重視。這種本末倒置的現(xiàn)象需要加以扭轉(zhuǎn)。病毒分離培養(yǎng)是唯一能夠獲得活病毒的方法，這不僅對(duì)臨床疾病的明確診斷有極為重要的價(jià)值，而且對(duì)開展病毒的后續(xù)研究如病毒的遺傳與變異的研究、致病機(jī)理的探索、藥物敏感性的檢測(cè)、相應(yīng)疫苗的研發(fā)等等都是不可缺少的前提條件。同時(shí)在國(guó)外，病毒培養(yǎng)也一直是新研發(fā)的免疫學(xué)和分子病毒診斷方法賴以比較與評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定法，以改變常規(guī)病毒培養(yǎng)診斷速度慢，操作繁瑣的現(xiàn)狀，可以廣泛應(yīng)用于臨床病毒實(shí)驗(yàn)室、公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)相關(guān)標(biāo)本的病毒分離培養(yǎng)以及鑒定。為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明的一種高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法為在培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，將待培養(yǎng)鑒定的標(biāo)本接種到所述細(xì)胞后離心，然后進(jìn)行培養(yǎng)，最后將培養(yǎng)所得的待鑒定細(xì)胞液滴加到多孔玻璃片上進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)速為2500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為30-90分鐘，離心的溫度保持為25-37°C。細(xì)胞采用原代或傳代細(xì)胞，在顯微鏡下呈均勻的單層貼壁細(xì)胞。原代細(xì)胞中正常地存在著不同類型的細(xì)胞，而傳代細(xì)胞株則為均一的細(xì)胞類型，細(xì)胞活力良好，沒有老化、重疊、局部缺失等現(xiàn)象。細(xì)胞優(yōu)選為狗腎細(xì)胞、原代恒河猴腎細(xì)胞、正常人胚肺成纖維細(xì)胞株、人鼻咽癌細(xì)胞株、人肺腺癌細(xì)胞株、恒河猴腎細(xì)胞株、非洲綠猴腎上皮細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞、呼吸道病毒檢測(cè)混合細(xì)胞、橫紋肌肉瘤細(xì)胞和以上述細(xì)胞為基礎(chǔ)作基因改造后的敏感細(xì)胞中的至少一種，即所用的細(xì)胞可以是一種類型的細(xì)胞，也可以是幾種類型的細(xì)胞混合物。臨床病毒分離常用細(xì)胞或細(xì)胞株見表l所示。表1英文縮寫中文名稱RHMK原代恒河猴腎細(xì)胞MRC-5正常人胚肺成纖維細(xì)胞抹HEp-2人鼻咽癌細(xì)胞抹A549人肺腺癌細(xì)力包才朱LLC-MK2恒河猴腎細(xì)胞林VERO-E6非洲綠猴腎上皮細(xì)胞林CACO-2人結(jié)腸癌細(xì)胞R-MIX呼吸道病毒檢測(cè)混合細(xì)胞RD18S橫紋肌肉瘤細(xì)胞細(xì)胞本身不含任何內(nèi)源性病毒，對(duì)每批細(xì)胞產(chǎn)品做PCR和免疫熒光法檢查，確定細(xì)胞中沒有病毒存在，結(jié)果陰性方可使用。細(xì)胞產(chǎn)品無支原體污染，支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中比較常見的現(xiàn)象，特別是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的傳代細(xì)胞株。為了保證細(xì)胞對(duì)臨床各種待檢病毒的敏感性和穩(wěn)定性。每批細(xì)胞產(chǎn)品做PCR和免疫熒光法檢查，確定細(xì)胞中沒有支原體存在，結(jié)果陰性方可使用。所有細(xì)胞在熒光顯微鏡下，在350-600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)都不存在自發(fā)熒光。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室傳代過程中都有可能發(fā)生遺傳性狀的改變，因此任何一種細(xì)胞都不可能無限制傳代而始終保持其對(duì)病毒的敏感性不變。除了對(duì)每一批細(xì)胞都要抽樣用標(biāo)準(zhǔn)病毒株予以考核以外，可以參考美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)供臨床病毒檢驗(yàn)用的傳代細(xì)胞的最高傳代數(shù)做出如表2所述的規(guī)定。表2列出了供臨床病毒診斷用細(xì)胞株的最高允許傳代數(shù)。表2細(xì)胞抹最高傳代數(shù)(次)MDCK130MRC-527HEp-2390A549100VERO-E6150采用本發(fā)明的方法，不同細(xì)胞的接種濃度具體見表3，可以適用于各種多孔細(xì)胞板。表3病毒每文感的宿主細(xì)月包接種濃度(個(gè)/mL)副濟(jì)u感病毒、^f烏肺病毒LLC-MK24.5x104呼吸道合胞病毒、腺病毒HEp-2腺病毒A5492.0xl05流感病毒MDCK5.5xl04冠狀病毒、偏肺病毒VERO-E6、CACO-21.0xl05腸道病毒、皰滲病毒MRC-5、RD18S5.0x105流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒R-MIX2.0xl05采用本發(fā)明所述的方法對(duì)病毒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)鑒定的條件及時(shí)間見表4。表4病毒培養(yǎng)環(huán)境離心后培養(yǎng)天數(shù)不離心培養(yǎng)天數(shù)甲型流感病毒35°C，5%C02,2pg/mL的TPCK胰酶2-33-7乙型流感病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒35°C，5%C02,2|ag/mL的TPCK胰酶35°C,5%C02,2pg/mL的TPCK胰酶35°C,5%C022-34-72-73-75-73-7腺病毒35°C,5%C022-72-12偏肺病毒35°C，5%C025-128-14腸道病毒35°C,5%C022-73-8冠狀病毒35°C,5%C022-53-7所述多孔玻璃片包括玻璃片和帶孔的膠片，所述帶孔的膠片與所述玻璃片緊密相連。所述免疫熒光檢測(cè)所需要的熒光標(biāo)記抗體的用量為8-101。本發(fā)明的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法可以鑒定DNA病毒，也可以鑒定RNA病毒；優(yōu)選的，可鑒定的病毒包括副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、冠狀病毒、腸道病毒和皰疹病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定法檢測(cè)通量高，標(biāo)本處理時(shí)間減少，工作量減少不同種類的細(xì)胞接種到同一塊多孔板上，如為96孔板，每塊板可同時(shí)接種11份標(biāo)本，每份標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)7種病毒。本發(fā)明利用改進(jìn)的高通量標(biāo)本接種方法，通過離心操作，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞，既縮短病毒培養(yǎng)時(shí)間，又增加檢測(cè)的敏感性。每種病毒試劑用量少，只需微量免疫熒光試劑即可判斷結(jié)果，大大減少試劑消耗量。此方法改變常規(guī)病毒培養(yǎng)診斷速度慢，操作繁瑣的現(xiàn)狀，可以廣泛應(yīng)用于臨床病毒實(shí)驗(yàn)室、公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)相關(guān)標(biāo)本的病毒分離培養(yǎng)以及鑒定。圖1是利用本發(fā)明檢測(cè)臨床樣本后，病毒感染敏感細(xì)胞的免疫熒光染色圖2是本發(fā)明中用到的多孔玻璃片的示意圖。具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1:利用本發(fā)明的方法對(duì)1327份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)本實(shí)施例中用到的細(xì)胞株如下MDCK細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，LLC_MK2(中科院上海細(xì)胞庫(kù))、HEp-2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，RD18S細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，MRC-5(美國(guó)ATCC)，其它細(xì)胞來源于本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存的細(xì)胞。本實(shí)施例中用到的標(biāo)本來源于廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院于2009年1-9月份發(fā)熱門診采集成人流感樣患者的咽拭子標(biāo)本，共1327份。(1)細(xì)胞選擇細(xì)胞采用原代或傳代細(xì)胞，在顯微鏡下呈均勻的單層貼壁細(xì)胞。原代細(xì)胞中正常地存在著不同類型的細(xì)胞，而傳代細(xì)胞株則為均一的細(xì)胞類型，細(xì)胞活力良好，沒有老化、重疊、局部缺失等現(xiàn)象。細(xì)胞本身不含任何內(nèi)源性病毒對(duì)每批細(xì)胞產(chǎn)品做PCR和免疫熒光法檢查，確定細(xì)胞中沒有病毒存在，結(jié)果陰性方可使用。細(xì)胞產(chǎn)品無支原體污染支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中比較常見的現(xiàn)象，特別是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的傳代細(xì)胞株。為了保證細(xì)胞對(duì)臨床各種待檢病毒的敏感性和穩(wěn)定性。每批細(xì)胞產(chǎn)品做PCR和免疫熒光法檢查，確定細(xì)胞中沒有支原體存在，結(jié)果陰性方可使用。所有細(xì)胞在熒光顯微鏡下，在350-600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)都不存在自發(fā)熒光。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室傳代過程中都有可能發(fā)生遺傳性狀的改變，因此任何一種細(xì)胞都不可能無限制傳代而始終保持其對(duì)病毒的敏感性不變。除了對(duì)每一批細(xì)胞都要抽樣用標(biāo)準(zhǔn)病毒株予以考核以外，我們參考美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)供臨床病毒檢驗(yàn)用的傳代細(xì)胞的最高傳代數(shù)按表2所列出的數(shù)據(jù)規(guī)定，其它細(xì)胞按常規(guī)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。表2細(xì)胞林最高傳代數(shù)(次)MDCK130MRC-527HEp-2390A549100VER0隱E61502、細(xì)胞培養(yǎng)多孔板準(zhǔn)備(以接種96孔板為例)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中準(zhǔn)備好的單層貼壁細(xì)胞(生長(zhǎng)比率85-95%);(2)吸棄生長(zhǎng)液；(2)以5ml1XPBS(磷酸緩沖液)輕柔的清洗細(xì)胞面，然后棄去；(3)加入1.5ml0.25%胰酶，置37。C反應(yīng)2-3min;(4)用10ml含10%MEM(含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基)重懸，反復(fù)吹打15次，充分混勻，并用牛鮑計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(5)各種細(xì)胞按照表3的濃度接種于96孔細(xì)胞板，O.lmL/孔；按照不同的實(shí)驗(yàn)要求，多孔板中接種的細(xì)胞組合見下表，每種細(xì)胞接種2-3行；(6)37°C，5%C02孵育3天即可長(zhǎng)滿單層。不同細(xì)胞的接種濃度按表3數(shù)據(jù)來進(jìn)行。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、標(biāo)本處理(3)震蕩標(biāo)本(振蕩30-60秒)；(2)棄去拭子；(3)4°C，離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘;(4)設(shè)立陰性對(duì)照孔，和陽(yáng)性對(duì)照孔(用標(biāo)準(zhǔn)病毒株或新近鑒定的臨床分離株)；(5)按照不同的實(shí)驗(yàn)要求每份標(biāo)本上清液接種于相應(yīng)敏感的宿主細(xì)胞，每孔0.lmL，每種細(xì)胞三個(gè)復(fù)孔；(6)26。C，離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，60分鐘;(7)加入病毒培養(yǎng)基；按照不同實(shí)驗(yàn)要求，不同病毒在不同溫度下培養(yǎng)天數(shù)不同(詳見表4)。表4培養(yǎng)環(huán)境離心后不離心培養(yǎng)天數(shù)培養(yǎng)天數(shù)甲型流感病毒35°C，5%C02,2iug/mL的TPCK胰酶2-33-7乙型流感病毒35。C,5%C02,2|ug/mL的TPCK胰酶2-33-7副流感病毒35°C,5%C02，2ng/mL的TPCK胰酶4-75-7呼吸道合胞病毒35°C,5%C022-73-7腺病毒35°C,5%C022-72-12偏肺病毒35°C,5%C025-128-14腸道病毒35°C,5%C022-73-8冠狀病毒35°C,5%C022-53-74、標(biāo)本接種取長(zhǎng)滿單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗2遍，每份標(biāo)本分別接種于上述4種細(xì)胞(0.ImL/孔)。經(jīng)室溫3000rpm離心60min后，加入病毒維持培養(yǎng)液，置34°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5、病毒鑒定(1)吸取孔中培養(yǎng)液到凍存管中暫存(其中可能含有活的病毒)；(2)用PBS洗細(xì)胞面一次；(3)每孔加入50iiLPBS，反復(fù)吹打細(xì)胞面，使細(xì)胞脫落；(4)取15yL細(xì)胞懸液至多孔玻璃片，每種病毒一個(gè)孔，待干；(5)將玻璃片浸泡于凍丙酮中20-30分鐘，待干；(6)用PBS輕柔地洗玻璃片1次，待干；(7)每孔加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體8-10iiL;(8)放濕盒置37t:溫箱中孵育30分鐘；(9)用PBS洗3次，待干；(10)在多孔玻璃片上滴加封片液后用蓋玻片封閉；封片液主要是甘油和磷酸緩沖液；(11)置熒光顯微鏡下觀察；結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為顯示蘋果綠熒光的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，陰性細(xì)胞無熒光。病原體對(duì)照玻片有分別含陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞的點(diǎn)樣孔。在檢測(cè)的1327份樣本中，病毒培養(yǎng)陽(yáng)性一共556份，總陽(yáng)性率為42%。其中甲型流感病毒381株(381/1327，28.7%)，乙型流感病毒143株(143/1327，10.7%)，副流感病毒10株(10/1327,0.75%)，腺病毒5株(5/1327,0.37%)，皰疹病毒4株(4/1327,0.3%)，呼吸道合胞病毒2株(2/1327,0.15%)，腸道病毒2株(2/1327,0.15%)，暫未分離到偏肺病毒和冠狀病毒，見表5。表5為廣州地區(qū)2009年1-9月ILI(流感樣疾病)病例的病毒構(gòu)成情況。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，部分病毒感染敏感細(xì)胞的免疫熒光染色圖可見圖l，圖l顯示了病毒感染敏感細(xì)胞的免疫熒光染色圖。由圖l可見，病毒感染的陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后呈現(xiàn)蘋果綠熒光；其中，圖1A顯示InfA感染的MDCK細(xì)胞(免疫熒光染色，X200)，圖IB顯示RSV感染HEp-2細(xì)胞(免疫熒光染色，X100)，圖1C顯示ADV感染HEp-2細(xì)胞(免疫熒光染色，X100)。圖2為本發(fā)明中用到的多孔玻璃片，多孔玻璃片包括玻璃片1和帶孔的膠片2，帶孔的膠片2與玻璃片1緊貼在一起，形成孔，可以將帶檢測(cè)的試劑滴加進(jìn)去，進(jìn)行顯色檢測(cè)。將上述標(biāo)本上清液接種于相應(yīng)敏感的宿主細(xì)胞后，當(dāng)離心的轉(zhuǎn)速選擇為2500轉(zhuǎn)/分，離心的時(shí)間選擇為90分鐘，培養(yǎng)的溫度選擇為25t:時(shí)或離心的轉(zhuǎn)速選擇為4000轉(zhuǎn)/分，離心的時(shí)間選擇為30分鐘，培養(yǎng)的溫度選擇為37t:時(shí)，得到與上述結(jié)果相同的結(jié)論。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。權(quán)利要求高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，在培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，將待培養(yǎng)鑒定的標(biāo)本接種到所述細(xì)胞后離心，然后進(jìn)行培養(yǎng)，最后將培養(yǎng)所得的待鑒定細(xì)胞液滴加到多孔玻璃片上進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述離心的轉(zhuǎn)速為2500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，所述離心的時(shí)間為30-90分鐘，所述離心的溫度為25-37°C。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括狗腎細(xì)胞、原代恒河猴腎細(xì)胞、正常人胚肺成纖維細(xì)胞株、人鼻咽癌細(xì)胞株、人肺腺癌細(xì)胞株、恒河猴腎細(xì)胞株、非洲綠猴腎上皮細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞、呼吸道病毒檢測(cè)混合細(xì)胞、橫紋肌肉瘤細(xì)胞和以上述細(xì)胞為基礎(chǔ)作基因改造后的敏感細(xì)胞中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述多孔玻璃片包括玻璃片和帶孔的膠片，所述帶孔的膠片與所述玻璃片緊密相連。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述免疫熒光檢測(cè)所需要的熒光標(biāo)記抗體的用量為8-10iU。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述病毒為DNA病毒。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述病毒為RNA病毒。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，其特征在于，所述病毒包括副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、冠狀病毒、腸道病毒和皰疹病毒中的至少一種。9.權(quán)利要求l-8之一所述的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法在病毒鑒定方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定的方法，在培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，將待培養(yǎng)鑒定的標(biāo)本接種到所述細(xì)胞后離心，然后進(jìn)行培養(yǎng)，最后將培養(yǎng)所得的待鑒定細(xì)胞液滴加到多孔玻璃片上進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。離心的轉(zhuǎn)速為2500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30-90分鐘，溫度為25-37℃。多孔玻璃片包括玻璃片和帶孔的膠片，帶孔的膠片與所述玻璃片緊密相連。本發(fā)明的高通量病毒快速培養(yǎng)鑒定法檢測(cè)通量高，標(biāo)本處理時(shí)間減少，病毒培養(yǎng)時(shí)間縮短，檢測(cè)敏感性增加，病毒試劑用量少，可以廣泛應(yīng)用于臨床病毒實(shí)驗(yàn)室、公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)相關(guān)標(biāo)本的病毒分離培養(yǎng)以及鑒定。文檔編號(hào)C12N7/00GK101693887SQ20091019318公開日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月20日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者關(guān)文達(dá),占揚(yáng)清,招穗珊,楊子峰,王玉濤,秦笙,莫自耀,鐘南山,黃群娣申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;