專利名稱：病原體高通量檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用涉及的是一種多種病原體和耐藥基因的高通量檢測(cè)基因芯片及應(yīng)用?；蛐酒鞣N基因探針174條，包括鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、土拉弗朗西斯菌、志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、霍亂弧菌共8類病原體種類特異性基因探針32條；白喉毒素、志賀毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破傷風(fēng)毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素共7類毒素基因探針25條；超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環(huán)素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關(guān)基因、大環(huán)內(nèi)酯類外排基因、耐萬(wàn)古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、常用基因工程載體耐藥基因等17大類耐藥基因探針117條?？捎糜诙喾N病原體種類特異基因、毒素基因及耐藥基因的檢測(cè)。本發(fā)明涉及的技術(shù)領(lǐng)域是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和基因芯片技術(shù)。
背景技術(shù)：
在各種可導(dǎo)致人類疾病的病原微生物中，病原細(xì)菌引起的傳染病不僅在發(fā)病率方面居首位，同時(shí)也是造成人類死亡的重要原因。據(jù)報(bào)道，在任何時(shí)刻，估計(jì)世界各地有超過(guò)140 萬(wàn)人患醫(yī)院感染，且漏報(bào)率很高，給臨床治療造成很大困難，也構(gòu)成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給人民生命財(cái)產(chǎn)安全造成巨大的損失。隨著不同病原體的藥物的合成與大量使用，基因工程技術(shù)的進(jìn)步使各種人造耐藥菌成為可能。且隨著環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，一些以前從未見(jiàn)過(guò)的疾病，又給人類帶來(lái)了新的威脅?？焖佟?zhǔn)確、靈敏、特異地對(duì)病原體作出診斷，是有效預(yù)防感染性疾病發(fā)生和控制其迅速傳播的前提和關(guān)鍵。目前，大多數(shù)衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的涉及培養(yǎng)、分離等的傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)， 操作繁瑣，在臨床上難以及早進(jìn)行病原學(xué)診斷和耐藥性測(cè)定，無(wú)法滿足臨床救治危重感染者的需要。比如細(xì)菌的培養(yǎng)，根據(jù)不同的病原菌類型需要從1 到數(shù)天不等，對(duì)于個(gè)別細(xì)菌 (如結(jié)核分枝桿菌)需要更長(zhǎng)的時(shí)間，甚至需要專門的實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)條件。PCR、分子雜交技術(shù)和免疫測(cè)定等方法雖然能夠節(jié)省檢測(cè)的時(shí)間，有較好的特異性和靈敏度，但每次只能檢測(cè)一種或少量的幾種病原菌，要對(duì)眾多樣本進(jìn)行檢測(cè)需要做大量的工作，甚至難以實(shí)現(xiàn)。基因芯片技術(shù)(Gene chip)于上世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)，是將多種寡核苷酸分子固定于固相載體上形成DNA微陣列，將樣品核酸用同位素和熒光等方法標(biāo)記，與芯片探針雜交檢測(cè)樣本內(nèi)的多種特異DNA序列，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析，迅速得到獲得樣品中大量基因序列特征或基因表達(dá)特征信息?；蛐酒瑸楦腥拘约膊〉呐R床診斷提供了有力的工具，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比有多種優(yōu)點(diǎn)能同時(shí)進(jìn)行高通量分析；無(wú)需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能早期檢測(cè)診斷；對(duì)檢測(cè)樣品需要量少，效率高；可用于大規(guī)模的病原體分類鑒定，毒素因子及耐藥性檢測(cè)等。因此，基因芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已有了廣泛的應(yīng)用。多種病原微生物的基因組序列已被闡明，各種各樣的微生物基因被克隆、測(cè)序，為建立病原體高通量檢測(cè)基因芯片奠定了基礎(chǔ)。研制病原體高通量檢測(cè)基因芯片，能快速鑒定病原體的種類，致病性及抗藥性，為臨床正確選用藥物提供依據(jù)，對(duì)預(yù)防和控制病原菌感染和傳播有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)上述不足，提供一種病原體高通量檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用，制備一種能同時(shí)高通量檢測(cè)多種病原體種類特異基因、毒素基因及耐藥基因的基因芯片，可對(duì)多種病原體進(jìn)行高通量快速檢測(cè)。該基因芯片包含各種基因探針174條，其中鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、 土拉弗朗西斯菌、志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、霍亂弧菌共8類病原體種類特異性基因探針32條；白喉毒素、志賀毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破傷風(fēng)毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素7類毒素基因探針25條；超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環(huán)素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關(guān)基因、大環(huán)內(nèi)酯類外排基因、耐萬(wàn)古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、 磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、常用基因工程載體耐藥基因等17大類耐藥基因探針117條。上述探針是參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的各類已發(fā)表病原微生物基因序列，依據(jù)基因探針設(shè)計(jì)原則篩選獲得。該基因芯片可用于多種病原體檢測(cè)、鑒定、合理用藥、感染病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。病原體高通量檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
病原體高通量檢測(cè)基因芯片包括(1)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的寡核苷酸探針共174條，和質(zhì)量控制探針2條；(2)寡核苷酸探針通過(guò)手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；
所述的寡核苷酸探針是指化學(xué)合成的多種基因序列的高度保守區(qū)的互補(bǔ)寡聚核苷酸， 長(zhǎng)度為十到五十個(gè)堿基；
所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片是指能檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的寡核苷酸陣列，8類病原體種類特異性基因包括鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、土拉弗朗西斯菌、志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、霍亂弧菌；7類毒素基因白喉毒素、志賀毒素、肉毒毒素、 篦麻毒素、破傷風(fēng)毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素；17大類耐藥基因包括超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環(huán)素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關(guān)基因、大環(huán)內(nèi)酯類外排基因、耐萬(wàn)古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、常用基因工程載體耐藥基因；
所述的質(zhì)量控制探針至少包括兩種探針，即陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染，陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交的和準(zhǔn)確定位； 所述的手臂分子指具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物；
所述寡核苷酸固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團(tuán)，固化在載體材料基質(zhì)表面時(shí)與表面修飾的手臂分子的末端基團(tuán)形成共價(jià)鍵；
所述的174條基因探針，其中探針的任何組合，用于基因芯片等的制備，固相載體材料包括但不僅限于玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等。所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片，用于病原體檢測(cè)、鑒定、合理用藥、感染病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。這些探針的固相載體材料包括多種方法處理的玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜和其它高分子聚合物制成的膜及片等。這些固相載體表面以具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物進(jìn)行修飾，常用的有戊二醛、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、N, N- 二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚賴氨酸，可采用其中的一種或其中的兩種的組合。病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條基因探針選擇及設(shè)計(jì)原則
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中各類已發(fā)表病原微生物基因序列，選擇探針長(zhǎng)度在40 50nt，5’ 末端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基T。其它參數(shù)如退火溫度Tm和GC%含量等按照設(shè)計(jì)原則進(jìn)行嚴(yán)格控制。每種探針均經(jīng)兩種以上生物學(xué)軟件篩選，再以人工選定和調(diào)整，Blast 驗(yàn)證，最終選擇具有各類病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因代表性的序列作為檢測(cè)探針。探針設(shè)計(jì)的原則如下 (1)高度的特異性和敏感性
篩選出的探針應(yīng)該位于基因序列的高保守區(qū)，以保證探針的特異性和敏感性；同時(shí)，篩選的探針應(yīng)該于人基因組序列、其他細(xì)菌和微生物、相關(guān)動(dòng)物的基因組序列、環(huán)境中常見(jiàn)植物基因序列盡可能同源性低，以避免假陽(yáng)性結(jié)果。尋找和篩選出高度特異性探針是至關(guān)重要的。(2)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因探針的Tm值盡可能一致
因?yàn)樵谝粡埿酒峭瑫r(shí)進(jìn)行多條探針的雜交反應(yīng)，在一定溫度下，此時(shí)各探針Tm值至關(guān)重要，如果Tm值不一致，差距過(guò)大，雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)弱會(huì)受到相當(dāng)?shù)挠绊?。一般Tm 值相差小于三度比較適宜。(3)各種探針有近似的堿基長(zhǎng)度
芯片探針的長(zhǎng)度，對(duì)檢測(cè)的敏感性和特異性有一定的影響。各探針堿基長(zhǎng)度一致，在一定程度上可消除雜交后芯片掃描儀掃描焦距定位所帶來(lái)的差異，我們?cè)O(shè)計(jì)的探針堿基數(shù)目在 40 50nt。(4)篩選的探針盡可能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)
探針應(yīng)該最好沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，自身二聚體，錯(cuò)配等。否則容易形成錯(cuò)誤結(jié)果。(5)避免選取G、C富集區(qū)域的序列做探針
(6)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因探針的互補(bǔ)序列之間不形成二聚體和錯(cuò)配
探針篩選的方法
登陸美國(guó)生物技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 主頁(yè)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索了病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的序列，比較同一類別基因序列有無(wú)存在變異情況，根據(jù)上述探針設(shè)計(jì)原則，用I^rimer Primers5.0, 01igo6. 0等生物學(xué)軟件在基因的堿基對(duì)齊圖上找出所有可能的探針，結(jié)合Clustal W等同源性分析軟件找處特定基因靶基因DNA序列的高度保守區(qū)，選擇核酸序列的Blast，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)類似檢索(同時(shí)檢索GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù))，篩選的探針于已知人類基因組序列，其它常見(jiàn)細(xì)菌和微生物、相關(guān)動(dòng)物的基因組序列、環(huán)境中常見(jiàn)植物基因序列盡可能同源性低，堿基數(shù)40 50nt左右，Tm值平均83 84°C之間，G+C含量約為50%，根據(jù)Blast 結(jié)果，再結(jié)合需求和經(jīng)驗(yàn)，手工對(duì)篩出的探針進(jìn)行微調(diào)和整修。然后對(duì)得到的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因探針用RNA Structure軟件進(jìn)行分析，以排除不同探針互補(bǔ)序列間形成影響和干擾雜交的二級(jí)結(jié)構(gòu)。陽(yáng)性內(nèi)參照探針采用的是與病原體微生物基因無(wú)同源性的植物基因序列片段。在后面實(shí)際的芯片雜交檢測(cè)中，根據(jù)總體的需要和檢測(cè)的結(jié)果，調(diào)整了部分使用的探針。設(shè)計(jì)篩選的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條基因探針?biāo)龅臋z測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸基因探針
如下
病原體微生物的種類檢測(cè)鑒定選擇兩組探針，一組檢測(cè)特異性結(jié)構(gòu)基因保守序列，另一組檢測(cè)關(guān)鍵性毒素基因。每組探針正、負(fù)鏈探針各一條。鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌根據(jù)鼻疽假單胞菌和類鼻疽假單胞菌的基因序列選擇結(jié)構(gòu)保守序列16S rDNA和毒素基因flagellin C設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
16S rDNA 正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG 16S rDNA 負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATG flagellin C基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAA CCTCA
flagellin C基因負(fù)鏈探針5，-NH2_T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGA
GATC
布魯氏菌選擇有1430個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)基因16S ribosomal特異序列和布魯氏菌熱休克蛋白31KD基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
16S ribosomal 正鏈探針 5，-NH2-T (10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGA
AT
16S ribosomal 負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTT
GCTC
3IKD 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG 3IKD 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG 沙門氏菌的hilA基因編碼侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白，是inv基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。 沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion protein, inv)與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由 invA, invB. invC. invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒素因子，序列保守，選擇這兩種基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
hilA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCA hilA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAAT invA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTT
TTCA
invA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC 鼠疫耶爾森菌的3a是一段特異的染色體序列，相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示這段序列可作為鼠疫PCR 檢測(cè)的良好靶序列，探針設(shè)計(jì)參照Radnedge等報(bào)道的3a序列設(shè)計(jì)。另選擇質(zhì)粒上的毒素因子莢膜蛋白基因cafl設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針 3a 序列正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC 3a 序列負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCT cafl 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCAC
A
cafl 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC 炭疽芽孢桿菌的毒素除決定于染色體基因外，還與毒素質(zhì)粒(P)COl )和莢膜質(zhì)粒 (PX02)這兩個(gè)編碼質(zhì)粒的致病因子有關(guān)。pXOl由三個(gè)部分組成水腫因子(EF)、保護(hù)性抗原(PA)和致死因子(LF)。pX02含CapB，CapC和CapA，編碼莢膜蛋白，為正常毒素所必須。 根據(jù)PXOl的水腫因子(EF)和pX02設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
EF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTG EF基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGAT
CA
pX02基因正鏈探針5，-NH2-T (10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCG
TCCA
pX02 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG 土拉弗朗西斯菌探針根據(jù)Francisella 23kDa結(jié)構(gòu)蛋白和外膜蛋白R(shí))pA基因設(shè)計(jì)，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
Francisella 2!3kDa基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCA GTATGTTGCGC
Francisella 23kDa 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTC TTGTTATCATCTCACTC
FopA基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTA
T
FopA基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAAT
AT
志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，以質(zhì)粒和基因組中都存在的序列-侵襲性質(zhì)粒相關(guān)抗原(invasion plasmid antigen, ipa)的片段H為模板，存在多拷貝，易于檢測(cè)。志賀氏菌中侵襲性相關(guān)基因ipaBCD是重要組成成分之一，為志賀菌侵入上皮細(xì)胞所必需的， ipaB — ipaC形成復(fù)合物，針對(duì)ipaC設(shè)計(jì)探針。每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
ipaH 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATAC ipaH基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T (10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAA
T
ipaC基因正鏈探針5，-NH2-T (10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGG ipaC 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA 編碼霍亂弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被認(rèn)為是霍亂弧菌的標(biāo)志基因，編碼霍亂毒素A 亞單位(CtxA基因)是霍亂腸毒素的活性部分。根據(jù)這兩個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
ompW基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTC
GCTC
ompW基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTC CtxA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTC CtxA基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCC
T
七種毒素序列檢測(cè)選擇毒素的生物活性部分的探針。
白喉毒素免疫毒素的細(xì)胞毒性源自DT的酶活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，即N端389個(gè)氨基酸。其前193個(gè)氨基酸為白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)A片段(DTA)是白喉毒素的酶活性區(qū)，也是DT類免疫毒素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
DTA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA DTA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT 在引起細(xì)菌性痢疾的志賀菌屬中，以I型痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹瀉最為嚴(yán)重，主要原因是它能產(chǎn)生一種高水平的外毒素一志賀毒素(Shiga Toxin, ShT)。ShT具有腸毒性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性等3種生物活性，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
ShT 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGG ShT基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT 肉毒毒素是已知最劇烈的毒物，有嗜神經(jīng)毒性，可以分為A、B、Cl、C2、D、E、F、G、H八個(gè)型，各型毒素藥理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和。選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共8條
1、Clostridiumbotulinum neurotoxin BoNT gene
BoNT基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCA
GGCA
BoNT基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGT
CCA
2、thegene of botulinum type B toxin.
B 型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAA B型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTT
TCA
3、Clostridiumbotulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin type
E型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGG
CAA
E型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT
4、Clostridiumbotulinum neurotoxin type F gene
F型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGA F型基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T (10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTCC
篦麻毒素Ricin是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B兩條肽組成的異二聚體。A鏈(RTA)分子量為30 (或32) KDa，是一種糖苷酶；B鏈(RTB)的分子量為32 KDa0 Ricin屬核糖體失活蛋白，是一種細(xì)胞毒素，必須進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮毒性。根據(jù)A鏈設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
RTA 基因正鏈探針5' -NH2-T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCG RTA基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTA
G
破傷風(fēng)毒素(Tetanus toxin)是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，由破傷風(fēng)梭菌(Clostridium Tetani )產(chǎn)生，可被蛋白酶切成兩條輕鏈)和一條重鏈。重鏈有與受體結(jié)合的功能而無(wú)毒性作用。毒素由一個(gè)751Λ大質(zhì)粒上一段核昔酸編碼，編碼基因長(zhǎng)約41Λ，為一大的開(kāi)放讀碼框架，該基因分為A、B、C 3個(gè)片段，A片段編碼毒性蛋白，B片段編碼穿膜蛋白，C片段編碼結(jié)合蛋白?；蚬こ套鲆呙缫话憧寺〉氖菬o(wú)神經(jīng)毒性的C片段，針對(duì)發(fā)揮毒性作用的輕鏈 281 - 1651序列設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
正鏈探針5，-NH2-T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC 負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT 產(chǎn)腸毒素性葡萄球菌具有多種毒素致病因子，其中最主要的是它所產(chǎn)生的A，B，C1，C2， C3，D和E七型熱穩(wěn)定性腸毒素(staphy-lococcal enterotoxin, SE)，可引起人畜發(fā)生食物中毒，也能成為生物戰(zhàn)毒劑的毒素。選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條或通用探針，共9條
USECU SEC2、SEC3,以 SEC2 序列為參考
SEC2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACC SEC2基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTAT TCCTCCA
2、SEB
SEB基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGA
A
SEB基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTC
T
3、SED
SED基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATT
TGC
SED基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACC ACCAT
4、SEA禾口 SEE
SEA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAAC
A
SEE基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAG
CCSEA, SEE 基因通用負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGT TGTCAACGT
霍亂毒素見(jiàn)微生物霍亂弧菌檢測(cè)部分。耐藥基因數(shù)目、分類復(fù)雜，部分序列變異而成為亞類的多見(jiàn)。因此在充分的同源性比較及分析的基礎(chǔ)上，盡可能采取通用探針檢測(cè)。在用通用性探針覆蓋更多的耐藥基因的情況下，同時(shí)重點(diǎn)對(duì)主要的，危害大的，易造成流行和對(duì)多藥耐藥而難以控制的，能做成生物戰(zhàn)劑的一系列耐藥基因進(jìn)行全面檢測(cè)。整合酶類基因探針選自I類整合酶基因(IntIl)和II類整合酶基因(IntI2)，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
intll 基因正鏈探針 5' -NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAG TAGC-3'
intll 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGC
G-3'
intI2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCT
G-3'
intI2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGC TG-3'
四環(huán)素家族耐藥基因探針選擇tetM基因，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，Tet(M)是研究得最多的核糖體保護(hù)蛋白，具有核糖體依賴的GTP水解酶活性，共2條探針
tetM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGAC
A-3，
tetM 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCA
A-3，
氨基糖甙類藥物耐藥基因探針，選取了易于傳播并且危害較大的氨基糖甙類修飾酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6，)-I、aac (6，) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9種，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共18條探針
aac (3)-I 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACG ATC-3'
aac (3)-I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCA GG-3，
aac (3)-II 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGC CAT-3，
aac (3)-II 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTT TCC-3'
aac (3)-111 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATG CTTG-3，
aac (3)-111 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAA GC-3'
aac (3) -IV 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3，
aac (3) -IV 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCG
G-3，
aac (6') - 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTT TAGCG-3'
aac (6') - 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCT TCCC-3'
aac (6，)-II基因正鏈探針5，-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATA GACC-3'
aac (6，)-II基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTT CGTC-3'
aphA6 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAG AGCCA-3'
aphA6 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTAT TTGGC-3，
ant ( 3，)-I 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTA AATG-3'
ant ( 3' )-1 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCT ACAG-3，
ant (2'，) -I 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCT CACTC-3，
ant (2'，) -I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCC CAGC-3'
耐消毒劑qacA/B家族基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 qacA/B 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTC GAA-3，
qacA/B 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGT CC-3'
紅霉素耐藥相關(guān)基因探針，已發(fā)現(xiàn)Erm基因家族有20余種基因亞型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型為主，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針
ErmA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3' ErmA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGA TTC-3，
ErmB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCT
T-3'
ErmC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCT CATTG
GC-3'ErmC 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCA TGTTC-3，
大環(huán)內(nèi)酯類外排(mefA)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 mefA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAG AA-3，
mefA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTA
A-3，
耐萬(wàn)古霉素耐藥基因探針，選用了由不同的耐藥基因簇編碼的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6種表型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共12條探針
VanA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGG
T-3'
VanA 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGG
A-3，
VanB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATA
T-3'
VanB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCG
A-3，
VanCl 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCT
G-3，
VanCl 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGG AGC-3，
VanC2 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATC
C-3'
VanC2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAG
A-3，
VanD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTT
C-3'
VanE 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGA
G-3，
VanE 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCC CTA-3，
多藥耐藥外排泵基因探針，選擇包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針
AcrAB-TolC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAA GCGT-3'
AcrAB-TolC 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAG ACGC-3'
OprM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3'
OprM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGT
T-3'
Sme DEF 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAA
G-3'
耐莫匹羅星(ileS)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 iIeS 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCC
A-3，
ileS 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAG AGC-3，
磺胺類耐藥基因探針，選擇了 dfrA和dfrD兩型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共 4條探針
dfrA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAA GCT-3，
dfrA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATG CTTT-3，
dfrD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGAC ATTC-3，
dfrD 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCA TGTCCT-3'
泰洛星(tlrB)耐藥基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
tlrB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGT
C-3'
tlrB 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹諾酮類(norA)藥物耐藥基因探針，norA基因介導(dǎo)的耐藥在金葡菌中相當(dāng)常見(jiàn)，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
norA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTG AA-3，
norA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATG
G-3'
β內(nèi)酰胺酶類(BLA)耐藥基因探針，劃分為超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黃色葡萄球菌(MRSA)金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因。 其中超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因，按不同編碼基因同源性分為TEM型、 SHV型、CTX-M型(由于各亞型間⑶S核酸基因序列差異較大，根據(jù)其序列的同源性分3組)， PER型和VEB型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共14條探針
TEM 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3' TEM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTA
A-3，SHV 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAAT
A-3，
CTX-Ml 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCAT
C-3'
CTX-M2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAA CA-3，
CTX-M2 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTA
T-3'
CTX-M3 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAAT
C-3'
CTX-M3 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTAC
T-3'
PER 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGAC
G-3'
PER 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCG
G-3'
VEB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTA AA-3，
VEB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTG CT-3，
頭孢菌素酶(AmpC)耐藥基因探針?lè)譃?組，幾乎涵蓋了所有的質(zhì)粒AmpC基因序列，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各六條，共12條探針
AmpC 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCG
C-3'
AmpC 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3， AmpC 基因負(fù)鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAA TAAA-3'
AmpC 基因正鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTT
A-3，
AmpC 基因負(fù)鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACC GATA-3'
AmpC 基因正鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3， AmpC 基因負(fù)鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCA AAC-3，AmpC 基因正鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATA AGCC-3'
AmpC 基因負(fù)鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCA GCAC-3，
碳青霉烯酶耐藥基因探針，選取了常見(jiàn)的基因型IMPl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共11條探針
IMP 基因通用正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTT GGTTTG
TGG-3'
IMPl 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAA
T-3'
IMPl 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAA
C-3'
0XA23 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAG
C-3'
0XA23 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGG TTT-3，
0XA24 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGG
T-3'
0XA24 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCC AC-3'
VIM 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3' GES2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTA
C-3'
GES2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAG
G-3，
MRSA金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因探針，選取正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
mecA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTG
G-3，
mecA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATC TAACT-3，
常用基因工程載體耐藥基因探針，包括氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(Cat)基因、博萊霉素( Zeocin )基因、殺稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨芐霉素(Amp)基因和四環(huán)素(Tet)基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針至少各一條，共16條探針
Cat 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTT
C-3'
Cat 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'
Zeocin 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACT
T-3'
Zeocin 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAG
A-3，
Bsr 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCC
T-3'
Puromycin 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGT
T-3'
Kana 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGA
G-3，
Kana 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3' Tet 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3' Amp 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3' 本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，所述的174條基因探針，其中探針的任何組合，用于基因芯片等的制備。所述的固相載體材料選用但不僅限于玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等中的一種或多種。本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、 毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，用于多種病原體檢測(cè)、鑒定、合理用藥、感染病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片的制作
選擇載玻片為芯片的載體，玻片購(gòu)自Fisher kientific公司，用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜， 然后用雙蒸水清洗，在浸入25%的氨水中過(guò)夜，用雙蒸水清洗。晾干后浸入含有氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇(pH4. 5)中20min，再用95%乙醇超聲清洗，換蒸餾水超聲清洗，115°C 烘干。將已硅烷化的玻片浸泡在5%的戊二醛溶液中50min，超聲lOmin，水洗兩次，晾干備用。篩選出的基因探針由商業(yè)公司進(jìn)行化學(xué)合成。將合成的探針在96孔板中用 3父55(溶解，用0111丨81~即11虹 MiniArrayer點(diǎn)樣儀MCP360點(diǎn)樣針，按設(shè)計(jì)的方案點(diǎn)樣。 將病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條探針，1條空白對(duì)照探針，1條陽(yáng)性內(nèi)參探針設(shè)計(jì)形成一個(gè)點(diǎn)樣陣列，每條探針重復(fù)4次，在陣列的右側(cè)和下側(cè)對(duì)應(yīng)檢測(cè)探針?lè)謩e點(diǎn)上陽(yáng)性內(nèi)參探針，陽(yáng)性參照同時(shí)起到定位作用，空白對(duì)照監(jiān)控芯片本底信噪比。點(diǎn)樣完畢，37 °C水化池，4 V保存?zhèn)溆?。為了封閉玻片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基，按照以下程序?qū)ΣＦM(jìn)行處理0. 2% SDS洗兩次，每次5min ；雙蒸水洗兩次，每次5min ；將玻片放入封閉(還原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；雙蒸水洗兩次，每次Imin ；玻片自然干燥，即可投入使用。樣本核酸的提取及標(biāo)記
我們收集樣本，測(cè)試并比較優(yōu)化了被檢樣本的處理方法，建立了快速抽提高質(zhì)量的各類病原菌的全基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。相同的樣本盡量采取相同的處理方法。對(duì)于提取的細(xì)菌DNA用全基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增，隨機(jī)引物法熒光標(biāo)記，用6mer的隨機(jī)引物與變性雙鏈DNA隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合(退火)，以提供3’羥基端。接著在無(wú)5’ 一3，外切酶活性的 Klenow片段的作用下，在引物的3’羥基末端逐個(gè)加上含有Cy3標(biāo)記的核苷酸，逐步形成標(biāo)記的DNA。基因芯片的檢測(cè)及分析
將熒光標(biāo)記的目標(biāo)DNA與含陽(yáng)參的雜交液1 :1充分混勻，98°C變性5min冰浴。取出點(diǎn)在探針陣列區(qū)域，蓋上大小合適的經(jīng)硅烷化的蓋玻片，將芯片放入雜交盒，盒內(nèi)有適當(dāng)?shù)?XSSC以保持濕度，42°C雜交4小時(shí)。取出芯片，依次用42°C預(yù)熱的雜交洗液 I >11 >111 (0. 2\530各洗5!^11，最后用ddH20洗aiiin，自然晾干，以上過(guò)程均要求避光。用 LuxScan 10K Version3. 0微陣列芯片掃描儀掃描及圖像分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片未見(jiàn)有特異性的交叉反應(yīng)，并能夠區(qū)分不同的病原體及內(nèi)在生物特征。對(duì)多份樣品進(jìn)行檢測(cè)，均現(xiàn)實(shí)了較好的特異性和敏感性。全基因組擴(kuò)增技術(shù)是一種簡(jiǎn)單的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不需要使用熱循環(huán)器，它能高度忠實(shí)的復(fù)制整個(gè)基因組DNA，擴(kuò)增出1(Γ100 1Λ大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列，為芯片標(biāo)記雜交提供足夠的核酸量，實(shí)際上該技術(shù)是用基因芯片對(duì)細(xì)菌的全部基因組進(jìn)行掃描檢測(cè)。Klenow fragment隨機(jī)引物標(biāo)記法則以其3’ 一5’ 外切酶活性保證了其合成DNA時(shí)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)
(1)高特異性芯片檢測(cè)的特異性是經(jīng)過(guò)雙重篩選的；
(2)高通量對(duì)多個(gè)基因的高通量平行檢測(cè)，可同時(shí)確定病原體種類、致病基因和耐藥基因；
(3)檢測(cè)時(shí)間短，耗樣量少，反應(yīng)體積??；
(4)可根據(jù)實(shí)際需要任意組合探針；
(5)易于自動(dòng)化及檢測(cè)。


以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明 圖1是本發(fā)明整個(gè)芯片制作和檢測(cè)過(guò)程。圖2是本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片探針點(diǎn)樣陣列示意圖。圖3是本發(fā)明重組抗性基因芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中A、B、C和D所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌濃度分別為IO4個(gè)菌/ml、IO3個(gè)菌/ml、5X IO2個(gè)菌/ml和IO2個(gè)菌/ml。
圖4是本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片對(duì)四種微生物的檢測(cè)結(jié)果，其中A、B、C 和D所對(duì)應(yīng)的是霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌和葡萄球菌。圖5是本發(fā)明本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片對(duì)五種抗藥性基因耐藥菌株的檢測(cè)結(jié)果，其中1、2、3和4所對(duì)應(yīng)的是含卡那霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α、含氯霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α、含博萊霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α和含四環(huán)素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α。
具體實(shí)施例方式參照附圖1 5，本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片包括(1)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸探針組合和質(zhì)量控制探針；(2)寡核苷酸探針通過(guò)手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；
所述的寡核苷酸探針是指化學(xué)合成的多種耐藥基因序列的高度保守區(qū)的互補(bǔ)寡聚核苷酸，長(zhǎng)度為十到五十個(gè)堿基；
所述的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片是指能檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的寡核苷酸陣列，8類病原體種類特異性基因包括鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、土拉弗朗西斯菌、志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、霍亂弧菌；7類毒素基因白喉毒素、志賀毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破傷風(fēng)毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素；17大類耐藥基因包括超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環(huán)素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關(guān)基因、大環(huán)內(nèi)酯類外排基因、耐萬(wàn)古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、常用基因工程載體耐藥基因；
所述的質(zhì)量控制探針至少包括兩種探針，即陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染，陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交的和準(zhǔn)確定位； 所述的手臂分子指具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物；
所述寡核苷酸固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團(tuán)，固化在載體材料基質(zhì)表面時(shí)與表面修飾的手臂分子的末端基團(tuán)形成共價(jià)鍵；
所述的檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸基因探針如下
病原體微生物的種類檢測(cè)鑒定選擇兩組探針(每組正、負(fù)鏈)，一組檢測(cè)特異性結(jié)構(gòu)基因保守序列，另一組檢測(cè)關(guān)鍵性毒素基因。鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌根據(jù)鼻疽假單胞菌和類鼻疽假單胞菌的基因序列選擇結(jié)構(gòu)保守序列16S rDNA和毒素基因flagellin C設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
16S rDNA 正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG 16S rDNA 負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATG flagellin C基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAA CCTCA
flagellin C基因負(fù)鏈探針5，-NH2_T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGAGATC
布魯氏菌選擇有1430個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)基因16S ribosomal特異序列和布魯氏菌熱休克蛋白31KD基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
16S ribosomal 正鏈探針 5，-NH2_T(10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGA
AT
16S ribosomal 負(fù)鏈探針 5，-NH2_T(10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTT
GCTC
3IKD 基因正鏈探針 5’ -ΝΗ2-Τ (10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG 3IKD 基因負(fù)鏈探針 5’ -ΝΗ2-Τ (10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG 沙門氏菌的hilA基因編碼侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白，是inv基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。 沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion protein, inv)與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由 invA, invB. invC. invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒素因子，序列保守，選擇這兩種基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
hilA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCA hilA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAAT invA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTT
TTCA
invA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC 鼠疫耶爾森菌的3a是一段特異的染色體序列，相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示這段序列可作為鼠疫PCR 檢測(cè)的良好靶序列，探針設(shè)計(jì)參照Radnedge等報(bào)道的3a序列設(shè)計(jì)。另選擇質(zhì)粒上的毒素因子莢膜蛋白基因cafl設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針 3a 序列正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC 3a 序列負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCT cafl 基因正鏈探針5' -NH2-T (10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCAC
A
cafl 基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC 炭疽芽孢桿菌的毒素除決定于染色體基因外，還與毒素質(zhì)粒(P)COl )和莢膜質(zhì)粒 (PX02)這兩個(gè)編碼質(zhì)粒的致病因子有關(guān)。pXOl由三個(gè)部分組成水腫因子(EF)、保護(hù)性抗原(PA)和致死因子(LF)。pX02含CapB，CapC和CapA，編碼莢膜蛋白，為正常毒素所必須。 根據(jù)PXOl的水腫因子(EF)和pX02設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
EF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTG EF基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGAT
CA
pX02基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCG
TCCA
pX02 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG 土拉弗朗西斯菌探針根據(jù)Francisella 23kDa結(jié)構(gòu)蛋白和外膜蛋白R(shí))pA基因設(shè)計(jì)，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針Francisella 2!3kDa基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCA GTATGTTGCGC
Francisella 23kDa 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTC TTGTTATCATCTCACTC
FopA基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTA
T
FopA基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAAT
AT
志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，以質(zhì)粒和基因組中都存在的序列-侵襲性質(zhì)粒相關(guān)抗原(invasion plasmid antigen, ipa)的片段H為模板，存在多拷貝，易于檢測(cè)。志賀氏菌中侵襲性相關(guān)基因ipaBCD是重要組成成分之一，為志賀菌侵入上皮細(xì)胞所必需的， ipaB — ipaC形成復(fù)合物，針對(duì)ipaC設(shè)計(jì)探針。每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
ipaH 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATAC ipaH基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T (10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAA
T
ipaC基因正鏈探針5，-NH2-T (10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGG ipaC 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA 編碼霍亂弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被認(rèn)為是霍亂弧菌的標(biāo)志基因，編碼霍亂毒素A 亞單位(CtxA基因)是霍亂腸毒素的活性部分。根據(jù)這兩個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
ompW基因正鏈探針5' -NH2-T (10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTC
GCTC
ompW基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTC CtxA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTC CtxA基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T (10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCC
T
七種毒素序列檢測(cè)選擇毒素的生物活性部分的探針。
白喉毒素免疫毒素的細(xì)胞毒性源自DT的酶活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，即N端389個(gè)氨基酸。其前193個(gè)氨基酸為白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)A片段(DTA)是白喉毒素的酶活性區(qū)，也是DT類免疫毒素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
DTA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA DTA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT 在引起細(xì)菌性痢疾的志賀菌屬中，以I型痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹瀉最為嚴(yán)重，主要原因是它能產(chǎn)生一種高水平的外毒素一志賀毒素(Shiga Toxin, ShT)。ShT具有腸毒性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性等3種生物活性，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
ShT 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGGShT基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT 肉毒毒素是已知最劇烈的毒物，有嗜神經(jīng)毒性，可以分為A、B、Cl、C2、D、E、F、G、H八個(gè)型，各型毒素藥理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和。選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共8條
1、Clostridiumbotulinum neurotoxin BoNT gene
BoNT基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCA
GGCA
BoNT基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGT
CCA
2、thegene of botulinum type B toxin.
B 型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAA B型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTT
TCA
3、Clostridiumbotulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin type
E型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGG
CAA
E型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT
4、Clostridiumbotulinum neurotoxin type F gene
F型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGA F型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTC
C
篦麻毒素Ricin是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B兩條肽組成的異二聚體。A鏈(RTA)分子量為30 (或32) KDa，是一種糖苷酶；B鏈(RTB)的分子量為32 KDa0 Ricin屬核糖體失活蛋白，是一種細(xì)胞毒素，必須進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮毒性。根據(jù)A鏈設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
RTA 基因正鏈探針5' -NH2-T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCG RTA基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTA
G
破傷風(fēng)毒素(Tetanus toxin)是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，由破傷風(fēng)梭菌(Clostridium Tetani )產(chǎn)生，可被蛋白酶切成兩條輕鏈)和一條重鏈。重鏈有與受體結(jié)合的功能而無(wú)毒性作用。毒素由一個(gè)751Λ大質(zhì)粒上一段核昔酸編碼，編碼基因長(zhǎng)約41Λ，為一大的開(kāi)放讀碼框架，該基因分為A、B、C 3個(gè)片段，A片段編碼毒性蛋白，B片段編碼穿膜蛋白，C片段編碼結(jié)合蛋白。基因工程做疫苗一般克隆的是無(wú)神經(jīng)毒性的C片段，針對(duì)發(fā)揮毒性作用的輕鏈 281 - 1651序列設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
正鏈探針5，-NH2-T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC 負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT 產(chǎn)腸毒素性葡萄球菌具有多種毒素致病因子，其中最主要的是它所產(chǎn)生的A，B，C1，C2， C3，D和E七型熱穩(wěn)定性腸毒素(staphy-lococcal enterotoxin, SE)，可引起人畜發(fā)生食物中毒，也能成為生物戰(zhàn)毒劑的毒素。選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條或通用探針，共9條
USECU SEC2、SEC3,以 SEC2 序列為參考
SEC2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACC SEC2基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTAT TCCTCCA
2、SEB
SEB基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGA
A
SEB基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTC
T
3、SED
SED基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATT
TGC
SED基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACC ACCAT
4、SEA禾口 SEE
SEA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAAC
A
SEE基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAG
CC
SEA, SEE 基因通用負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGT TGTCAACGT
霍亂毒素見(jiàn)微生物霍亂弧菌檢測(cè)部分。耐藥基因數(shù)目、分類復(fù)雜，部分序列變異而成為亞類的多見(jiàn)。因此在充分的同源性比較及分析的基礎(chǔ)上，盡可能采取通用探針檢測(cè)。在用通用性探針覆蓋更多的耐藥基因的情況下，同時(shí)重點(diǎn)對(duì)主要的，危害大的，易造成流行和對(duì)多藥耐藥而難以控制的，能做成生物戰(zhàn)劑的一系列耐藥基因進(jìn)行全面檢測(cè)。整合酶類基因探針選自I類整合酶基因(IntIl)和II類整合酶基因(IntI2)，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針
intll 基因正鏈探針 5' -NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAG TAGC-3'
intll 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGC
G-3，
intI2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCT
G-3，
intI2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGC TG-3，
四環(huán)素家族耐藥基因探針選擇tetM基因，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，Tet(M)是研究得最多的核糖體保護(hù)蛋白，具有核糖體依賴的GTP水解酶活性，共2條探針tetM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGAC
A-3，
tetM 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCA
A-3，
氨基糖甙類藥物耐藥基因探針，選取了易于傳播并且危害較大的氨基糖甙類修飾酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6’)-I、aac (6’) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9種，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共18條探針
aac (3)-I 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACG ATC-3'
aac (3)-I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCA GG-3，
aac (3)-II 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGC CAT-3，
aac (3)-II 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTT TCC-3'
aac (3)-111 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATG CTTG-3，
aac (3)-111 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAA GC-3'
aac (3) -IV 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGT CAT-3，
aac (3) -IV 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCG
G-3'
aac (6') - 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTT TAGCG-3'
aac (6') - 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCT TCCC-3'
aac (6，)-II基因正鏈探針5，-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATA GACC-3'
aac (6，)-II基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTT CGTC-3'
aphA6 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAG AGCCA-3'
aphA6 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTAT TTGGC-3，
ant ( 3，)-I 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTA AATG-3'
ant ( 3' )-1 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCT ACAG-3，ant (2’，) -I 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCT CACTC-3，
ant (2’，) -I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCC CAGC-3'
耐消毒劑qacA/B家族基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 qacA/B 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTC GAA-3，
qacA/B 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGT CC-3'
紅霉素耐藥相關(guān)基因探針，已發(fā)現(xiàn)Erm基因家族有20余種基因亞型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型為主，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針
ErmA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3' ErmA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGA TTC-3，
ErmB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCT
T-3'
ErmC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCT CATTG
GC-3'
ErmC 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCA TGTTC-3，
大環(huán)內(nèi)酯類外排(mefA)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 mefA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAG AA-3，
mefA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTA
A-3，
耐萬(wàn)古霉素耐藥基因探針，選用了由不同的耐藥基因簇編碼的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6種表型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共12條探針
VanA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGG
T-3'
VanA 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGG
A-3，
VanB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATA
T-3'
VanB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCG
A-3，
VanCl 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCT
G-3，VanCl 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGG AGC-3，
VanC2 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATC
C-3'
VanC2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAG
A-3，
VanD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTT
C-3'
VanE 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGA
G-3，
VanE 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCC CTA-3，
多藥耐藥外排泵基因探針，選擇包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針
AcrAB-TolC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAA GCGT-3'
AcrAB-TolC 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAG ACGC-3'
OprM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAG
G-3，
OprM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGT
T-3'
Sme DEF 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAA
G-3，
耐莫匹羅星(ileS)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 iIeS 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCC
A-3，
ileS 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAG AGC-3，
磺胺類耐藥基因探針，選擇了 dfrA和dfrD兩型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共 4條探針
dfrA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAA GCT-3，
dfrA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATG CTTT-3，
dfrD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGAC ATTC-3，dfrD 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCA TGTCCT-3’
泰洛星(tlrB)耐藥基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
tlrB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGT
C-3'
tlrB 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹諾酮類(norA)藥物耐藥基因探針，norA基因介導(dǎo)的耐藥在金葡菌中相當(dāng)常見(jiàn)，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
norA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTG AA-3，
norA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATG
G-3，
β內(nèi)酰胺酶類(BLA)耐藥基因探針，劃分為超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黃色葡萄球菌(MRSA)金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因。 其中超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因，按不同編碼基因同源性分為TEM型、 SHV型、CTX-M型(由于各亞型間⑶S核酸基因序列差異較大，根據(jù)其序列的同源性分3組)， PER型和VEB型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共14條探針
TEM 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3' TEM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTA
A-3，
SHV 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAAT
A-3，
CTX-Ml 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCAT
C-3'
CTX-M2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAA CA-3，
CTX-M2 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTA
T-3'
CTX-M3 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAAT
C-3'
CTX-M3 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTAC
T-3'
PER 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGAC
G-3，
PER 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCG
G-3，
VEB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3，
VEB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTG CT-3，
頭孢菌素酶(AmpC)耐藥基因探針?lè)譃?組，幾乎涵蓋了所有的質(zhì)粒AmpC基因序列，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各六條，共12條探針
AmpC 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCG
C-3'
AmpC 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3' AmpC 基因負(fù)鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAA TAAA-3'
AmpC 基因正鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTT
A-3，
AmpC 基因負(fù)鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACC GATA-3'
AmpC 基因正鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3， AmpC 基因負(fù)鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCA AAC-3，
AmpC 基因正鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATA AGCC-3'
AmpC 基因負(fù)鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCA GCAC-3，
碳青霉烯酶耐藥基因探針，選取了常見(jiàn)的基因型IMPl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共11條探針
IMP 基因通用正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTT GGTTTG
TGG-3'
IMPl 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAA
T-3'
IMPl 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAA
C-3'
0XA23 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAG
C-3'
0XA23 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGG TTT-3，
0XA24 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGG
T-3'0XA24 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCC AC-3'
VIM 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3' GES2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTA
C-3'
GES2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAG
G-3，
MRSA金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因探針，選取正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針
mecA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTG
G-3，
mecA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATC TAACT-3，
常用基因工程載體耐藥基因探針，包括氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(Cat)基因、博萊霉素( Zeocin )基因、殺稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨芐霉素(Amp)基因和四環(huán)素(Tet)基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針至少各一條，共16條探針
Cat 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTT
C-3'
Cat 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTT
T-3'
Zeocin 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACT
T-3'
Zeocin 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAG
A-3，
Bsr 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCC
T-3'
Puromycin 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGT
T-3'
Kana 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGA
G-3，
Kana 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3' Tet 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3'Amp 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3' 一種檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的檢測(cè)基因芯片，包括了全基因組DNA的提取和擴(kuò)增標(biāo)記；載體如玻片、硅片等；載體表面手臂分子的修飾；寡核苷酸探針(包括檢測(cè)寡核苷酸探針和質(zhì)量控制探針)及其固化；檢測(cè)和分析等。本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、 毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，所述的174條基因探針，其中探針的任何組合，用于基因芯片等的制備。所述的固相載體材料選用但不僅限于玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等中的一種或多種。本發(fā)明病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、 毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，用于多種病原體檢測(cè)、鑒定、合理用藥、感染病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。實(shí)施例一、病原體高通量檢測(cè)基因芯片檢測(cè)霍亂弧菌
霍亂是由01和0139血清群霍亂弧菌引起的急性腸道傳染病，以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征；0157:H7是新型的屬于可產(chǎn)生與志賀氏毒素極相似毒索的腸道致病菌。用合成的基因探針制備基因芯片，檢測(cè)含霍亂弧菌0157:H7。1.樣本核酸的提取及標(biāo)記
將細(xì)菌成倍稀釋成并測(cè)定其濃度分別為IO4個(gè)菌/ml、103個(gè)菌/ml、5X IO2個(gè)菌/ml、 IO2 個(gè)菌/ml，各取 200ul 用 Bacterial Genomic DNA Extraction kit 試劑盒，按說(shuō)明書要求提取DNA。取0. 6ul作為模板用于全基因組擴(kuò)增及klenow fragment隨機(jī)引物標(biāo)記后，反應(yīng)體系見(jiàn)下
全基因組DNA2μδ
隨機(jī)引物(2ηπιο1/μ1) 2μ1
加 ddH20 總體積至 l(^l，97°C，3min50s 后冰浴 3min。放置冰上，加入
IM Cy3 dCTP1. 5μ1
IOXdUTPs2. 5μ1
Klenow fragment Buffer2. 5M-I
ddH204. 5μ1
室溫放置2min
Klenow fragment4M-1
Total25μ1
室溫放置 5min 后，37°C反應(yīng) 2. 5h。補(bǔ)加 2μ1 klenow fragment，37°C反應(yīng) 2. 5h，65°C反應(yīng)5min。于-20°C保存。2.芯片的制備
選用經(jīng)硅烷化處理的玻片為芯片載體，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超聲清洗2次， 置干燥處備用。將合成的173條探針溶于3XSSC，根據(jù)圖2陣列進(jìn)行點(diǎn)樣，另設(shè)有陽(yáng)性內(nèi)參和空白對(duì)照探針。點(diǎn)樣后，水合作用37°C，2h。使用時(shí)，先用0.2% SDS洗兩次，每次5min;雙蒸水洗兩次，每次5min ；將玻片放入封閉(還原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；雙蒸水洗兩次，每次Imin ；玻片自然干燥待用。3.芯片的雜交檢測(cè)
取10μ1標(biāo)記的目標(biāo)DNA與10μ1雜交液(含陽(yáng)參)充分混勻，98°C變性5min冰浴， 點(diǎn)在探針陣列區(qū)域，42°C雜交4h。取出芯片，依次用42°C預(yù)熱的雜交洗液1、、111各洗5!11士11， 最后用ddH20洗2min，自然晾干(以上過(guò)程均要求避光)，用LuXScanTM10K Version3. 0微陣列芯片掃描儀掃描及圖像分析。整個(gè)芯片制作和檢測(cè)過(guò)程見(jiàn)圖1。4.檢測(cè)結(jié)果
從霍亂弧菌的雜交分析結(jié)果中(圖3)可以看出，2條霍亂弧菌外膜蛋白基因ompW探針和2條霍亂毒素CtxA基因探針，均產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，與其它探針無(wú)交叉信號(hào)產(chǎn)生。 結(jié)果當(dāng)細(xì)菌濃度為IO2個(gè)菌/ml時(shí)，2類霍亂弧菌特異探針的檢測(cè)信號(hào)仍然清晰可見(jiàn)，且對(duì)照探針無(wú)交叉信號(hào)，即芯片的檢測(cè)靈敏度為IO2個(gè)菌/ml。實(shí)施例二、病原體高通量檢測(cè)基因芯片同時(shí)檢測(cè)四種微生物
病原細(xì)菌引起的傳染病不僅在發(fā)病率方面居首位，同時(shí)也是造成人類死亡的重要原因。隨著新發(fā)傳染病病原體、重組病原體和未知病原體的不斷出現(xiàn)，給人類健康帶來(lái)重大的威脅?；蛐酒啾葌鹘y(tǒng)檢測(cè)方法在感染性疾病檢測(cè)中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)建立了病原體高通量檢測(cè)基因芯片，優(yōu)化確定芯片檢測(cè)條件，對(duì)霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌和葡萄球菌部分樣本進(jìn)行了檢測(cè)。1.芯片的制備
選用經(jīng)硅烷化處理的玻片為芯片載體，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超聲清洗2次， 置干燥處備用。合成的173條探針，在96孔板中用3XSSC溶解，濃度為40 pmol/μ 。用 Calligrapher MiniArrayer點(diǎn)樣儀MCP360點(diǎn)樣針，按設(shè)計(jì)的方案點(diǎn)(見(jiàn)圖2)，點(diǎn)樣完畢， 37°C水化2h，4°C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，先用0.2% SDS洗兩次，每次5min;雙蒸水洗兩次，每次5min ；將玻片放入封閉(還原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；雙蒸水洗兩次， 每次lmin;玻片自然干燥待用。2.核酸提取與標(biāo)記
對(duì)各菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，細(xì)菌全基因組DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit試劑盒和GenomiPhi DNA Amplification Kit試劑盒使用說(shuō)明中的操作規(guī)程進(jìn)行提取與擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)DNA的質(zhì)量和完整性。純化后的WGA產(chǎn)物50 ul, IOXBuffer 6ul, Sau3A I 酶 4ul，共 60ul 體系，37°C酶切 4h 以上。klenow fragment 隨機(jī)引物標(biāo)記法將Cy3 dCTP摻入DNA，反應(yīng)體系全基因組DNA 2μδ, random primer 2μ1，加 ddH20 至 10μ1，97 反應(yīng) 3min50s，冰浴 3min。放置冰上，加入 Cy3_dCTP 1. 5μ1, IOXdNTPs 2. 5μ1, Klenow fragment Buffer 2. 5μ1, Klenow fragment 4μ1，加 ddH20 至 25μ1。室溫靜置 5min，37°C反應(yīng) 2. 5h，加入 4μ1 klenow fragment，繼續(xù)反應(yīng) 2. 5h，65°C反應(yīng) 5min。于 _20°C 保存。3.雜交及芯片檢測(cè)
將熒光標(biāo)記的目標(biāo)DNA與雜交液(含陽(yáng)參)1 1充分混勻，98°C變性5min冰浴。 取出點(diǎn)在探針陣列區(qū)域，蓋上大小合適的經(jīng)硅烷化的蓋玻片，將芯片放入雜交盒(盒內(nèi)有適當(dāng)?shù)?XSSC以保持濕度)，42°C雜交4小時(shí)。取出芯片，依次用42°C預(yù)熱的雜交洗液I、II 、[II各洗5min，最后用ddH20洗2min，自然晾干(以上過(guò)程均要求避光)，用LuXScanTM10K VersioM.O微陣列芯片掃描儀掃描及圖像分析。整個(gè)芯片制作和檢測(cè)過(guò)程見(jiàn)圖1。4.檢測(cè)結(jié)果
從霍亂弧菌的雜交分析結(jié)果(圖4)中可以看出，2條霍亂弧菌外膜蛋白基因ompW探針和2條霍亂毒素CtxA基因探針，均產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，與其它探針無(wú)交叉信號(hào)產(chǎn)生。沙門氏菌的雜交結(jié)果(圖4)顯示，2條沙門氏菌主要侵襲蛋白基因irwA探針，2條沙門氏菌侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白hilA基因探針，均出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。志賀氏菌的雜交結(jié)果(圖4)中，6條特異探針包括2條志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌侵襲性質(zhì)粒相關(guān)抗原(invasion plasmid antigen, ipa)片段H基因探針，2條志賀菌屬侵襲性相關(guān)基因ipa C基因探針，2條志賀毒素(Shiga Toxin，ShT) A subimit基因探針均產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，其它探針無(wú)交叉信號(hào)產(chǎn)生。9條葡萄球菌腸毒素特異探針(2條葡萄球菌腸毒素C1、C2、C3組基因探針，2條葡萄球菌腸毒素SEB基因探針，2條葡萄球菌腸毒素SED基因探針，3條葡萄球菌腸毒素SEA、 SEE組)與葡萄球菌雜交結(jié)果也均產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，未出現(xiàn)與其它探針產(chǎn)生交叉信號(hào) (圖4)。說(shuō)明我們所設(shè)計(jì)的病原體種類特異性基因探針和毒素基因探針具有較好的特異性， 我們所摸索的樣品擴(kuò)增和標(biāo)記方法，可有效獲得待測(cè)病原體的基因。實(shí)施例三、病原體高通量檢測(cè)基因芯片同時(shí)檢測(cè)五種抗藥性基因耐藥菌株
近幾十年來(lái)，隨著廣譜抗生素在公共衛(wèi)生及畜牧業(yè)的廣泛不合理使用，可導(dǎo)致細(xì)菌嚴(yán)重耐藥，治療困難，病死率高?？焖?、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)耐藥基因是預(yù)防控制感染性疾病的關(guān)鍵所在。我們建立了細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)芯片，對(duì)含卡那霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5 α、含氯霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α、含博萊霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5a和含四環(huán)素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α部分樣本進(jìn)行了檢測(cè)比較。1.細(xì)菌全基因組提取與標(biāo)記
對(duì)各菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，細(xì)菌全基因組DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit試劑盒和GenomiPhi DNA Amplification Kit試劑盒使用說(shuō)明中的操作規(guī)程進(jìn)行提取與擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)DNA的質(zhì)量和完整性。純化后的WGA產(chǎn)物50 ul, IOXBuffer 6ul, Sau3A I 酶 4ul，共 60ul 體系，37°C酶切 4h 以上。klenow fragment 隨機(jī)引物標(biāo)記法將Cy3 dCTP摻入DNA，反應(yīng)體系全基因組DNA 2μδ, random primer 2μ1，加 ddH20 至 10μ1，97 反應(yīng) 3min50s，冰浴 3min。放置冰上，加入 Cy3_dCTP 1. 5μ1, IOXdNTPs 2. 5μ1, Klenow fragment Buffer 2. 5μ1,Klenow fragment 4μ1，力口 ddH20至 25μ1。室溫靜置 5min，37°C反應(yīng) 2. 5h，加入 4μ1 klenow fragment，繼續(xù)反應(yīng) 2. 5h，65°C反應(yīng) 5min。于 _20°C 保存。2.芯片的制備
選用經(jīng)硅烷化處理的玻片為芯片載體，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超聲清洗2 次，置干燥處備用。合成的117條探針，在96孔板中用3XSSC溶解，濃度為40 pmol/μ 。用 Calligrapher MiniArrayer點(diǎn)樣儀MCP360點(diǎn)樣針，按圖2設(shè)計(jì)的方案點(diǎn)樣。之后，37°C水化2h，4°C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，先用0.2% SDS洗兩次，每次5min ；雙蒸水洗兩次，每次5min ； 將玻片放入封閉液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；雙蒸水洗兩次，每次Imin ；玻片自然干燥待用。3.芯片雜交
將熒光標(biāo)記的目標(biāo)DNA與含陽(yáng)參的雜交液1 :1充分混勻，98°C變性5min冰浴。取出點(diǎn)在探針陣列區(qū)域，42°C雜交4小時(shí)。取出芯片，依次用42°C預(yù)熱的雜交洗液I、II、III各洗5min，最后用ddH20洗2min，自然晾干，以上過(guò)程均要求避光。整個(gè)芯片制作和檢測(cè)過(guò)程見(jiàn)圖1。4.檢測(cè)結(jié)果
用LUXScan 10K Version 3. 0微陣列芯片掃描儀掃描及圖像分析細(xì)菌耐藥芯片，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，結(jié)果表明，含氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌TGl檢測(cè)出Amp基因、含卡那霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α檢測(cè)出Kana基因、含氯霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5a檢測(cè)出Cat基因、含博萊霉素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α檢測(cè)出Zeocine基因、 含四環(huán)素抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α檢測(cè)到Tet基因，其它探針未出現(xiàn)非特異反應(yīng)，芯片背景和雜交信號(hào)值都比較穩(wěn)定，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
權(quán)利要求
1. 一種病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于檢測(cè)基因芯片包括(1)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸探針組合和質(zhì)量控制探針；(2)寡核苷酸探針通過(guò)手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；所述的寡核苷酸探針是指化學(xué)合成的多種基因序列的高度保守區(qū)的互補(bǔ)寡聚核苷酸，長(zhǎng)度為十到五十個(gè)堿基；所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片是指能檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的寡核苷酸陣列，8類病原體種類特異性基因包括鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、土拉弗朗西斯菌、志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、霍亂弧菌；7類毒素基因包括白喉毒素、志賀毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破傷風(fēng)毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素；17大類耐藥基因包括超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環(huán)素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關(guān)基因、大環(huán)內(nèi)酯類外排基因、耐萬(wàn)古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶、常用基因工程載體耐藥基因；所述的質(zhì)量控制探針至少包括兩種探針，即陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染，陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交的和準(zhǔn)確定位；所述的手臂分子指具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物；所述寡核苷酸固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團(tuán)，固化在載體材料基質(zhì)表面時(shí)與表面修飾的手臂分子的末端基團(tuán)形成共價(jià)鍵；所述的檢測(cè)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸基因探針如下病原體微生物的種類檢測(cè)鑒定選擇兩組探針(每組正、負(fù)鏈)，一組檢測(cè)特異性結(jié)構(gòu)基因保守序列，另一組檢測(cè)關(guān)鍵性毒力基因；鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌根據(jù)鼻疽假單胞菌和類鼻疽假單胞菌的基因序列選擇結(jié)構(gòu)保守序列16S rDNA和毒力基因 flagellin C設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針16S rDNA 正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG 16S rDNA 負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATG flagellin C基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAA CCTCAflagellin C基因負(fù)鏈探針5，-NH2_T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGAGATC布魯氏菌選擇有1430個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)基因16S ribosomal特異序列和布魯氏菌熱休克蛋白31KD基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針16S ribosomal 正鏈探針 5，-NH2-T (10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT16S ribosomal 負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC3IKD 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG 3IKD 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG 沙門氏菌的hilA基因編碼侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白，是inv基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白； 沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion protein, inv)與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由invA, invB. invC. invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子，序列保守，選擇這兩種基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針hilA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCA hilA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAAT invA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAinvA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC 鼠疫耶爾森菌的3a是一段特異的染色體序列，相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示這段序列可作為鼠疫PCR 檢測(cè)的良好靶序列，探針設(shè)計(jì)參照Radnedge等報(bào)道的3a序列設(shè)計(jì)；另選擇質(zhì)粒上的毒力因子莢膜蛋白基因cafl設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針3a 序列正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC 3a 序列負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCT cafl 基因正鏈探針5' -NH2-T (10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACAcafl 基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC 炭疽芽孢桿菌的毒力除決定于染色體基因外，還與毒素質(zhì)粒(P)COl )和莢膜質(zhì)粒 (PX02)這兩個(gè)編碼質(zhì)粒的致病因子有關(guān)；PXOl由三個(gè)部分組成水腫因子(EF)、保護(hù)性抗原(PA)和致死因子(LF)； PX02含CapB，CapC和CapA，編碼莢膜蛋白，為正常毒力所必須； 根據(jù)PXOl的水腫因子(EF)和pX02設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4 條探針EF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTG EF基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGATCApX02基因正鏈探針5，-NH2-T (10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCGTCCApX02 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG 土拉弗朗西斯菌探針根據(jù)Francisella 23kDa結(jié)構(gòu)蛋白和外膜蛋白R(shí))pA基因設(shè)計(jì)，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針Francisella 2!3kDa基因正鏈探針5，-NH2_T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCA GTATGTTGCGCFrancisella 23kDa 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTC TTGTTATCATCTCACTCFopA基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTATFopA基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAATAT志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，以質(zhì)粒和基因組中都存在的序列-侵襲性質(zhì)粒相關(guān)抗原(invasion plasmid antigen, ipa)的片段H為模板，存在多拷貝，易于檢測(cè)；志賀氏菌中侵襲性相關(guān)基因ipaBCD是重要組成成分之一，為志賀菌侵入上皮細(xì)胞所必需的，ipaB - ipaC形成復(fù)合物，針對(duì)ipaC設(shè)計(jì)探針； 每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針ipaH 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATAC ipaH基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAATipaC基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGG ipaC 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA 編碼霍亂弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被認(rèn)為是霍亂弧菌的標(biāo)志基因，編碼霍亂毒素A 亞單位(CtxA基因)是霍亂腸毒素的活性部分；根據(jù)這兩個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針ompW基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTCGCTCompW基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTC CtxA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTC CtxA基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCCT七種毒素序列檢測(cè)選擇毒素的生物活性部分的探針；白喉毒素免疫毒素的細(xì)胞毒性源自DT的酶活性區(qū)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)，即N端389個(gè)氨基酸；其前193個(gè)氨基酸為白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)A片段(DTA)是白喉毒素的酶活性區(qū)，也是DT類免疫毒素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 DTA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA DTA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT 在引起細(xì)菌性痢疾的志賀菌屬中，以I型痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹瀉最為嚴(yán)重，主要原因是它能產(chǎn)生一種高水平的外毒素一志賀毒素(Shiga Toxin, ShT), ShT具有腸毒性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性等3種生物活性，根據(jù)其設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針ShT 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGG ShT基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT 肉毒毒素是已知最劇烈的毒物，有嗜神經(jīng)毒性，可以分為A、B、Cl、C2、D、E、F、G、H八個(gè)型，各型毒素藥理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和，選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共8條 、Clostridium botulinum neurotoxin BoNT geneBoNT基因正鏈探針5' -NH2-T (10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCAGGCABoNT基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T (10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGTCCA2、thegene of botulinum type B toxinB 型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAA B型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTTTCA3、Clostridiumbotulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin typeE型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGGCAAE型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT4、Clostridiumbotulinum neurotoxin type F geneF型基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGA F型基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTCC篦麻毒素Ricin是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B兩條肽組成的異二聚體，A鏈(RTA)分子量為30 (或32) KDa，是一種糖苷酶；B鏈(RTB)的分子量為32 KDa, Ricin屬核糖體失活蛋白，是一種細(xì)胞毒素，必須進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮毒性，根據(jù)A鏈設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針RTA 基因正鏈探針5' -NH2-T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCG RTA基因負(fù)鏈探針5' -NH2-T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTAG破傷風(fēng)毒素(Tetanus toxin)是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，由破傷風(fēng)梭菌(Clostridium Tetani )產(chǎn)生，可被蛋白酶切成兩條輕鏈)和一條重鏈，重鏈有與受體結(jié)合的功能而無(wú)毒性作用；毒素由一個(gè)751Λ大質(zhì)粒上一段核昔酸編碼，編碼基因長(zhǎng)約41Λ，為一大的開(kāi)放讀碼框架，該基因分為A、B、C 3個(gè)片段，A片段編碼毒性蛋白，B片段編碼穿膜蛋白，C片段編碼結(jié)合蛋白，基因工程做疫苗一般克隆的是無(wú)神經(jīng)毒性的C片段，針對(duì)發(fā)揮毒性作用的輕鏈281 -1651序列設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針正鏈探針5，-NH2-T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC 負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT 產(chǎn)腸毒素性葡萄球菌具有多種毒力致病因子，其中最主要的是它所產(chǎn)生的A，B，C1，C2， C3，D和E七型熱穩(wěn)定性腸毒素(staphy-lococcal enterotoxin, SE)，可引起人畜發(fā)生食物中毒，也能成為生物戰(zhàn)毒劑的毒素，選擇了 4個(gè)基因設(shè)計(jì)探針，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條或通用探針，共9條·1、SEC1、SEC2、SEC3,以SEC2 序列為參考SEC2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACC SEC2基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTAT TCCTCCA·2、SEBSEB基因正鏈探針5，-NH2-T (10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAASEB基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTCT·3、SEDSED基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATTTGCSED基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACC ACCAT·4、SEA禾口 SEESEA基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACASEE基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAGCCSEA, SEE 基因通用負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGT TGTCAACGT霍亂毒素見(jiàn)微生物霍亂弧菌檢測(cè)部分；耐藥基因數(shù)目、分類復(fù)雜，部分序列變異而成為亞類的多見(jiàn)，因此在充分的同源性比較及分析的基礎(chǔ)上，盡可能采取通用探針檢測(cè)，在用通用性探針覆蓋更多的耐藥基因的情況下，同時(shí)重點(diǎn)對(duì)主要的，危害大的，易造成流行和對(duì)多藥耐藥而難以控制的，能做成生物戰(zhàn)劑的一系列耐藥基因進(jìn)行全面檢測(cè)；整合酶類基因探針選自I類整合酶基因(IntIl)和II類整合酶基因(IntI2),每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共4條探針intll 基因正鏈探針 5' -NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAG TAGC-3'intll 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3，intI2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3，intI2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGC TG-3，四環(huán)素家族耐藥基因探針選擇tetM基因，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，Tet(M)是研究得最多的核糖體保護(hù)蛋白，具有核糖體依賴的GTP水解酶活性，共2條探針tetM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA-3，tetM 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA-3，氨基糖甙類藥物耐藥基因探針，選取了易于傳播并且危害較大的氨基糖甙類修飾酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6，)-I、aac (6，) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9種，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共18條探針aac (3)-I 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3'aac(3)-I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCA GG-3，aac(3)-II 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGC CAT-3，aac(3)-II 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTT TCC-3'aac(3)-III 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATG CTTG-3，aac(3)-III 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAA GC-3'aac (3) -IV 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGT CAT-3，aac (3) -IV 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3，aac (6') - 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTT TAGCG-3'aac (6') - 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCT TCCC-3'aac (6，)-II基因正鏈探針5，-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATA GACC-3'aac (6')-II基因負(fù)鏈探針5，-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTT CGTC-3'aphA6 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAG AGCCA-3'aphA6 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTAT TTGGC-3，ant ( 3，)-I 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTA AATG-3'ant ( 3' )-1 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCT ACAG-3，ant (2'，) -I 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCT CACTC-3，ant (2'，) -I 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCC CAGC-3'耐消毒劑qacA/B家族基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針qacA/B 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTC GAA-3，qacA/B 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3'紅霉素耐藥相關(guān)基因探針，已發(fā)現(xiàn)Erm基因家族有20余種基因亞型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型為主，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針ErmA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3' ErmA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGA TTC-3，ErmB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3'ErmC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCT CATTGGC-3'ErmC 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCA TGTTC-3，大環(huán)內(nèi)酯類外排(mefA)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 mefA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAG AA-3，mefA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3，耐萬(wàn)古霉素耐藥基因探針，選用了由不同的耐藥基因簇編碼的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6種表型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共12條探針VanA 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3'VanA 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA-3，VanB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT-3'VanB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3，VanCl 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3，VanCl 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGG AGC-3，VanC2 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3'VanC2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA-3，VanD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3'VanE 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3'VanE 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCC CTA-3，多藥耐藥外排泵基因探針，選擇包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共6條探針AcrAB-TolC 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAA GCGT-3'AcrAB-TolC 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAG ACGC-3'OprM 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3'OprM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3'Sme DEF 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3'耐莫匹羅星(ileS)基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針 iIeS 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA-3，ileS 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAG AGC-3，磺胺類耐藥基因探針，選擇了 dfrA和dfrD兩型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共 4條探針dfrA 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAA GCT-3，dfrA 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATG CTTT-3，dfrD 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGAC ATTC-3，dfrD 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCA TGTCCT-3'泰洛星(tlrB)耐藥基因探針，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針tlrB 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3'tlrB 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹諾酮類(norA)藥物耐藥基因探針，norA基因介導(dǎo)的耐藥在金葡菌中相當(dāng)常見(jiàn)，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針norA 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTG AA-3，norA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3，β內(nèi)酰胺酶類(BLA)耐藥基因探針，劃分為超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黃色葡萄球菌(MRSA)金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因；其中超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因，按不同編碼基因同源性分為TEM型、SHV 型、CTX-M型(由于各亞型間⑶S核酸基因序列差異較大，根據(jù)其序列的同源性分3組)，PER 型和VEB型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共14條探針TEM 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3’ TEM 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA-3，SHV 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3，CTX-Ml 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3'CTX-M2 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAA CA-3，CTX-M2 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3'CTX-M3 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3'CTX-M3 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3'PER 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3，PER 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3，VEB 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTA AA-3，VEB 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTG CT-3，頭孢菌素酶(AmpC)耐藥基因探針?lè)譃?組，幾乎涵蓋了所有的質(zhì)粒AmpC基因序列，設(shè)計(jì)正負(fù)鏈探針各六條，共12條探針AmpC 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC-3'AmpC 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3' AmpC 基因負(fù)鏈探針第三條 5，-NH2-T (10) GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAA TAAA-3'AmpC 基因正鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3，AmpC 基因負(fù)鏈探針第四條 5，-NH2-T (10) AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACC GATA-3'AmpC 基因正鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3， AmpC 基因負(fù)鏈探針第五條 5，-NH2-T (10) CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCA AAC-3，AmpC 基因正鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATA AGCC-3'AmpC 基因負(fù)鏈探針第六條 5，-NH2-T (10) AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCA GCAC-3，碳青霉烯酶耐藥基因探針，選取了常見(jiàn)的基因型IMPl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針各一條，共11條探針I(yè)MP 基因通用正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTT GGTTTGTGG-3'IMPl 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT-3'IMPl 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC-3'0XA23 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC-3'0XA23 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGG TTT-3，0XA24 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3'0XA24 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCC AC-3'VIM 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3' GES2 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3'GES2 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3，MRSA金標(biāo)準(zhǔn)mecA基因探針，選取正負(fù)鏈探針各一條，共2條探針mecA 基因正鏈探針 5’ -NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3，mecA 基因負(fù)鏈探針 5’ -NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATC TAACT-3，常用基因工程載體耐藥基因探針，包括氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(Cat)基因、博萊霉素( Zeocin )基因、殺稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨芐霉素(Amp)基因和四環(huán)素(Tet)基因，每個(gè)基因選取正負(fù)鏈探針至少各一條，共16條探針Cat 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3'Cat 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'Zeocin 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3'Zeocin 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正鏈探針 5，-NH2-T (10) CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3，Bsr 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3'Puromycin 基因負(fù)鏈探針 5，-NH2-T (10) GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'Kana 基因正鏈探針 5，-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3，Kana 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3' Tet 基因正鏈探針 5' -NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因負(fù)鏈探針 5' -NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因負(fù)鏈探針第一條 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正鏈探針第二條 5，-NH2-T (10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3' Amp 基因負(fù)鏈探針第二條 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，所述的174條基因探針的任何組合，用于基因芯片的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的固相載體材料選用但不僅限于玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜中的一種或多種。
4.權(quán)利要求1所述的病原體高通量檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因檢測(cè)芯片，用于多種病原體檢測(cè)、鑒定、合理用藥、感染病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種病原體高通量檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用。芯片包括(1)病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的174條寡核苷酸探針組合；(2)寡核苷酸探針通過(guò)手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列?；蛐酒蛱结?74條，包括鼻疽伯克霍爾德氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌、布魯氏菌、沙門氏菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽孢桿菌、霍亂弧菌等8類病原體種類特異性基因探針32條；白喉毒素、志賀毒素、葡萄球菌腸毒素和霍亂毒素等7類毒素基因探針25條；超廣譜β內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、常用基因工程載體耐藥基因等17大類耐藥基因探針117條。基因芯片可用于多種病原體種類特異性基因、毒素基因及耐藥基因的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102534013SQ20121001521
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者傅雅麗, 李越希, 潘明潔, 潘英 申請(qǐng)人:李越希