專利名稱：一種抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(epidemic growth factor receptor, EGFR)是表皮生長因 子基因(erbB)家族的一員，在約30%的人體腫瘤中過度表達，尤其是非小細胞型肺癌、頭 頸部鱗狀細胞癌和結(jié)直腸癌等。國內(nèi)外許多研究表明，針對EGFR的抗體可有效地在胞外 通過阻斷配體的結(jié)合來實現(xiàn)對EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)途徑的抑制，對多種由EGFR過度表達或/ 和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細胞癌(80% 100% )，結(jié)直腸癌(25% 77%)，非小細胞型肺癌(40% 80%)等有較好的療效。表皮生長因子受體成為目前研究 較深入且倍受關(guān)注的腫瘤治療靶點之一，應(yīng)用基因工程研制抗EGFR的單克隆抗體，成為腫 瘤免疫治療的研究熱點之一。2004、2006年，美國FDA先后批準(zhǔn)了針對EGFR的鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗 (cetuximab)和全人抗體帕尼單抗(panitumumab)，用于結(jié)直腸癌治療；2005年，抗EGFR的 人源化抗體尼莫珠單抗(nimotuzumab)獲得了我國藥監(jiān)局(SFDA)批準(zhǔn)的一類新藥證書，目 前正在進行II/III期臨床試驗。鼠源單抗在人體應(yīng)用中可產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，從而影響 其功能的發(fā)揮。采用基因工程技術(shù)改造的鼠_人嵌合抗體可大幅度減弱鼠單抗的免疫原 性、延長抗體在體內(nèi)的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介導(dǎo)免疫調(diào)理及ADCC效應(yīng)，進而 增強抗體的生物學(xué)效應(yīng)，但該嵌合抗體結(jié)合抗原的能力低于鼠源抗體98. 7%。大量臨床前 及臨床試驗均已證實西妥昔單抗單藥及聯(lián)合化療/放療具有較好的療效，但簡單CDR移植 往往會引起抗原抗體親和力的下降；帕尼單抗是采用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備的全人抗體，與 嵌合抗體和人源化抗體相比，人源序列接近100 %，大大增強了抗體靶親和力，但該抗體具 有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反應(yīng)更多等缺點。尼莫珠單抗則通過對抗EGFR鼠源單抗 進行人源化改造獲得了人源化抗體，并把抗體的輕、重鏈基因分別連接至不同的表達載體 進行表達，由于輕重鏈表達存在較大差異，往往導(dǎo)致完整抗體分子表達水平極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種可與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合的抗體。本發(fā)明所提供的抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕 鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。上述抗體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70%以上的同源 性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；
所述輕鏈的編碼基因為如下I)、II)或III))所示I)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列5自5'末端起第72bp_102bp位核苷酸具有70%以上的同 源性且編碼所述輕鏈的DNA分子。擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對為如下引物對如下引物對是擴增所述輕鏈編碼基因的。1) 一條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列 表中序列8所示；2) 一條引物序列如序列表中序列9所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列 表中序列10所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于 本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述抗體的方法。本發(fā)明所提供的制備上述抗體的方法，是將上述任一所述編碼基因?qū)胨拗骷毎?中，培養(yǎng)，得到所述抗體。所述方法中，可以是通過重組載體將上述任一所述編碼基因?qū)胨拗骷毎械模?所述重組載體中既含有上述任一所述重鏈可變區(qū)的編碼基因又含有上述任一所述輕鏈的 編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一 啟動子的調(diào)控。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑、 一種抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑或一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物。本發(fā)明所提供的藥物或抑制劑的活性成分為上述抗體和/或任一所述編碼基因。上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備抑制表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述腫瘤細胞具體可為SW480細胞。上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護范圍。所述腫瘤具體可為結(jié)腸癌。本發(fā)明基于抗體抗原晶體結(jié)構(gòu)的建立，通過計算機模擬，對西妥昔單抗抗體的鼠 源可變區(qū)FR表面基因進行突變，使之類似于人抗體FR的型式，從而獲得親和力較西妥昔單 抗顯著提高的抗EGFR人源化抗體。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和 力為5. 09X10-10mol/L)和抑制腫瘤細胞生長遷移能力；而國外市場上常見抗EGFR人-鼠 嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1. 1X10_9M。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結(jié)合，從而 保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的 表達比例更接近1 1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制 備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1輕鏈基因、重鏈可變區(qū)基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。圖2含有本發(fā)明抗體的表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3本發(fā)明抗體的還原型SDS-PAGE檢測。圖4本發(fā)明抗體的免疫印記分析。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因的獲得根據(jù)計算機模擬，以鼠_人嵌合抗體西妥昔單抗氨基酸序列為模板，對其鼠源FR 表面基因進行人源化改造而設(shè)計合成輕鏈氨基酸序列L3和重鏈可變區(qū)氨基酸序列HI ；輕鏈L1 氨基酸序列如序列表中序列1所示；編碼基因序列如序列表中序列4所 示；輕鏈L3 氨基酸序列如序列表中序列2所示；編碼基因序列如序列表中序列5所 示；重鏈可變區(qū)HI 氨基酸序列如序列表中序列3所示；編碼基因序列如序列表中序 列6所示；本發(fā)明抗體由輕鏈L3和重鏈可變區(qū)HI組成，將本發(fā)明抗體記作C5。輕鏈L1的編碼基因和重鏈可變區(qū)H2的編碼基因由人工合成得到。輕鏈L3的編碼基因以輕鏈L1的編碼基因為模板，采用重疊PCR方法，由引物1、 2、5和6擴增，得到輕鏈L3的編碼基因；引物1 :5，-gtggctagcgccgccaccatggacat-3‘ (Nhel)；(序列 7)2 5' -gaattcctaacactctcccctgttga-3' (EcoRI)；(序歹lj 8)5:5，-gctgctaatgccctgacttgcccggcaggcaatgttga-3，；(序列 9)6 5' -gcctgccgggcaagtcagggcattagcagcaacttacactggtatcagcagaaacca-3' ； (j^-^lj 10)將擴增得到的各基因進行凝膠電泳檢測，結(jié)果與預(yù)期大小一致，L和H片段大小分 別約為735bp和770bp(圖1)。M.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A 泳道1為輕鏈基因產(chǎn)物L(fēng)1、泳道 3為輕鏈基因產(chǎn)物L(fēng)3 ；B 泳道1為重鏈可變區(qū)基因產(chǎn)物HI。再將輕鏈L3的編碼基因和重鏈可變區(qū)HI的編碼基因分別克隆入PMD18-T載體 (分別記作重組載體pMD18-T/L3、pMD18-T/Hl)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測 序鑒定，結(jié)果表明得到的基因序列均正確。實施例2、抗體的制備一、重組表達載體的構(gòu)建pIRES雙表達載體購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號為631605 ;pMD18_T表達載體 購自Tacara Bio Company，產(chǎn)品目錄號為:D504CA. pIRES載體自身含有重鏈恒定區(qū)基因。
將重組載體pMD18-T/L3和pIRES雙表達載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(Nhel 和EcoRI)酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段；將輕鏈基因片段L3與載體片段 混勻，在連接試劑的作用下，16°C反應(yīng)12h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測序 鑒定，結(jié)果該重組表達載體中基因的插入方向正確及插入序列正確，記作重組表達載體 PIRES/L3。以pIRES/L3為模板，用Xbal和NotI酶切，回收質(zhì)粒大片段，記作片段1 ；以克隆 有重鏈可變區(qū)基因的PMD18-T/H1為模板，用Zbal和BamHI酶切，回收重鏈可變區(qū)片段，記 作片段2 ；以克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pIRES載體為模板，用BamHI和NottI酶切，回收重 鏈恒定區(qū)片段，記作片段3 ；將片段1、2和片段3連接，得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 挑克隆、提取質(zhì)粒并測序鑒定。結(jié)果表明，得到的重組表達載體的結(jié)構(gòu)正確，插入的基因的 方向及順序正確；抗體的輕重鏈基因共用同一個啟動子，通過IRES序列連接，最終構(gòu)建了 表達質(zhì)粒。將重組表達載體記作PIRES/L3/H1 (圖2)。二、細胞轉(zhuǎn)化及蛋白表達293T細胞(293T人胚腎T細胞)購自購自美國菌種保藏中心(又稱美國模式菌種 收集中心,ATCC)，產(chǎn)品目錄號為CRL-11268 ；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，產(chǎn) 品目錄號為12566014 ；HyQSFM4CH0培養(yǎng)基購自HyClone公司，產(chǎn)品目錄號為SH30518. 02 ； rProtein A層析柱購自購自GE公司，產(chǎn)品目錄號為17-5079-01。將293T細胞按IX 106/ml分別接種于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中、在含10%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02孵箱，培養(yǎng)。取5 y g步驟一中得到的質(zhì)粒pIRES/L3/Hl轉(zhuǎn) 染293T細胞，具體操作參照Lipofectamine 2000的試劑說明。得到重組細胞293T_pIRES/ L3/H1。將重組細胞293T-pIRES/L3/Hl用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6 8h后吸出無 血清培養(yǎng)基，代之以HyQSFM4CH0培養(yǎng)基。相同條件下繼續(xù)共培養(yǎng)84h，間隔12h收取一次 細胞上清，用ELISA法初步檢測抗體的表達。擴大轉(zhuǎn)染體系，收集細胞培養(yǎng)上清4. 5L，調(diào)pH 至6. 0 7. 0，用0. 45 ii m濾膜過濾，再用rProtein A層析柱純化抗體，具體操作參見產(chǎn)品 說明書。ELISA 法1.包被用0. 05M PH9. 0碳酸鹽包被緩沖液將抗體(一抗為山羊抗人IgG)稀釋 至蛋白質(zhì)含量為1 10y g/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日， 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。2.加樣加一定稀釋的待檢樣品0. lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1 小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。3.加酶標(biāo)抗體(二抗為山羊抗人IgG-HRP (山羊抗人IgG_辣根過氧化物酶))于 各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0. lml。37°C孵育0. 5 1小 時，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0. lml，37°C 10 30分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + ”、“-”號表示。也可測0D值 在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔0D 值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2. 1倍，即為陽性。試劑(1)包被緩沖液(PH9. 60. 05M 碳酸鹽緩沖液):Na2C03 1. 59 克，NaHC032. 93 克，加 蒸餾水至1000ml。(2)洗滌緩沖液(PH7. 4PBS) 0. 15M :KH2P04 0. 2 克，Na2HP04 12H202. 9 克，NaCl 8. 0 克，KC1 0. 2 克，Tween-20 0. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml。(3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血 清等血清與洗滌液配成5 10%使用。(4)終止液(2M H2S04)蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。用rProtein A層析柱純化抗體純化介質(zhì)Hi Trap rProtein A FF，5ml，購自GE 公司，目錄號17-5079-01，詳細使用說明書請參閱其公司提供的說明書。磷酸鈉鹽緩沖液(結(jié)合緩沖液)用作ProteinA純化的結(jié)合緩沖液。配制方法為 取 lMNa2HP0457. 7ml 和 lMNaH2P04 42 . 3ml 混勻，即為 0. 1M pH7. 0 的磷酸鈉鹽緩沖液 100ml， 再用蒸餾水稀釋至20Mm備用。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(洗脫緩沖液)用作ProteinA純化的洗脫緩沖液。配 制方法為取0. 1M檸檬酸186ml和0. 1M檸檬酸鈉14ml混勻，即為0. 1M pH3. 0的檸檬酸鹽 緩沖液200ml。操作1)清洗，用1M NaOH和ddH20先后清洗管道，將小濾器用0. 1M NaOH煮沸l(wèi)Omin后 再用ddH20浸泡1 2min ；2)設(shè)定程序，連接rProtein A親和層析柱；3)用20mM結(jié)合緩沖液(pH7. 0)平衡層析柱；4)將已制備好的細胞上清以1 2ml/min的流速上樣；細胞上清制備以12000g 離心15分鐘，取出上清，經(jīng)過0. 22um硝酸纖維素濾膜過濾除菌。5)上樣將要結(jié)束時用1M洗脫緩沖液(pH3. 0)洗脫目的蛋白；6)收集蛋白，用Trise堿(pH9. 0)將其pH調(diào)至7. 0，電泳檢測；7)按步驟1)清洗管道和小濾器。三、蛋白檢測山羊抗人IgG-HRP抗體購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為(046K4801)；山羊抗鼠 IgGl 購自 SBA(Southern Biotechnology Associates, Inc.)，產(chǎn)品目錄號為(1010-05)；SDS-PAGE 取15 yl洗脫液(即抗體溶液)在12%凝膠上進行還原SDS-PAGE電 泳，用考馬斯亮蘭R-250染色。結(jié)果顯示，純化所得抗體的重鏈與輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為25X 103、 50X 103(圖3、圖4)，與預(yù)期結(jié)果一致。圖3中，泳道4表示本發(fā)明抗體C5，泳道3表示對 照西妥昔單抗。免疫印跡分析另取洗脫液在12%凝膠上進行還原SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸 纖維素膜上，取出膜用封閉液(含有5%脫脂奶粉的1XPBST)在室溫封閉2h，用1 5000稀釋的羊抗人IgG-HRP抗體與之孵育2h (室溫)，再用1 XPBST洗膜3次。最后用ECL顯 色，用X線片進行曝光。同時再做加入抗鼠IgGl的對照。圖4中，泳道5表示本發(fā)明抗體 C5 ；泳道2表示鼠源單抗陰性對照；泳道4表示陽性對照西妥昔單抗。免疫印記(12% )分析表明，該抗體可與羊抗人IgG特異性結(jié)合。但是也出現(xiàn)了部 分與抗人IgG 二抗反應(yīng)的一些非特異雜交帶(包括商品化的西妥昔單抗)，這可能是純化中 有部分非全長的重鏈片段混合所至。但是上述結(jié)果不影響抗體親和力的評價。上述抗體均 不與抗鼠IgGl抗體反應(yīng)。由于本抗體的輕鏈和重鏈在一個表達載體上，成比例表達，自動組成含兩條輕鏈 和重鏈的完整抗體。實施例3、抗體的功能檢測
EGFR 蛋白購自(Sigma)，產(chǎn)品目錄號為(E2645-500UN)。一、Biacore檢測抗體與抗原的結(jié)合能力用Biacore3000設(shè)備測定抗體C5與EGFR的親和力。配制不同pH值(4. 0,4. 5， 5.0和5. 5)的IOmmol/L NaAc稀釋EGFR蛋白，在CM5芯片上做預(yù)濃縮，選擇最適pH值的 NaAc稀釋蛋白。將純化的抗體(即實施例2中步驟二得到的洗脫液)共價偶聯(lián)于CM5傳感 芯片上，流動相為HBS-EP (ρΗ7· 4)，流速20 μ 1/min,取五種濃度的抗體C5 (0，10. 55，21. 1、 42. 2和84. 4nmol/L)與EGFR蛋白結(jié)合親和力的檢測。親和力用Biacore3000附帶軟件計 算。同時以西妥昔單抗為對照。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果顯示C5對抗原EGFR具有良好的結(jié)合活性(親和力為5. 09 X 1 O^mol/L)。西 妥昔單抗的親和力為1·1Χ10_9Μ。二、腫瘤細胞侵襲實驗SW480細胞購自美國菌種保藏中心(又稱美國模式菌種收集中心，ATCC)，產(chǎn)品目 錄號為(ATCC Number :CCL-228 )；西妥昔單抗抗體購自德國默克里昂制藥公司(原產(chǎn)地 英文商品名ERBITUX;原產(chǎn)地英文藥品名=Cetuximab ；中文參考商品譯名愛必妥；分子 結(jié)構(gòu)名西妥昔單抗；產(chǎn)地國家德國；生產(chǎn)廠家德國默克里昂制藥公司)。用RPMI1640培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司，目錄號為31800-022)培養(yǎng)SW480細 胞。用無血清RPMI1640培養(yǎng)基水化侵襲室(invasion chamber)，孵育2h (37°C，5% CO2)。 棄無血清 RPMI1640，在侵襲室(BD BioCoat Matrigel InvasionChamber 購自 BD 公司， 產(chǎn)品目錄號為354480)的孔室加入750 μ 1 RPMI 1640 (含10%血清)；在插入(insert)室 中加入475μ 1 RPMI1640(含血清)，然后向其中加入25μ 1消化的SW480細胞(細胞 數(shù)> 105/500 μ 1)，最后分別向插入室中加入陰性對照PBS和本發(fā)明抗體，每個樣品均有兩 個復(fù)孔，抗體終濃度均為lOOng/ml。孵育24h后，將未能穿透侵襲盒基底膜的細胞用無菌棉 簽擦去；穿透基底膜的細胞固定、染色、室溫晾干后，光鏡計數(shù)。在100倍顯微鏡下計算每個插入室中樣品的相應(yīng)細胞數(shù)。再用Durmett t3 (雙 側(cè)分析)檢驗將抗體組與PBS組比較，若結(jié)果為P < 0. 05，可認為兩種處理效果差異有統(tǒng)計
學(xué)意義。運用SPSS12. 0統(tǒng)計軟件對細胞侵襲實驗數(shù)據(jù)進行單因素4水平方差分析，單因素 4水平方差分析結(jié)果顯示FaM(W4) = 2. 82, P < 0. 05，故可認為細胞數(shù)不等或不完全相等。
Dunnett t3 (雙側(cè)分析，下文簡稱t)檢驗結(jié)果(表1)顯示PBS組與C5組的t值 為1. 16，P值大于0. 05，表明抗EGFR抗體C5對SW480腫瘤細胞的侵襲有一定的抑制作用， 但與對照組相比，差異不顯著。表1細胞侵襲實驗的Durmett，s t3檢測結(jié)果
0104]注與PBS組對比，***P =0. 928，***t ==1. 16。0105]序列表0106]<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所0107]<120> 一種抗體及其制備方法與應(yīng)用0108]<160>100109]<210>10110]<211>2140111]<212>PRT0112]<213>人工序列0113]<220>0114]<223>0115]<400>10116]Glu LeuValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAla SerValGly0117]1510150118]Asp ArgValAsnlieAlaCysArgAlaSerGinSerlie GluThrAsn0119]2025300120]Leu HisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProArg LeuLeulie0121]3540450122]Lys TyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArg PheSerGly0123]5055600124]Ser GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer LeuGinPro0125]657075800126]Glu AspPheAlalieTyrTyrCysGinGinAsnAsnAsn TrpProThr0127]8590950128]Thr PheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLysArgThr ValAlaAla0129]1001051100130]Pro SerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu LysSerGly0131]1151201250132]ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro ArgGluAla0133]1301351400134]LysValGinTrpLys ValAspAsnAlaLeuGinSerGly AsnSerGin0135]1451501551600136]GluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyr SerLeuSer0137]1651701750138]SerThrLeuThrLeuSerLysAla AspTyrGluLys His LysValTyr0139]1801851900140]AlaCysGluValThrHisGinGly LeuSerSerProVal ThrLysSer0141]1952002050142]PheAsn ArgGlyGluCys0143]2100144]<210>20145]<211>2140146]<212>PRT0147]<213>人工序列0148]<220>0149]<223>0150]<400>20151]GluLeuValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAla SerValGly0152]1510150153]AspArgValAsnlieAla CysArgAlaSerGinGlylie SerSerAsn0154]2025300155]LeuHisTrpTyrGinGin LysProGlyLysAlaProArg LeuLeulie0156]3540450157]LysTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArg PheSerGly0158]5055600159]SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer LeuGinPro0160]657075800161]GluAspPheAlalieTyrTyrCysGinGinAsnAsnAsn TrpProThr0162]8590950163]ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLysArgThr ValAlaAla0164]1001051100165]ProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu LysSerGly0166]1151201250167]ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro ArgGluAla0168]1301351400169]Lys ValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGly AsnSerGin0170]145150155160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165170175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180185190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195200205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210>3<211>223<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>3Gln Val Lys Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly151015Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser lie Gly Asn202530Tyr Gly lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp354045Met Gly Gly lie Trp Ser Gly Gly Asn Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe505560Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65707580Met Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys859095Ala Arg Val Gly Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Asp Val Trp Gly Gln100105110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115120125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130135140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145150155160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165170175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180185190
<213>人工序列<220〉<223><400>9gctgctaatg ccctgacttg cccggcaggc aatgttga38<210>10<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>10gcctgccggg caagtcaggg cattagcagc aacttacact ggtatcagca gaaacca5權(quán)利要求
一種抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.權(quán)利要求1所述抗體的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下 1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70%以上的同源性且 編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；所述輕鏈的編碼基因為如下I)、II)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列5自5'末端起第72bp-102bp位核苷酸具有70%以上的同源性 且編碼所述輕鏈的DNA分子。
4.擴增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下引物對1)一條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中 序列8所示；2)一條引物序列如序列表中序列9所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中 序列10所示。
6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。
7.一種制備權(quán)利要求1所述抗體的方法，是將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗?細胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，是通過重組載體將權(quán)利要求 2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷毎械?；所述重組載體中既含有權(quán)利要求2或3所述重鏈 可變區(qū)的編碼基因又含有權(quán)利要求2或3所述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼 基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調(diào)控。
9.一種抑制表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細胞侵襲的抑制 劑或一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1中所述抗體和/或權(quán)利要 求2或3所述編碼基因。
10.權(quán)利要求1中所述抗體和/或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在制備抑制表皮生長 因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用、權(quán)利要求1中所述抗體和/或權(quán)利要求2或3 所述編碼基因在制備抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用或權(quán)利要求1中所述抗體和/或 權(quán)利要求2或3所述編碼基因在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗體及其制備方法與應(yīng)用。該抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和力為5.09×10-10mol/L)和抑制腫瘤細胞生長遷移能力；而國外市場上常見抗EGFR人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1.1×10-9M。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達輕鏈和重鏈可變區(qū)。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/15GK101875696SQ20091023780
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者戴維·威孚, 曹誠, 米歇爾·瑞奇韋茲, 靳彥文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所