專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)栽 培真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法。
背景技術(shù)：
食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，需要大量的菌種。菌種作為重要的生產(chǎn)資料，對(duì)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起 著重要的作用，從某種意義上甚至可以說(shuō)是決定了栽培的成敗。但是，由于多年形成的分散 生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)方式，菌種生產(chǎn)缺乏規(guī)范，菌種生產(chǎn)和質(zhì)量常出現(xiàn)這樣、那樣的問(wèn)題，隨著產(chǎn)業(yè)的 發(fā)展，問(wèn)題日益突出，甚至成為主產(chǎn)區(qū)的社會(huì)不安定因素。產(chǎn)業(yè)的發(fā)展迫切需要對(duì)菌種進(jìn)行 科學(xué)有效的管理。為了保護(hù)和合理利用食用菌種質(zhì)資源，規(guī)范品種選育及生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、使用 和管理，根據(jù)《中華人民共和國(guó)種子法》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《種子法》)和《中華人民共和國(guó)植物新 品種保護(hù)條例》，農(nóng)業(yè)部制定了《食用菌菌種管理辦法》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《管理辦法》)。在《管理 辦法》第四章菌種質(zhì)量禁止生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)假、劣菌種。但實(shí)際生產(chǎn)中，優(yōu)質(zhì)菌種經(jīng)長(zhǎng)期無(wú)性世代 繁殖，不知不覺(jué)中已經(jīng)發(fā)生了退化。突然有一天，這些“退化”一下子表現(xiàn)出來(lái)。不同食用 菌退化的表現(xiàn)各異，而這些現(xiàn)象，在營(yíng)養(yǎng)菌絲階段從形態(tài)外觀(guān)上通常是無(wú)法區(qū)分的。真姬菇[Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigelow]，又名蟹味菇、海鮮菇、鴻喜菇、玉 蕈、膠玉蘑，隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是一種質(zhì)地脆 嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有多種保健功效的珍稀食用菌，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。真姬菇 是已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化生產(chǎn)的主要食用菌之一，產(chǎn)量?jī)H次于金針菇、杏鮑菇。真姬菇是栽培期較 長(zhǎng)的食用菌，大約需要90 110d。這主要由于真姬菇菌絲培養(yǎng)必須經(jīng)一個(gè)生理成熟期(后 熟期)，才能長(zhǎng)出較好的菇。如果到出菇時(shí)才發(fā)現(xiàn)是劣質(zhì)菌種，對(duì)于一個(gè)日產(chǎn)5噸的中等規(guī) 模食用菌工廠(chǎng)，已經(jīng)生產(chǎn)了 3000000瓶。如上所述，通過(guò)栽培試驗(yàn)檢測(cè)菌種質(zhì)量的方法，雖 然可靠，但對(duì)食用菌工廠(chǎng)時(shí)間就是效益，閑置廠(chǎng)房設(shè)備也是損失。對(duì)于菇農(nóng)來(lái)說(shuō)劣質(zhì)菌種則 是一季減產(chǎn)甚至是絕收。目前，檢測(cè)菌種質(zhì)量，栽培試驗(yàn)是最具說(shuō)服力的方法。該方法主要可以考察菌種是 否均一且性狀穩(wěn)定，對(duì)生長(zhǎng)周期短的食用菌可能還可行。菌種在培養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)和出菇的 過(guò)程中，一方面可從形態(tài)特征、生理生態(tài)特性方面考察菌種質(zhì)量，另一方面可以從畸菇率、 原基發(fā)生期、原基發(fā)生數(shù)量、菇體色澤、產(chǎn)量等方面考察菌種質(zhì)量。退化品種的菌種經(jīng)栽培 后，常表現(xiàn)出菇期不一致、菇潮不明顯、產(chǎn)量下降、對(duì)不良環(huán)境或雜菌的抗性降低等現(xiàn)象，而 老化菌種則表現(xiàn)為出菇提前、菇體變薄等現(xiàn)象。而該檢測(cè)菌種質(zhì)量方法的缺點(diǎn)就是周期長(zhǎng)， 尤其對(duì)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的菌種，使用該方法有待商榷。新近發(fā)展起來(lái)的DNA指紋分析技術(shù)，如RAPD、RFLP等，可以從基因組水平進(jìn)行菌種 鑒別。該方法可以檢測(cè)病菌侵染、雜菌污染、菌株混雜等問(wèn)題，暫且不論該方法是否能解決 菌種質(zhì)量其他問(wèn)題(如退化菌株)，但就其操作的復(fù)雜性，對(duì)缺乏生物技術(shù)知識(shí)的菇農(nóng)來(lái)說(shuō) 也是很難接受的。其他還有一些檢測(cè)菌種質(zhì)量的方法，如形態(tài)特征觀(guān)察、生理特征、生化測(cè) 定等，這些方法一般都需要長(zhǎng)期的栽培經(jīng)驗(yàn)和一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。根據(jù)目前研究，上述方法與菌株質(zhì)量并不存在必然聯(lián)系。因此，無(wú)論是食用菌工廠(chǎng)還是廣大菇農(nóng)都亟需一種快速、簡(jiǎn) 便的評(píng)價(jià)菌種質(zhì)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，它可克 服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)方法操作復(fù)雜、需要長(zhǎng)期的栽培經(jīng)驗(yàn)和一定的生物學(xué)基礎(chǔ)，無(wú)法滿(mǎn)足食 用菌工廠(chǎng)和廣大菇農(nóng)需要的一些不足。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法， 其特征在于所述的評(píng)價(jià)方法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養(yǎng)；b.檢測(cè)菌種質(zhì)量液體培養(yǎng)基的配置；c.液體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌種，并記錄標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)；d.液體培養(yǎng)待評(píng)價(jià)菌種；e.觀(guān)察培養(yǎng)液變化；測(cè)定培養(yǎng)液在615nm處的吸光度，根據(jù)公式D = 1-A615 (菌 種培養(yǎng)液)/A615 (空白培養(yǎng)液)，來(lái)計(jì)算D值；f.將培養(yǎng)液顏色、D值和所建立標(biāo)準(zhǔn)菌種的參數(shù)進(jìn)行比較，檢測(cè)菌種質(zhì)量變化趨勢(shì)。上述菌絲體在用于食用菌生產(chǎn)時(shí)，為保藏菌種菌絲體和用于栽培的各級(jí)菌種；在 用于育種篩選菌株時(shí)，為出發(fā)菌株和各個(gè)衍生菌株。上述接種量可根據(jù)培養(yǎng)基的多少放大或縮小，適當(dāng)正增加接種量可以加速檢測(cè)時(shí) 間，但需要摸索培養(yǎng)基變色的完成時(shí)間即培養(yǎng)天數(shù)。上述液體培養(yǎng)基最終顏色評(píng)價(jià)，黃色一綠色一藍(lán)色，為由好到差的順序。根據(jù)保藏 種和栽培用各級(jí)種比較，向差的方向變化較大的菌種即明顯看出變藍(lán)幅度較大的需要謹(jǐn)慎 使用，或不使用。上述利用分光光度計(jì)在615nm測(cè)定培養(yǎng)液的吸收值并計(jì)算出D值，使用于菌種廠(chǎng) 或工業(yè)化食用菌生產(chǎn)企業(yè)，可以更為精確的檢測(cè)菌種的質(zhì)量細(xì)微變化，當(dāng)D值較保藏菌種 減小30 %，菌種質(zhì)量較差，變化較大，需謹(jǐn)慎使用或棄用。使用時(shí)本發(fā)明克服了傳統(tǒng)通過(guò)栽培試驗(yàn)檢測(cè)菌種質(zhì)量周期長(zhǎng)效率低的缺點(diǎn)，首次 利用正常菌株與退化菌株在液體培養(yǎng)基中具有不同的使合成染料褪色的能力，而退化菌株 的產(chǎn)量和畸形菇數(shù)量與液體培養(yǎng)基顏色成一定的相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)真姬菇劣質(zhì)菌株的有效 鑒別。同時(shí)，為其他食用菌菌種評(píng)價(jià)提供了有效的借鑒。需要說(shuō)明的是這里提出的評(píng)價(jià)方法適用于生產(chǎn)中同一菌種質(zhì)量的相對(duì)優(yōu)劣變化， 該方法不適用于因真假菌種而引起的菌種質(zhì)量問(wèn)題。


圖1為本發(fā)明評(píng)價(jià)方法的結(jié)構(gòu)框2為15、18號(hào)菌株培養(yǎng)液經(jīng)離心去菌絲體后和空白CK的顯色結(jié)果圖3 圖19為1 18號(hào)菌株的全波段掃描結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于所述的檢測(cè)方 法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養(yǎng)；b.檢測(cè)菌種質(zhì)量液體培養(yǎng)基的配置；c.液體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌種，并記錄標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)；d.液體培養(yǎng)待評(píng)價(jià)菌種；e.觀(guān)察培養(yǎng)液變化；測(cè)定培養(yǎng)液在615nm處的吸光度，根據(jù)公式D = 1-A615 (菌 種培養(yǎng)液)/A615 (空白培養(yǎng)液)，來(lái)計(jì)算D值；f.將培養(yǎng)液顏色、D值和所建立標(biāo)準(zhǔn)菌種的參數(shù)進(jìn)行比較，檢測(cè)菌種質(zhì)量變化趨勢(shì)。步驟a中，菌種菌絲體可以是保藏菌種，母種，生產(chǎn)用各級(jí)種，組織分離獲得的菌 種，必須為活體，且可形成子實(shí)體的真姬菇菌種純培養(yǎng)物。步驟b中，檢測(cè)菌種質(zhì)量的液 體培養(yǎng)基各成分的重量百分比為乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉4-5%、溴百里酚藍(lán) 0. 02-0. 03%，余量為蒸餾水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和為100%。步驟c中，標(biāo)準(zhǔn)菌種的選擇為所要評(píng)價(jià)菌種的保藏菌種，將培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖 瓊脂平板的保藏菌種和不同批次菌種的菌塊1cm2，接種于裝有50mL液體檢測(cè)培養(yǎng)基的 150mL三角瓶中，若進(jìn)行靜置培養(yǎng)務(wù)必使接種的菌塊浮于液面，因?yàn)樵撆囵B(yǎng)過(guò)程是需氧的， 如沉入液內(nèi)，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果；若搖床培養(yǎng)沒(méi)有上述要求，接種后，置于25°C環(huán)境培養(yǎng)，搖 床150rpm振蕩培養(yǎng)5天，或靜置培養(yǎng)10天。步驟d中，接種Icm2的菌絲體到IOOmL液體 培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)于23 ^TC,靜置或震蕩均可，150rpm振蕩培養(yǎng)4 5天或靜置培養(yǎng) 10 14天，觀(guān)察液體培養(yǎng)基顏色變化，當(dāng)靜置培養(yǎng)時(shí)，接種務(wù)必使菌塊浮于液體表面，以保 證培養(yǎng)在較短時(shí)間完成。步驟e中，觀(guān)察液體培養(yǎng)基顏色的變化黃色一綠色一藍(lán)色，為菌種質(zhì)量由好到 差。使用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在615nm處的吸光度，通過(guò)D= 1-A615 (菌種培養(yǎng)液)/ A615 (空白培養(yǎng)液)公式可得到各菌種的D值，D值越大質(zhì)量越好，反之，質(zhì)量越差。步驟f中，比較保藏菌種與栽培菌種之間的顏色差異a、若栽培菌種液體培養(yǎng)基 顏色較保藏菌種差異不明顯，則可以使用；b、若栽培菌種液體培養(yǎng)基顏色較保藏菌種明顯 變藍(lán)的趨勢(shì)，則說(shuō)明該批次菌種質(zhì)量不好，產(chǎn)量將下降，畸形菇數(shù)量上升，需謹(jǐn)慎使用，或棄 用；C、記錄了每次檢測(cè)保藏菌種的顏色，如發(fā)現(xiàn)保藏菌種較此前顏色變藍(lán)且幅度較 大，則需要對(duì)保藏菌種進(jìn)行提純復(fù)壯，或者更換菌種；比較保藏菌種與栽培菌種之間D值變 化，當(dāng)D值變低小于等于30%時(shí)，則可以使用；當(dāng)D值變低大于30%時(shí)，則說(shuō)明該批次菌種 質(zhì)量不好，產(chǎn)量將下降，畸形菇數(shù)量上升，需謹(jǐn)慎使用，或棄用；當(dāng)批次間保藏種D值變低大 于30%時(shí)，則需要對(duì)保藏菌種進(jìn)行提純復(fù)壯，或者更換菌種。步驟f中，所謂菌種質(zhì)量變化 趨勢(shì)的檢測(cè)，即預(yù)測(cè)該菌種用于栽培時(shí)，產(chǎn)量、畸形菇數(shù)量相對(duì)原菌種的變化情況。實(shí)施例本發(fā)明首先對(duì)要評(píng)價(jià)菌種的保藏種進(jìn)行檢測(cè)，建立該菌種的參數(shù)基準(zhǔn)(即接種 量，液體培養(yǎng)基量，培養(yǎng)天數(shù)和培養(yǎng)方式)，檢測(cè)培養(yǎng)液變色幅度，或吸光度；根據(jù)上述參數(shù)基準(zhǔn)，比較保藏種不同批次的變化情況，決定是否需要提純復(fù)壯菌種，或更換新菌種；根據(jù) 上述參數(shù)基準(zhǔn)對(duì)栽培各級(jí)種進(jìn)行檢測(cè)，比較保藏種與栽培各級(jí)種培養(yǎng)液變色幅度，或吸光 度，判斷栽培種質(zhì)量是否發(fā)生變化及變化趨勢(shì)，再變化情況決定栽培種質(zhì)量及使用與否。菌種的選擇生產(chǎn)過(guò)程中菌種質(zhì)量檢測(cè)時(shí)，選擇真姬菇菌株見(jiàn)表1(中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供)建立標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系。18號(hào)菌株為上海浦東 天廚菇業(yè)有限公司提供生產(chǎn)用白色真姬菇菌株。表1供試真姬菇菌株
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于所述的檢測(cè)方法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養(yǎng)；b.檢測(cè)菌種質(zhì)量液體培養(yǎng)基的配置；c.液體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌種，并記錄標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)；d.液體培養(yǎng)待評(píng)價(jià)菌種；e.觀(guān)察培養(yǎng)液變化；測(cè)定培養(yǎng)液在615nm處的吸光度，根據(jù)公式D=1_A615(菌種培 養(yǎng)液)/A615 (空白培養(yǎng)液)，來(lái)計(jì)算D值；f.將培養(yǎng)液顏色、D值和所建立標(biāo)準(zhǔn)菌種的參數(shù)進(jìn)行比較，檢測(cè)菌種質(zhì)量變化趨勢(shì)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟a中， 菌種菌絲體可以是保藏菌種，母種，生產(chǎn)用各級(jí)種，組織分離獲得的菌種，必須為活體，且可 形成子實(shí)體的真姬菇菌種純培養(yǎng)物。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟b 中，檢測(cè)菌種質(zhì)量的液體培養(yǎng)基各成分的重量百分比為乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉 4_5%、溴百里酚藍(lán)0. 02-0. 03%，余量為蒸餾水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和為 100%。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟c中， 標(biāo)準(zhǔn)菌種的選擇為所要評(píng)價(jià)菌種的保藏菌種，將培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板的保藏菌種 和不同批次菌種的菌塊Icm2，接種于裝有50mL液體檢測(cè)培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，若進(jìn)行 靜置培養(yǎng)務(wù)必使接種的菌塊浮于液面，因?yàn)樵撆囵B(yǎng)過(guò)程是需氧的，如沉入液內(nèi)，會(huì)影響檢測(cè) 結(jié)果；若搖床培養(yǎng)沒(méi)有上述要求，接種后，置于25°C環(huán)境培養(yǎng)，搖床150rpm振蕩培養(yǎng)5天， 或靜置培養(yǎng)10天。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟d中， 接種Icm2的菌絲體到IOOmL液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)于23 ^°C，靜置或震蕩均可，150rpm 振蕩培養(yǎng)4 5天或靜置培養(yǎng)10 14天，觀(guān)察液體培養(yǎng)基顏色變化，當(dāng)靜置培養(yǎng)時(shí)，接種 務(wù)必使菌塊浮于液體表面，以保證培養(yǎng)在較短時(shí)間完成。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟e中， 觀(guān)察液體培養(yǎng)基顏色的變化黃色一綠色一藍(lán)色，為菌種質(zhì)量由好到差。
7.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟e中， 使用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在615nm處的吸光度，通過(guò)D= 1-A615(菌種培養(yǎng)液)/A615(空 白培養(yǎng)液)公式可得到各菌種的D值，D值越大質(zhì)量越好，反之，質(zhì)量越差。
8.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟f中， 比較保藏菌種與栽培菌種之間的顏色差異a、若栽培菌種液體培養(yǎng)基顏色較保藏菌種差異 不明顯，則可以使用；b、若栽培菌種液體培養(yǎng)基顏色較保藏菌種明顯變藍(lán)的趨勢(shì)，則說(shuō)明該 批次菌種質(zhì)量不好，產(chǎn)量將下降，畸形菇數(shù)量上升，需謹(jǐn)慎使用，或棄用；c、記錄了每次檢測(cè) 保藏菌種的顏色，如發(fā)現(xiàn)保藏菌種較此前顏色變藍(lán)且幅度較大，則需要對(duì)保藏菌種進(jìn)行提 純復(fù)壯，或者更換菌種；比較保藏菌種與栽培菌種之間D值變化，當(dāng)D值變低小于等于30% 時(shí)，則可以使用；當(dāng)D值變低大于30%時(shí)，則說(shuō)明該批次菌種質(zhì)量不好，產(chǎn)量將下降，畸形菇 數(shù)量上升，需謹(jǐn)慎使用，或棄用；當(dāng)批次間保藏種D值變低大于30%時(shí)，則需要對(duì)保藏菌種進(jìn)行提純復(fù)壯，或者更換菌種。
9.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量變化的方法，其特征在于步驟f中， 所謂菌種質(zhì)量變化趨勢(shì)的檢測(cè)，即預(yù)測(cè)該菌種用于栽培時(shí)，產(chǎn)量、畸形菇數(shù)量相對(duì)原菌種的 變化情況。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)真姬菇菌種質(zhì)量的方法，即采用含有活性染料的液體培養(yǎng)基對(duì)真姬菇菌種質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明利用正常菌株與退化菌株具有不同的使合成染料褪色的能力，成功建立了基于該方法的評(píng)價(jià)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)初步真姬菇菌種質(zhì)量的評(píng)價(jià)。采用本方法能夠快速、經(jīng)濟(jì)的評(píng)價(jià)真姬菇菌種質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102080120SQ200910199728
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者馮志勇, 陳明杰, 陳輝, 高君輝 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院