專利名稱：：用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片及其制作和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片及其制作方法，屬于基因芯片
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：癌轉(zhuǎn)移是影響腫瘤病人生存的首要因素，也是攻克肝細(xì)胞癌OfepatocellularcarcinomiHCC)(簡稱肝癌)的重要關(guān)鍵。目前尚無足夠特異、敏感的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo)及預(yù)測模型，而早期準(zhǔn)確預(yù)測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是及時有效防治的前提，也是進一步延長病人生存的保證。本預(yù)測芯片可對肝癌轉(zhuǎn)移潛能進行準(zhǔn)確預(yù)測，從而能對根治術(shù)后肝癌患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險進行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，對高風(fēng)險患者進行重點監(jiān)測和有效干預(yù)，減少復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，進一步改善患者預(yù)后。癌轉(zhuǎn)移是本世紀(jì)生命科學(xué)要迫切解決的重大問題，也是攻克肝癌的重要關(guān)鍵。肝癌是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死因第3位；每年新發(fā)病564，000例，死亡549，000例，我國占其中一半以上，是我國惡性腫瘤中第2位的殺手。雖然部分肝癌病人因早診、早治及積極、綜合治療而獲得長期生存，但轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)已成為進一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。如何及早預(yù)測、診斷、防治肝癌轉(zhuǎn)移就成為進一步提高肝癌治療效果的關(guān)鍵。近年肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究備受關(guān)注，雖有所進展，但仍存在許多問題轉(zhuǎn)移機理不明是缺乏有效防治手段的關(guān)鍵原因目前臨床的主要困惑在于無法早期判斷和預(yù)測哪些病人已經(jīng)或?qū)l(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、更無有效防治措施。如能了解調(diào)控癌轉(zhuǎn)移的分子機制，將有助于早期識別或預(yù)測高危患者，有助于探索有效的干預(yù)措施、及時有效的治療，從而進一步延長腫瘤病人生存。目前已知腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多因素參與并相互作用的復(fù)雜過程，涉及癌細(xì)胞本身及其與癌周微環(huán)境和宿主免疫狀態(tài)間的相互作用。但其確切機制尚不清楚。尚無足夠特異、敏感的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo)及預(yù)測模型早期準(zhǔn)確預(yù)測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是及時有效防治的前提，也是進一步延長病人生存的保證。傳統(tǒng)的腫瘤診斷、分級、分型方法僅以腫瘤細(xì)胞組織來源、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和蛋白標(biāo)記物等為標(biāo)準(zhǔn)，不能充分反映腫瘤的真實情況，無法解決腫瘤的異質(zhì)性問題。臨床上適合手術(shù)治療的肝癌患者絕大多數(shù)具有相同的病理分級(II-III級)和臨床分期(MI-II期)，給予相同治療后，病程和預(yù)后卻截然不同。目前臨床應(yīng)用的病理分級和臨床分期(如TNM分期)無法對臨床復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移作出準(zhǔn)確預(yù)測，無法解釋為何臨床分期同期、病理分級同級患者給予相同治療但預(yù)后可以截然不同。加上病理醫(yī)師的人為因素(主觀性)等原因，具有嚴(yán)重的局限性，往往要在腫瘤轉(zhuǎn)移之后才能作出診斷，而無法在腫瘤轉(zhuǎn)移之前作出正確的診斷和預(yù)測。近年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步以及對腫瘤生物學(xué)的更多了解，已探索了許多與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記物，但以往研究的另一個重大缺點是這些研究大都為單因素研究模式，每次研究都集中在一個或少數(shù)幾個基因，無法全面了解整個基因組多個基因的變化情況，不能反映肝癌轉(zhuǎn)移的確切分子生物學(xué)特征。且由于腫瘤轉(zhuǎn)移是由多因素參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，既往的單因素研究難以反映復(fù)雜轉(zhuǎn)移過程的整體本質(zhì)，難以準(zhǔn)確預(yù)測臨床轉(zhuǎn)移過程。所以至今沒有一個指標(biāo)能在臨床上用作肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測、診斷。90年代后期以來發(fā)展的基因組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，改變了傳統(tǒng)的單基因研究模式，使我們能從全基因組水平分析相關(guān)基因表達水平及其結(jié)構(gòu)異常，以及相互作用網(wǎng)絡(luò)、途徑及調(diào)控機制等。也使研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程中多基因改變的模式及其調(diào)控機制成為可能。最近，基因表達譜已被用于多種腫瘤的分子分期、以及對治療反應(yīng)及預(yù)后判斷等，如關(guān)于乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移多基因預(yù)測模型已經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)作為診斷工具進行臨床應(yīng)用。但在肝癌轉(zhuǎn)移及其預(yù)測中尚無相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基因芯片，用于對術(shù)后肝癌患者轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險進行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，對高風(fēng)險患者進行重點監(jiān)測和有效干預(yù)，進一步降低術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片，包括基質(zhì)以及設(shè)置在基質(zhì)上的基因檢測探針，其特征在于，所述探針共有146個，其特異寡核苷酸序列如下—基因名稱探針序列ABL2ACTTTGCCAGCTGTGTGGAGGATGGATTTGAGGGAGACAAGACTGGAGGCAGTAGTCCAG_ADD2__CAAGGGAGACGAGGATACCAAAGACGATTCAGAGGAGACGGTGCCCAACCCCTTCAGCCAACTCACTGACAKR1C4CACAGCCTCTGGTTAAATCCCTCCCCTCCTGCTTGGCAACTTCAGCTAGCTAGATATATCCATGGTCCAGALDH3B1AACTGTGTGGTGCTGMGCCATCGGAGATTAGCMGAACGTCGAGAAGATCCTGGCCGAGGTGCTGCCCCALDH3B2GGAACCAAAATGGAGTCACTTATGCCAAACTCTAATAAAATGGAGTCGGGGGGCCACATAGAAGCCCTCAANKRDlTACAAGACCTCTCGCATAGCTACATTCTGAGGCAAACGACAGACTCTTMTCAGTAAATGTTCACTGGCAPlSlTTGGCTTTTATTCCCTGCCTTTGCAGMCTGATGTCACCCCAGATGTCCTTCCCTCCCTAATAACTGTAARPP-21TCCCATTTGACAAGGTACCAGGAGGAAATTTTTTAAGGGATCMCTGTATCACAGTGCCCACTCTGGAC<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>WWTRlCCTTAGACTGCCAGGCACAGAGTCGGGTCGGGATTTGTCAGCCAAGCCTCGGCTCCAGCTCCGCAATCTCYESl__TTCTGTTTACGTAACCTGCTTAGTATTGACACTCTCTACCAAGAGGGTCTTCCTMGAAGAGTGCTGTCYRDCCTCCTCTCTGGTGGGTGGTGGCATTTAAGGTTCAAACCAGCCAGAAGTGCTGGTGCTGTTTAAAAAGTCZC3H12AGCTCCCAACCTGGAGCCTCCACTCCCAGAAGAGGAAAAGGAGGGCAGCGACCTGAGACCAGTGGTCATCGZNF415TATTATCCTATGTGGGAGCACAGGAAAGAGCCCTGGACCATAGAAAGCCAAGTACGAGTAGCAAGAAAACZNF646GGGAGCGCGTGCAGGGAGGGGCTTGATCTCCACATTTTCTCAGGAfrTAGTTCGGGCATCCCCATATCTT所述的基質(zhì)為玻璃基片。本發(fā)明還提供了上述基因芯片的制作方法，其特征在于，具體步驟為第一步用寡核苷酸合成儀制備探針；第二步使用基因芯片點樣儀將合成好的探針點在玻璃基片上，制成基因芯片。本發(fā)明還提供了上述基因芯片的使用方法，其特征在于，具體步驟為第一步對患者切除的肝癌組織和癌旁組織采用TRIzoI法進行總RNA抽提將患者切除的肝癌組織和癌旁組織與TRIzoI試劑按比例50-100毫克1ml混合，用勻漿器勻漿；將勻漿液在室溫下孵育5分鐘，按10.2的體積比加入氯仿，蓋嚴(yán)，用手搖晃15秒鐘，室溫下孵育2-3分鐘；于12000Xg、4°C條件下離心15分鐘，離心后混合液分成三層，取上層水相，按照每ImlTRIzol試劑加入0.5ml的比例加入異丙醇，混勻，15-30°C下靜置10分鐘，于12000Xg、4°C條件下離心10分鐘，RNA沉淀形成膠狀物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照ImlTRIzol試劑加入Iml的比例加入75%乙醇，振蕩混勻；于7500Xg,4°C條件下離心5分鐘，棄上清液，用移液器吸干試管內(nèi)殘留酒精，室溫下自然干燥RNA沉淀5-10分鐘；用DEPC處理過的水重新溶解RNA；取1μ1RNA溶液用199μ1ρΗ7.4的TE緩沖液稀釋，用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度；第二步采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對組織標(biāo)本總RNA樣品進行質(zhì)量檢測將IOXMOPS緩沖液IOml、0.1%DEPC(焦碳酸乙二酯)水70ml、37%甲醛20ml與RNA瓊脂糖1.Og混合制備甲醛變性瓊脂糖凝膠；用DEPC處理過的水將IOXMOPS緩沖液稀釋成IXMOPS緩沖液配制電泳緩沖液；將RNA樣品5.5μ1、IOXMOPS緩沖液1.0μ1、37%甲酸3.5μ1以及去離子甲酰胺10.0μ1混合，配成電泳樣品，65°C孵育5分鐘，冰上冷卻；將電泳槽內(nèi)注入電泳緩沖液，置入甲醛變性瓊脂糖凝膠；電泳樣品內(nèi)加入2μ1IOXRNA加樣緩沖液以及0.ΙμΕΒ，混合均勻后加入上樣孔內(nèi)，電壓100V條件下電泳30分鐘，紫外線凝膠分析儀下觀測，拍照；當(dāng)檢測證實RNA沒有降解時，進入下一步；第三步將肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA，純化洗滌采用雙熒光間接標(biāo)記法分別對肝癌組織cDNA和癌旁組織cDNA進行標(biāo)記，用MonoreactiveCy5Dye(AmershamPharmaciaBiotech,#PA23001)標(biāo)記月中瘤組織cDNA,用MonoreactiveCy3Dye(AmershamPhamaciaBiotech,#PA25001)標(biāo)記癌旁組織cDNA；分另Ij用MicroconYM-30(MILLIP0RE,Amicon,Cat#42410)離心柱對cDNA進行純化(1)將組織總RNA、濃度為2μg/μ1OligodT20-mer以及DEPC處理過的水按比例40μg2μ123μ1混合，總體積為25μ1，65°C孵育5分鐘，冷卻至室溫得到RNA樣品混合液；配制20XdNTP混合液，所述混合液中含有IOmMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP，4mMdTTP以及6mM氨基修飾的dUTP；將5XRTbuffer10μ1、20XdNTP混合液2.5μ1、0.IMDTT5μ1、superRNaseIN1μ1以及DEPCtreatedwater4.5μ1混合得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液；將RNA樣品混合液與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混合，加入2μ1濃度為200U/μ1的逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII，42°C孵育60分鐘，70°C孵育5分鐘，短暫離心，加入2μ1濃度為2U/μ1的RNA酶H，370C孵育30分鐘；加入0.5μ1濃度為0.5ΜEDTA終止反應(yīng)，加入10μIQuickcleanenzymeremoveresin，振搖1分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；將上清液移至0.65μm過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；收集濾液，加入5.5μ13Μ醋酸鈉溶液，137.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，_20°C放置1小時，使cDNA沉淀；4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘；棄上清，用500μ170%的乙醇洗滌沉淀兩次；37°C孵育4-6分鐘；用20μ10.IM碳酸氫鈉溶液重新溶解cDNA；(2)用10μ1去離子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暫離心備用；取2ul染料溶液加入用碳酸氫鈉溶解的cDNA溶液中，立即用振蕩器振蕩混勻，用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA；室溫下于暗處放置1小時，每20分鐘振蕩混勻一次，使染料與氨基修飾過的dUTP充分結(jié)合，從而標(biāo)記cDNA；(3)在標(biāo)記過的cDNA混合液中加入2.5μ13Μ醋酸鈉溶液，62.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，-20°c放置1小時，使標(biāo)記后的cDNA沉淀；4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，使沉淀離心至管底；吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗滌沉淀；37°C孵育4-6分鐘；用80μ1TE緩沖液將沉淀重新溶解，將Cy5標(biāo)記的肝癌組織cDNA和相對應(yīng)的Cy3標(biāo)記的癌旁組織cDNA溶液混合于同一個離心管中，混合均勻；加入550μ1的PB緩沖液，混合均勻；將溶液移至純化過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，棄濾過液，在純化過濾離心柱中加入750μ1的PE緩沖液，室溫下放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；棄過濾液，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘去除殘留乙醇；在純化過濾離心柱中加入50μ1的EB洗脫液，室溫放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘洗脫回收純化后的cDNA；(4)在MicroconYM-30離心柱中加入400μ1ρΗ7·4的TE緩沖液，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，洗滌離心柱；將洗脫回收cDNA溶液加入YM-30離心柱中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8-10分鐘，至液體剩余體積為20-40μ1；加入400μ1ρΗ7.4的TE緩沖液，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8-10分鐘洗滌cDNA，重復(fù)3_4次；最后一次洗滌后離心至剩余液體體積小于15μ1，將離心柱倒置于新的離心管中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，回收經(jīng)純化的cDNA；加入ρΗ7.4的TE緩沖液使體積為17μ1；第四步將基因芯片浸入預(yù)雜交液進行預(yù)雜交按下列比例配制預(yù)雜交緩沖液20XSSC15ml、10%SDS0.6ml、10%BSA6ml以及去離子蒸餾水38.4ml；將預(yù)雜交液倒入預(yù)雜交槽中，于42°C水浴箱內(nèi)預(yù)熱10分鐘；將微陣列芯片浸入預(yù)雜交液中預(yù)雜交1小時以上；用雙蒸水洗滌微陣列芯片2分鐘；將微陣列芯片轉(zhuǎn)移至異丙醇液中洗滌2分鐘；于700rpm離心洗滌過的芯片5分鐘，使芯片干燥；將芯片置芯片盒內(nèi)保存；將基因芯片浸入預(yù)雜交液中進行預(yù)雜交1-3小時，用雙蒸水洗滌后以轉(zhuǎn)速700rpm離心5分鐘，使基因芯片干燥；第五步基因芯片雜交將去離子甲酰胺250μ1、20XSSC250μ1以及10%SDSlOμ1混合配制2ΧF-雜交緩沖液；震蕩搖勻后42°c保存；將1μ1濃度為10μg/μ1的HumanC0T-1DNA、1μ1濃度為8-10μg/μ1的polyA及1μ1濃度為4μg/μ1的yeasttRNA加入純化后的cDNA溶液中，最終雜交樣品體積為20μ1；震蕩混勻、短暫離心，將雜交樣品置100°C加熱器中變性2分鐘，置冰上冷卻1分鐘，短暫離心后置于42°C加熱器內(nèi)5分鐘；加入20μ1的2ΧF-雜交緩沖液至雜交樣品中，混合均勻，短暫離心，最后總體積為40μ1；將雜交樣品加入微陣列芯片及其蓋玻片之間的空間內(nèi)；將芯片放置雜交槽內(nèi)，雜交槽內(nèi)兩端各加入20μ1雙蒸水；蓋嚴(yán)密封雜交槽，將雜交槽放入42°C水浴箱內(nèi)孵育過夜；第六步雜交后芯片的洗滌和掃描分析將雜交芯片浸入含有IXSSC及0.SDS的洗滌液中，洗滌芯片2分鐘；在IXSSC洗滌液中洗滌2分鐘；在0.2XSSC洗滌液中洗滌2分鐘；在0.2XSSC洗滌液中洗滌1分鐘；在0.05XSSC洗滌液中洗滌30秒；于700rpm離心芯片5分鐘；用GenePix4000A掃描儀掃描芯片并進行芯片圖像的分析處理。本發(fā)明的原理如下過去經(jīng)典腫瘤轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞高度克隆選擇的過程，在原發(fā)瘤中僅少數(shù)癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移潛能，而且轉(zhuǎn)移發(fā)生在腫瘤晚期(Fidler.NatRevCancer2003)。這些理論對指導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移研究起到重要作用。但這些理論大多從動物實驗?zāi)Ｐ椭械贸?，缺乏人類腫瘤轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)。臨床上常見腫瘤很小，但很早已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，甚至原發(fā)瘤隱匿不現(xiàn)而全身轉(zhuǎn)移者；并且許多病理特征、臨床分期相同的腫瘤病人卻具有完全不同的疾病過程和預(yù)后(Ramaswamyetal.NatGet2003)。這些是經(jīng)典腫瘤轉(zhuǎn)移理論所難以解釋的。本發(fā)明應(yīng)用cDNAmicroarrays技術(shù)在全基因組范圍比較研究40例伴或不伴肝內(nèi)播散的肝癌組織中9，180個基因表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)伴轉(zhuǎn)移肝癌與不伴轉(zhuǎn)移肝癌之間基因表達差異明顯(153個基因有顯著差異，ρ<0.001)，而肝癌原發(fā)瘤與其轉(zhuǎn)移灶間基因表達譜差異并不非常顯著(P>0.05)；且這種差異與腫瘤大小等臨床病理特征并無明顯關(guān)系。不同臨床分組間基因表達譜差異分析(CCP法)如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由此提示促使肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變可能在原發(fā)腫瘤階段就已經(jīng)發(fā)生，高轉(zhuǎn)移傾向肝癌與低轉(zhuǎn)移傾向肝癌具有完全不同的基因譜。這可能就是臨床上為何肝癌的臨床病例特征(腫瘤大小、病理分級及臨床分期等)相似、而治療效果和生存期差異明顯的原因之一。據(jù)此，該研究在國際上首次提出促使肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變主要發(fā)生在原發(fā)瘤階段的新觀點，回答了有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能是在原發(fā)瘤階段即已存在、還是在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中逐漸獲得的這一長期存在爭論的問題，有助于轉(zhuǎn)移前腫瘤的及早發(fā)現(xiàn)。此為肝癌轉(zhuǎn)移理論的重要創(chuàng)新，這一發(fā)現(xiàn)豐富了經(jīng)典轉(zhuǎn)移理論，也為肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)測、診斷和防治奠定了理論基礎(chǔ)。提示轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)可早期預(yù)測及發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)移防治應(yīng)從“源頭”抓起。研究結(jié)果以封面文章形式發(fā)表在“自然醫(yī)學(xué)雜志”(NatMed2003，IF28.9)。如何及早、準(zhǔn)確地預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移潛能是困擾臨床的一大難題。根據(jù)上述研究發(fā)現(xiàn)的伴轉(zhuǎn)移肝癌與不伴轉(zhuǎn)移肝癌之間153個顯著差異基因，在國際上首次建立了能正確預(yù)測病人有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的多分子預(yù)測模型，可將20例(100%)建立模型標(biāo)本進行準(zhǔn)確分類，經(jīng)小樣本驗證，可以準(zhǔn)確預(yù)測另外20例待測標(biāo)本中的至少18例，預(yù)測準(zhǔn)確率達90%(NatMed2003)。最近，本發(fā)明采用AffymetrixU133A基因芯片(不同平臺)對該預(yù)測模型進行了241例大樣本獨立驗證，在新基因芯片中，對153個預(yù)測基因進行優(yōu)化，應(yīng)用優(yōu)化后其中146個基因組成的預(yù)測模型對患者進行生存預(yù)測分析并分組，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組生存預(yù)后比低風(fēng)險組顯著差(P=0.0014，如圖1所示，為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對241例術(shù)后肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果圖)，可以對患者生存進行準(zhǔn)確預(yù)測。更重要的是該預(yù)測模型可以對單發(fā)腫瘤肝癌(P=0.0006,如圖2所示，為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對189例單發(fā)腫瘤肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果圖)和小肝癌(腫瘤小于5cm)(P=0.0029，如圖3所示，為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對154例小肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果)進行準(zhǔn)確的生存預(yù)測。此外應(yīng)用該預(yù)測模型還可以對肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)進行準(zhǔn)確的預(yù)測(P=0.0006，如圖4所示，為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對186例肝癌患者早期復(fù)發(fā)預(yù)測分析結(jié)果圖)。這是國際上第一個經(jīng)過不同試驗平臺和不同病例分組(大樣本)驗證可用于肝癌臨床轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后預(yù)測的分子診斷模型。這是肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測方法的重要進展，揭示了腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)特性是決定腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，經(jīng)大樣本量的進一步驗證，證實其具有重要的臨床應(yīng)用價值。146個預(yù)測基因列表及其權(quán)重如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>預(yù)測計算公式如下P=ΣWiXi-O.166532其中，Wi表示i基因的權(quán)重，Xi表示i基因的表達結(jié)果的對數(shù)值。預(yù)測結(jié)果的判定如下根據(jù)預(yù)測計算公式計算每個病例的預(yù)測值P值，如果P>-0.055761，則判定為高風(fēng)險，如果P彡-0.055761，則判定為低風(fēng)險。本發(fā)明的優(yōu)點是采用基因組比較研究，經(jīng)大樣本量獨立驗證，證明該預(yù)測模型可對肝癌患者轉(zhuǎn)移潛能進行準(zhǔn)確預(yù)測和評估，從而可對患者術(shù)后生存和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)進行準(zhǔn)確預(yù)測(即使早期肝癌患者也可進行準(zhǔn)確預(yù)測)，將有助于早期識別或預(yù)測高?；颊撸瑢ζ溥M行重點監(jiān)測和有效干預(yù)，從而進一步延長腫瘤病人生存。圖1為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對241例術(shù)后肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果圖；圖2為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對189例單發(fā)腫瘤肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果圖；圖3為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對154例小肝癌患者生存預(yù)測分析結(jié)果圖4為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對186例肝癌患者早期復(fù)發(fā)預(yù)測分析結(jié)果圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。實施例1一種用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片，包括基質(zhì)以及設(shè)置在基質(zhì)上的基因檢測探針，所述的基質(zhì)為玻璃基片。所述探針共有146個，其特異寡核苷酸序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>\<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>上述基因芯片的制作方法如下第一步用寡核苷酸合成儀制備探針；第二步使用基因芯片點樣儀將合成好的探針點在玻璃基片上，制成基因芯片。實施例1患者洪某，男，39歲，因患原發(fā)性肝癌于2002年8月21日于我院進行根治性手術(shù)切除治療，術(shù)后我們收集患者手術(shù)標(biāo)本，使用實施例1制成的基因芯片按下述方法進行檢測第一步對患者切除的肝癌組織和癌旁組織采用TRIzoI法進行總RNA抽提1.取50毫克組織，加入ImlTRIzol試劑(GIBC0公司生產(chǎn))，組織的體積不應(yīng)超過加入TRIzol體積的10%。使用勻漿器充分勻漿。2.將勻漿液在室溫下孵育5分鐘，使核蛋白復(fù)合體充分裂解。3.按10.2(TRIzol氯仿)的體積比加入氯仿，蓋嚴(yán)，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫下孵育2分鐘。4.于12000Xg、4°C條件下離心15分鐘，離心后混合液分成三層，分別為底層紅色的酚_氯仿相，中間相和無色的上層水相。RNA只存在于上層水相中，水相的體積約為加入TRIzol體積的60%o5.將水相移入一個干凈的離心管中，按照每ImlTRIzol加入0.5ml的比例加入異丙醇，混勻，15-30°C靜置10分鐘。6.于12000Xg、4°C條件下離心10分鐘，RNA沉淀形成膠狀物沉在管底管壁。7.RNA洗滌倒掉上清液，按照ImlTRIzol加入Iml的比例加入75%乙醇，振蕩混勻。8.于7500Xg、4°C條件下離心5分鐘，棄上清液，用移液器吸干試管內(nèi)殘留酒精，室溫下自然干燥RNA沉淀5分鐘，注意不要讓RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很難溶解。9.用DEPC處理過的水重新溶解RNA。10.用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度取1μ1RNA溶液用199μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)稀釋，用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度及純度。11.當(dāng)證實RNA樣品純度良好時進入下一步。第二步采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對組織標(biāo)本總RNA樣品進行質(zhì)量檢測1.甲醛變性瓊脂糖凝膠的制備(1%瓊脂糖，IOOml)組成成份體積(ml)IOXMOPS緩沖液100.1%DEPC水7037%甲醛20RNA瓊脂糖1.Og2.電泳緩沖液的制備用DEPC處理過的水將IOXMOPS緩沖液稀釋成IXMOPS緩沖液。3.按下列組成配制電泳樣品，650C孵育5分鐘，冰上冷卻。RNA樣品5.5μ(2μ§)IOXMOPS緩沖液1.0μ37%甲醛3.5μ去離子甲酰胺10.0μ4.力Π2μ110ΧRNA加樣緩沖液、0·1μ1EB,電壓100V條件下電泳約30分鐘，紫外線凝膠分析儀下觀測，拍照。當(dāng)檢測證實RNA沒有降解時，進入下一步；第三步將肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA，純化洗滌采用雙熒光間接標(biāo)記法分別對肝癌組織cDNA和癌旁組織cDNA進行標(biāo)記，用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA；分別用MicroconYM-30離心柱對cDNA進行純化；(1)肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA1.取組織總RNA40μg,加入2μ1OligodT20-mer(2μg/μ1)，加入DEPC處理過的水到總體積為25μ1，混合均勻。2.65°C孵育5分鐘，室溫下放置超過3分鐘，使樣品混合液冷卻至室溫。3.按以下比例配制逆轉(zhuǎn)錄所需20XdNTP混合液10mMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP,4mMdTTP,6mMaminoally-dUTP(氨基修飾的dUTP，可以和N-羥琥珀酰亞胺活化的熒光染料進行偶聯(lián)反應(yīng))。4.按以下列表準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，混合均勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5.將RNA樣品混合液與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混合。6.加入2μ1逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII，200U/μ1)，充分混勻(注意防止氣泡形成)。7.42°C孵育60分鐘。8.70°C孵育5分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失去活性。9.加入2μIRNA酶H(2U/μ1)，37°C孵育30分鐘，降解殘余RNA010.力口入0·5μ10.5ΜEDTA終止反應(yīng)，力口入10μ1Quickcleanenzymeremoveresin，振蕩器劇烈振搖1分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。11.將上清液移至0.65μm過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。12.收集濾過液，加入5.5μ13Μ醋酸鈉溶液，137.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，-20°C放置1小時，使cDNA沉淀。13.40C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘。14.棄上清，用500μ170%的乙醇洗滌沉淀兩次。15.37°C孵育4分鐘，使沉淀干燥。16.用20μ10.IMNaHCO3溶液重新溶解cDNA。(2)cDNA的間接標(biāo)記1.用10μ1去離子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暫離心，備用。2.取2ul染料溶液加入用NaHCO3溶解的cDNA溶液中，立即用振蕩器振蕩混勻。用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA(激光激發(fā)后顯紅色熒光)，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA(激光激發(fā)后顯綠色熒光)。3.室溫下于暗處放置1小時，每20分鐘柔和振蕩混勻一次。使染料與氨基修飾過的dUTP充分結(jié)合，從而標(biāo)記cDNA。(3)使用Qiagen公司的QIAquickPCRPurification試劑盒進行cDNA純化1.在探針標(biāo)記混合液中加入2.5μ13Μ醋酸鈉溶液，62.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，_20°C放置1小時，使標(biāo)記后的cDNA沉淀。2.4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，使沉淀離心至管底。3.吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗滌沉淀。4.370C孵育4-6分鐘，使沉淀干燥。5.用80μ1TE緩沖液將沉淀重新溶解，將Cy5標(biāo)記的肝癌組織cDNA和相對應(yīng)的Cy3標(biāo)記的癌旁組織cDNA溶液混合于同一個離心管中，混合均勻。6.加入550μ1的PB緩沖液，混合均勻。7.將溶液移至純化過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。8.棄濾過液，在純化過濾離心柱中加入750μ1的PE緩沖液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均勻)，室溫下放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。9.棄濾過液，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘去除殘留乙醇。10.在純化過濾離心柱中加入50μ1的EB洗脫液，室溫放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘洗脫回收純化后的cDNA。(4)用MicroconYM-30離心柱對cDNA進行純化1.在MicroconYM-30離心柱中加入400μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，洗滌離心柱。2.將洗脫回收cDNA溶液加入YM-30離心柱中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8分鐘，至液體剩余體積為20μ1。3.加入400μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8分鐘洗滌cDNA，重復(fù)3次。4.最后一次洗滌后離心至剩余液體體積小于15μ1，將離心柱倒置于新的離心管中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，回收經(jīng)純化的cDNA。5.加入TE緩沖液(ρΗ7.4)使體積為17μ1。第四步將基因芯片浸入預(yù)雜交液進行預(yù)雜交1.按照下列比例配制終濃度為5ΧSSC、0.1%SDS及i%BSA的預(yù)雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>2.將預(yù)雜交液倒入預(yù)雜交槽中，于42°C水浴箱內(nèi)預(yù)熱10分鐘。3.將微陣列芯片浸入預(yù)雜交液中預(yù)雜交1小時以上。4.用雙蒸水洗滌微陣列芯片2分鐘。5.將微陣列芯片轉(zhuǎn)移至異丙醇液中洗滌2分鐘。6.于700rpm離心洗滌過的芯片5分鐘，使芯片干燥。7.將芯片置芯片盒內(nèi)保存(注意芯片干燥后放置時間不能超過1小時)。將基因芯片浸入預(yù)雜交液中進行預(yù)雜交1小時，用雙蒸水洗滌后以轉(zhuǎn)速700rpm離心5分鐘，使基因芯片干燥；第五步基因芯片雜交1.按以下比例配制新鮮2XF-雜交緩沖液去離子甲酰胺250μ1+20ΧSSC250μ1+10%SDSlOy1。2.震蕩搖勻后保存在42°C加熱器內(nèi)。3.1μ1HumanC0T-1DNA(10μg/μ1)、1μ1polyA(8μg/μ1)及1μ1yeasttRNA(4μg/μ1)加入純化后的cDNA溶液中，最終雜交樣品體積為20μ1。4.震蕩混勻、短暫離心。5.將雜交樣品置100°C加熱器中變性2分鐘，迅速置冰上冷卻1分鐘，短暫離心后置于42°C加熱器內(nèi)5分鐘。6.加入20μ1的2ΧF-雜交緩沖液至雜交樣品中，混合均勻，最后總體積為40μ1。7.將雜交樣品小心加入微陣列芯片及其蓋玻片之間的空間內(nèi)，注意勿產(chǎn)生氣泡。8.將芯片放置雜交槽內(nèi)，雜交槽內(nèi)兩端各加入20μ1雙蒸水(保持雜交槽內(nèi)的濕度)。9.蓋嚴(yán)密封雜交槽，將雜交槽放入42°C水浴箱內(nèi)孵育過夜(12-16小時)。第六步雜交后芯片的洗滌和掃描分析1.將雜交芯片浸入IXSSC及0.SDS洗滌液中，小心使蓋玻片從芯片上滑落，洗滌芯片2分鐘。2.在IXSSC洗滌液中洗滌2分鐘。3.在0.2XSSC洗滌液中洗滌2分鐘。4.在0.2XSSC洗滌液中洗滌1分鐘。5.在0.05XSSC洗滌液中洗滌30秒。6.于700rpm離心芯片5分鐘，使芯片干燥。7.盡快用GenePix4000A掃描儀掃描芯片并進行芯片圖像的分析處理。各濃度洗滌液的配置方法列表<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>用BRB-T00LS軟件對這146個基因的表達情況進行分析，并根據(jù)預(yù)測公式P=Σ^iXi-O.166532計算，結(jié)果P<-0.055761，預(yù)測為低風(fēng)險組?；颊唠S訪至今無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。實施例2患者朱某，男，44歲，因患原發(fā)性肝癌于2002年12月30日于我院進行根治性手術(shù)切除治療，術(shù)后我們收集患者手術(shù)標(biāo)本，使用實施例1制成的基因芯片按下述方法進行檢測第一步對患者切除的肝癌組織和癌旁組織采用TRIzoI法進行總RNA抽提1.取100毫克組織，加入ImlTRIzol試劑(GIBC0公司生產(chǎn))，組織的體積不應(yīng)超過加入TRIzoI體積的10%。使用勻漿器充分勻漿。2.將勻漿液在室溫下孵育5分鐘，使核蛋白復(fù)合體充分裂解。3.按10.2(TRIzol氯仿)的體積比加入氯仿，蓋嚴(yán)，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫下孵育3分鐘。4.于12000Xg、4°C條件下離心15分鐘，離心后混合液分成三層，分別為底層紅色的酚_氯仿相，中間相和無色的上層水相。RNA只存在于上層水相中，水相的體積約為加入TRIzol體積的60%。5.將水相移入一個干凈的離心管中，按照每ImlTRIzol加入0.5ml的比例加入異丙醇，混勻，15-30°C靜置10分鐘。6.于12000Xg、4°C條件下離心10分鐘，RNA沉淀形成膠狀物沉在管底管壁。7.RNA洗滌倒掉上清液，按照ImlTRIzol加入Iml的比例加入75%乙醇，振蕩混勻。8.于7500Xg、4°C條件下離心5分鐘，棄上清液，用移液器吸干試管內(nèi)殘留酒精，室溫下自然干燥RNA沉淀10分鐘，注意不要讓RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很難溶解。9.用DEPC處理過的水重新溶解RNA。10.用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度取1μ1RNA溶液用199μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)稀釋，用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度及純度。當(dāng)證實RNA樣品純度良好時進入下一步。第二步采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對組織標(biāo)本總RNA樣品進行質(zhì)量檢測1.甲醛變性瓊脂糖凝膠的制備(1%瓊脂糖，IOOml)組成成份體積(ml)IOXMOPS緩沖液100.1%DEPC水7037%甲醛20RNA瓊脂糖l.Og5.電泳緩沖液的制備用DEPC處理過的水將IOXMOPS緩沖液稀釋成IXMOPS緩沖液。6.按下列組成配制電泳樣品，65°C孵育5分鐘，冰上冷卻。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>7.力Π2μ1IOXRNA加樣緩沖液、0.1μ1EB,電壓100V條件下電泳約30分鐘，紫外線凝膠分析儀下觀測，拍照。當(dāng)檢測證實RNA沒有降解時，進入下一步；第三步將肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA，純化洗滌采用雙熒光間接標(biāo)記法分別對肝癌組織cDNA和癌旁組織cDNA進行標(biāo)記，用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA；分別用MicroconYM-30離心柱對cDNA進行純化；(1)肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA1.取組織總RNA40μg,加入2μ1OligodT20-mer(2μg/μ1)，加入DEPC處理過的水到總體積為25μ1，混合均勻。2.65°C孵育5分鐘，室溫下放置超過3分鐘，使樣品混合液冷卻至室溫。3.按以下比例配制逆轉(zhuǎn)錄所需20XdNTP混合液10mMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP,4mMdTTP,6mMaminoally-dUTP(氨基修飾的dUTP，可以和N-羥琥珀酰亞胺活化的熒光染料進行偶聯(lián)反應(yīng))。4.按以下列表準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，混合均勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>5.將RNA樣品混合液與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混合。6.加入2μ1逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII，200U/μ1)，充分混勻(注意防止氣泡形成)。7.42°C孵育60分鐘。8.70°C孵育5分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失去活性。9.加入2μ1RNA酶H(2U/μ1)，37°C孵育30分鐘，降解殘余RNA。10.力口入0.5μ10.5ΜEDTA終止反應(yīng)，力口入10μ1Quickcleanenzymeremoveresin，振蕩器劇烈振搖1分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。11.將上清液移至0.65μm過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。12.收集濾過液，加入5.5μ13Μ醋酸鈉溶液，137.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，-20°C放置1小時，使cDNA沉淀。13.40C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘。14.棄上清，用500μ170%的乙醇洗滌沉淀兩次。15.37°C孵育6分鐘，使沉淀干燥。16.用20μ10.IMNaHCO3溶液重新溶解cDNA。(2)cDNA的間接標(biāo)記1.用10μ1去離子蒸溜水MonoreactiveCy3Dye禾口MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暫離心，備用。2.取2ul染料溶液加入用NaHCO3溶解的cDNA溶液中，立即用振蕩器振蕩混勻。用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA(激光激發(fā)后顯紅色熒光)，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA(激光激發(fā)后顯綠色熒光)。3.室溫下于暗處放置1小時，每20分鐘柔和振蕩混勻一次。使染料與氨基修飾過的dUTP充分結(jié)合，從而標(biāo)記cDNA。(3)使用Qiagen公司的QIAquickPCRPurification試劑盒進行cDNA純化1.在探針標(biāo)記混合液中加入2.5μ13Μ醋酸鈉溶液，62.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，_20°C放置1小時，使標(biāo)記后的cDNA沉淀。2.4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，使沉淀離心至管底。3.吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗滌沉淀。4.370C孵育4-6分鐘，使沉淀干燥。5.用80μ1TE緩沖液將沉淀重新溶解，將Cy5標(biāo)記的肝癌組織eDNA和相對應(yīng)的Cy3標(biāo)記的癌旁組織cDNA溶液混合于同一個離心管中，混合均勻。6.加入550μ1的PB緩沖液，混合均勻。7.將溶液移至純化過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。8.棄濾過液，在純化過濾離心柱中加入750μ1的PE緩沖液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均勻)，室溫下放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。9.棄濾過液，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘去除殘留乙醇。10.在純化過濾離心柱中加入50μ1的EB洗脫液，室溫放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘洗脫回收純化后的cDNA。(4)用MicroconYM-30離心柱對cDNA進行純化1.在MicroconYM-30離心柱中加入400μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，洗滌離心柱。2.將洗脫回收cDNA溶液加入YM-30離心柱中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，至液體剩余體積為40μ1。3.加入400μ1TE緩沖液(ρΗ7.4)，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘洗滌cDNA，重復(fù)4次。4.最后一次洗滌后離心至剩余液體體積小于15μ1，將離心柱倒置于新的離心管中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，回收經(jīng)純化的cDNA。5.加入TE緩沖液(pH7.4)使體積為17μ1。第四步將基因芯片浸入預(yù)雜交液進行預(yù)雜交1.按照下列比例配制終濃度為5ΧSSC、0.1%SDS及1%BSA的預(yù)雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>2.將預(yù)雜交液倒入預(yù)雜交槽中，于42°C水浴箱內(nèi)預(yù)熱10分鐘。3.將微陣列芯片浸入預(yù)雜交液中預(yù)雜交1小時以上。4.用雙蒸水洗滌微陣列芯片2分鐘。5.將微陣列芯片轉(zhuǎn)移至異丙醇液中洗滌2分鐘。6.于700rpm離心洗滌過的芯片5分鐘，使芯片干燥。7.將芯片置芯片盒內(nèi)保存(注意芯片干燥后放置時間不能超過1小時)。將基因芯片浸入預(yù)雜交液中進行預(yù)雜交3小時，用雙蒸水洗滌后以轉(zhuǎn)速700rpm離心5分鐘，使基因芯片干燥；第五步基因芯片雜交1.按以下比例配制新鮮2XF-雜交緩沖液去離子甲酰胺250μ1+20ΧSSC250μ1+10%SDSlOy1。2.震蕩搖勻后保存在42°C加熱器內(nèi)。3.1μ1HumanC0T-1DNA(10μg/μ1)、1μ1polyA(10μg/μ1)及1μ1yeasttRNA(4μg/μ1)加入純化后的cDNA溶液中，最終雜交樣品體積為20μ1。4.震蕩混勻、短暫離心。5.將雜交樣品置100°C加熱器中變性2分鐘，迅速置冰上冷卻1分鐘，短暫離心后置于42°C加熱器內(nèi)5分鐘。6.加入20μ1的2ΧF-雜交緩沖液至雜交樣品中，混合均勻，最后總體積為40μ1。7.將雜交樣品小心加入微陣列芯片及其蓋玻片之間的空間內(nèi)，注意勿產(chǎn)生氣泡。8.將芯片放置雜交槽內(nèi)，雜交槽內(nèi)兩端各加入20μ1雙蒸水(保持雜交槽內(nèi)的濕度)。9.蓋嚴(yán)密封雜交槽，將雜交槽放入42°C水浴箱內(nèi)孵育過夜(12-16小時)。第六步雜交后芯片的洗滌和掃描分析1.將雜交芯片浸入IXSSC及0.1%SDS洗滌液中，小心使蓋玻片從芯片上滑落，洗滌芯片2分鐘。2.在IXSSC洗滌液中洗滌2分鐘。3.在0.2XSSC洗滌液中洗滌2分鐘。4.在0.2XSSC洗滌液中洗滌1分鐘。5.在0.05XSSC洗滌液中洗滌30秒。6.于700rpm離心芯片5分鐘，使芯片干燥。7.盡快用GenePix4000A掃描儀掃描芯片并進行芯片圖像的分析處理。各濃度洗滌液的配置方法列表<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>用BRB-T00LS軟件對這146個基因的表達情況進行分析，并根據(jù)預(yù)測公式P=ΣWiXi-O.166532計算，結(jié)果P>-0.055761，預(yù)測為高風(fēng)險組。術(shù)后患者于2003年3月出現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)，2003年12月死亡。序列表<110>復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院<120>用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片及其制作和使用方法<160>146<210>1<211>60<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>1actttgccagctgtgtggaggatggatttgagggagacaagactggaggcagtagtccag60<210>2<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>2caagggagacgaggataccaaagacgattcagaggagacggtgcccaaccccttcagcca60actcactgac70<210>3<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>3cacagcctctggttaaatccctcccctcctgcttggcaacttcagctagctagatatatc60catggtccag70<210>4<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>4BBctgtgtggtgctgaagccatcggagattagcaagaacgtcgagaagatcctggccgag60gtgctgcccc70<210>5<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>5ggaaccaaaatggagtcacttatgccaaactctaataaaatggagtcggggggccacata60gaagccctca70<210>6<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>6tacaagacctctcgcatagctacattctgaggcaaacgacagactcttaatcagtaaatg60ttcactggc69<210>7<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>7ttggcttttattccctgcctttgcagaactgatgtcaccccagatgtccttccctcccta60ataactgta69<210>8<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>8tcccatttgacaaggtaccaggaggaaattttttaagggatcaactgtatcacagtgccc60actctggac69<210>9<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>9tggagagaggctgcctttctggttccatctccttgggtgtgaggatagaatttcgaacac60caagagtcaa70<210>10<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>10ctgaaacagcttcttctggctcataaagattgccctgtaaccgccatgcagaagaaatct60ggctatcata70<210>11<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>11accacctgctcactggtcaaaacctacacagctgtttcctcacgtccatcactggctctc60taattccact70<210>12<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>12taatataccttcagtcaactttaccaagaagtcctggatttccaagatccgcgtctgaaa60gtgcagtac69<210>13<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>13cagcagctggcgcc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(H.sapiens).[1258]<400>143ctcctctctggtgggtggtggcatttaaggttcaaaccagccagaagtgctggtgctgtt60taaaaagtc69<210>144<211>70<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>144gctcccaacctggagcctccactcccagaagaggaaaaggagggcagcgacctgagacca60gtggtcatcg70<210>145<211>70<212>DNA<213>A(H.sapiens)<400>145tattatcctatgtgggagcacaggaaagagccctggaccatagaaagccaagtacgagta60gcaagaaaac70<210>146<211>69<212>DNA<213>人(H.sapiens)<400>146gggagcgcgtgcagggaggggcttgatctccacattttctcaggagtagttcgggcatcc60ccatatctt69.權(quán)利要求一種用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片，包括基質(zhì)以及設(shè)置在基質(zhì)上的基因檢測探針，其特征在于，所述探針共有146個，其特異寡核苷酸序列如下2.如權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片，其特征在于，所述的基質(zhì)為玻璃基片。3.權(quán)利要求1所述基因芯片的制作方法，其特征在于，具體步驟為第一步用寡核苷酸合成儀制備探針；第二步使用基因芯片點樣儀將合成好的探針點在玻璃基片上，制成基因芯片。4.權(quán)利要求1所述基因芯片的使用方法，其特征在于，具體步驟為第一步對患者切除的肝癌組織和癌旁組織采用TRIZOI法進行總RNA抽提將患者切除的肝癌組織和癌旁組織與TRIzoI試劑按比例50-100毫克1ml混合，用勻漿器勻漿；將勻漿液在室溫下孵育5分鐘，按10.2的體積比加入氯仿，蓋嚴(yán)，用手搖晃15秒鐘，室溫下孵育2-3分鐘；于12000Xg、4°C條件下離心15分鐘，離心后混合液分成三層，取上層水相，按照每ImlTRIzol試劑加入0.5ml的比例加入異丙醇，混勻，15_30°C下靜置10分鐘，于12000Xg、4°C條件下離心10分鐘，RNA沉淀形成膠狀物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照ImlTRIzol試劑加入Iml的比例加入75%乙醇，振蕩混勻；于7500Xg、4°C條件下離心5分鐘，棄上清液，用移液器吸干試管內(nèi)殘留酒精，室溫下自然干燥RNA沉淀5-10分鐘；用DEPC處理過的水重新溶解RNA；取1μ1RNA溶液用199μ1ρΗ7.4的TE緩沖液稀釋，用Nanodrop分光光度計檢測RNA濃度；第二步采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對組織標(biāo)本總RNA樣品進行質(zhì)量檢測將IOXMOPS緩沖液IOmUO.1%DEPC水70ml、37%甲醛20ml與RNA瓊脂糖1.Og混合制備甲醛變性瓊脂糖凝膠；用DEPC處理過的水將IOXMOPS緩沖液稀釋成IXMOPS緩沖液配制電泳緩沖液；將RNA樣品5.5μ1、10XMOPS緩沖液1.0μ1、37%甲醛3.5μ1以及去離子甲酰胺ΙΟ.Ομ1混合，配成電泳樣品，65°C孵育5分鐘，冰上冷卻；將電泳槽內(nèi)注入電泳緩沖液，置入甲醛變性瓊脂糖凝膠；電泳樣品內(nèi)加入2μ11OXRNA加樣緩沖液以及0.1ulΕΒ，混合均勻后加入上樣孔內(nèi)，電壓100V條件下電泳30分鐘，紫外線凝膠分析儀下觀測，拍照；當(dāng)檢測證實RNA沒有降解時，進入下一步；第三步將肝癌組織和癌旁組織RNA逆轉(zhuǎn)錄制成cDNA，純化洗滌采用雙熒光間接標(biāo)記法分別對肝癌組織cDNA和癌旁組織cDNA進行標(biāo)記，用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA；分別用MicroconYM-30離心柱對cDNA進行純化(5)將組織總RNA、濃度為2μg/μ1OligodT20-mer以及DEPC處理過的水按比例40yg2μ123μ1混合，總體積為25μ1，65°C孵育5分鐘，冷卻至室溫得到RNA樣品混合液；配制20XdNTP混合液，所述混合液中含有IOmMdATP,IOmMdGTP,IOmMdCTP，4mMdTTP以及6mM氨基修飾的dUTP；將5XRTbuffer10μ1、20XdNTP混合液2.5μ1、0.IMDTT5μ1、superRNaseIN1μ1以及DEPCtreatedwater4.5μ1混合得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液；將RNA樣品混合液與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液混合，加入2μ1濃度為200υ/μ1的逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII，42°C孵育60分鐘，70°C孵育5分鐘，短暫離心，加入2μ1濃度為2U/μ1的RNA酶H，370C孵育30分鐘；加入0.5μ1濃度為0.5ΜEDTA終止反應(yīng)，加入10μIQuickcleanenzymeremoveresin，振搖1分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；將上清液移至0.65μm過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；收集濾液，加入5.5μ13Μ醋酸鈉溶液，137.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，_20°C放置1小時，使cDNA沉淀；4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘；棄上清，用500μ170%的乙醇洗滌沉淀兩次；37°C孵育4-6分鐘；用20μ10.IM碳酸氫鈉溶液重新溶解cDNA；(6)用10μ1去離子蒸溜水將MonoreactiveCy3Dye和MonoreactiveCy5Dye完全溶解，混勻后短暫離心備用；取2ul染料溶液加入用碳酸氫鈉溶解的cDNA溶液中，立即用振蕩器振蕩混勻，用MonoreactiveCy5Dye標(biāo)記腫瘤組織cDNA，用MonoreactiveCy3Dye標(biāo)記癌旁組織cDNA；室溫下于暗處放置1小時，每20分鐘振蕩混勻一次，使染料與氨基修飾過的dUTP充分結(jié)合，從而標(biāo)記cDNA；(7)在標(biāo)記過的cDNA混合液中加入2.5μ13Μ醋酸鈉溶液，62.5μ1冰預(yù)冷的100%乙醇，振蕩混勻，-20°C放置1小時，使標(biāo)記后的cDNA沉淀；4°C以14000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，使沉淀離心至管底；吸去上清液，用800μ170%的乙醇洗滌沉淀；37°C孵育4_6分鐘；用80μ1TE緩沖液將沉淀重新溶解，將Cy5標(biāo)記的肝癌組織cDNA和相對應(yīng)的Cy3標(biāo)記的癌旁組織cDNA溶液混合于同一個離心管中，混合均勻；加入550μ1的PB緩沖液，混合均勻；將溶液移至純化過濾離心柱中，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，棄濾過液，在純化過濾離心柱中加入750μ1的PE緩沖液，室溫下放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘；棄過濾液，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘去除殘留乙醇；在純化過濾離心柱中加入50μ1的EB洗脫液，室溫放置5分鐘，以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘洗脫回收純化后的cDNA；(8)在MicroconYM-30離心柱中加入400μ1pH7.4的TE緩沖液，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘，洗滌離心柱；將洗脫回收cDNA溶液加入YM-30離心柱中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8-10分鐘，至液體剩余體積為20-40μ1；加入400μ1pH7.4的TE緩沖液，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心8-10分鐘洗滌cDNA，重復(fù)3_4次；最后一次洗滌后離心至剩余液體體積小于15μ1，將離心柱倒置于新的離心管中，以9000轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘，回收經(jīng)純化的cDNA；加入pH7.4的TE緩沖液使體積為17μ1；第四步將基因芯片浸入預(yù)雜交液進行預(yù)雜交按下列比例配制預(yù)雜交緩沖液20XSSC15ml,10%SDS0.6mlU0%BSA6ml以及去離子蒸餾水38.4ml；將預(yù)雜交液倒入預(yù)雜交槽中，于42°C水浴箱內(nèi)預(yù)熱10分鐘；將微陣列芯片浸入預(yù)雜交液中預(yù)雜交1小時以上；用雙蒸水洗滌微陣列芯片2分鐘；將微陣列芯片轉(zhuǎn)移至異丙醇液中洗滌2分鐘；于700rpm離心洗滌過的芯片5分鐘，使芯片干燥；將芯片置芯片盒內(nèi)保存；將基因芯片浸入預(yù)雜交液中進行預(yù)雜交1-3小時，用雙蒸水洗滌后以轉(zhuǎn)速700rpm離心5分鐘，使基因芯片干燥；第五步基因芯片雜交將去離子甲酰胺250μ1、20XSSC250μ1以及10%SDSlOy1混合配制2ΧF-雜交緩沖液；震蕩搖勻后42°c保存；將1μ1濃度為ομg/μ1的HumanCOT-IDNAUμ1濃度為8-10μg/μ1的polyA及1μ1濃度為4μg/μ1的yeasttRNA加入純化后的cDNA溶液中，最終雜交樣品體積為20μ1；震蕩混勻、短暫離心，將雜交樣品置100°C加熱器中變性2分鐘，置冰上冷卻1分鐘，短暫離心后置于42°C加熱器內(nèi)5分鐘；加入20μ1的2ΧF-雜交緩沖液至雜交樣品中，混合均勻，短暫離心，最后總體積為40μ1；將雜交樣品加入微陣列芯片及其蓋玻片之間的空間內(nèi)；將芯片放置雜交槽內(nèi)，雜交槽內(nèi)兩端各加入20μ1雙蒸水；蓋嚴(yán)密封雜交槽，將雜交槽放入42°C水浴箱內(nèi)孵育過夜；第六步雜交后芯片的洗滌和掃描分析將雜交芯片浸入含有IXSSC及0.1%SDS的洗滌液中，洗滌芯片2分鐘；在IXSSC洗滌液中洗滌2分鐘；在0.2XSSC洗滌液中洗滌2分鐘；在0.2XSSC洗滌液中洗滌1分鐘；在0.05XSSC洗滌液中洗滌30秒；于700rpm離心芯片5分鐘；用GenePix4000A掃描儀掃描芯片并進行芯片圖像的分析處理。全文摘要本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)風(fēng)險的基因芯片，包括基質(zhì)以及設(shè)置在基質(zhì)上的探針，所述探針由149個基因組成。本發(fā)明的優(yōu)點是采用基因組比較研究，經(jīng)大樣本量獨立驗證，證明該預(yù)測模型可對肝癌患者轉(zhuǎn)移潛能進行準(zhǔn)確預(yù)測和評估，從而可對患者術(shù)后生存和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)進行準(zhǔn)確預(yù)測(即使早期肝癌患者也可進行準(zhǔn)確預(yù)測)，將有助于早期識別或預(yù)測高危患者，對其進行重點監(jiān)測和有效干預(yù)，從而進一步延長腫瘤病人生存。文檔編號C12Q1/68GK101812507SQ20091019995公開日2010年8月25日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日發(fā)明者葉青海,湯釗猷,賈戶亮,欽倫秀申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院