專利名稱：一種針對表皮生長因子受體的抗體及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種針對表皮生長因子受體的抗體及其編碼基因與應用。
背景技術：
表皮生長因子受體(印idemic growth factor rec印tor， EGFR)是表皮生長因子基因(erbB)家族的一員，在約30%的人體腫瘤中過度表達，尤其是非小細胞型肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和結直腸癌等。國內外許多研究表明，針對EGFR的抗體可有效地在胞外通過阻斷配體的結合來實現對EGFR信號轉導導途徑的抑制，對多種由EGFR過度表達或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細胞癌(80% 100% )，結直腸癌(25% 77%)，非小細胞型肺癌(40% 80%)等有較好的療效。表皮生長因子受體成為目前研究較深入且倍受關注的腫瘤治療靶點之一，應用基因工程研制抗EGFR的單克隆抗體，成為腫瘤免疫治療的研究熱點之一。 2004 、 2006年，美國FDA先后批準了針對EGFR的鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗(cetuximab)和全人抗體帕尼單抗(panit咖咖ab)，用于結直腸癌治療；2005年，抗EGFR的人源化抗體尼莫珠單抗(nimotuzumab)獲得了我國藥監(jiān)局(SFDA)批準的一類新藥證書，目前正在進行II/III期臨床試驗。鼠源單抗在人體應用中可產生人抗鼠抗體反應，從而影響其功能的發(fā)揮。采用基因工程技術改造的鼠-人嵌合抗體可大幅度減弱鼠單抗的免疫原性、延長抗體在體內的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介導免疫調理及ADCC效應，進而增強抗體的生物學效應，但該嵌合抗體結合抗原的能力低于鼠源抗體98. 7%。大量臨床前及臨床試驗均已證實西妥昔單抗單藥及聯合化療/放療具有較好的療效，但簡單CDR移植往往會引起抗原抗體親和力的下降；帕尼單抗是采用轉基因小鼠技術制備的全人抗體，與嵌合抗體和人源化抗體相比，人源序列接近100%，大大增強了抗體靶親和力，但該抗體具有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反應更多等缺點。尼莫珠單抗則通過對抗EGFR鼠源單抗進行人源化改造獲得了人源化抗體，并把抗體的輕、重鏈基因分別連接至不同的表達載體進行表達，由于輕重鏈表達存在較大差異，往往導致完整抗體分子表達水平極低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種可與表皮生長因子受體(EGFR)結合的抗體。 本發(fā)明所提供的抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕
鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。 上述抗體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下1) 、2)或3)所示 1)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；
3)與序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70X以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；
3
所述輕鏈的編碼基因為如下i)、n)或III)所示 I)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子； II)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；
III)與序列表中序列5自5'末端起第72bp-102bp位核苷酸具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子。 擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述引物對為如下引物對如下引物對是擴增所述輕鏈編碼基因的。 1) —條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列
表中序列8所示； 2) —條引物序列如序列表中序列9所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列10所示。 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述抗體的方法。 本發(fā)明所提供的制備上述抗體的方法，是將上述任一所述編碼基因導入宿主細胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。 所述方法中，可以是通過重組載體將上述任一所述編碼基因導入宿主細胞中的；所述重組載體中既含有上述任一所述重鏈可變區(qū)的編碼基因又含有上述任一所述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調控。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制表皮生長因子受體信號轉導途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑或一種預防和/或治療腫瘤的藥物。 本發(fā)明所提供的藥物或抑制劑的活性成分為上述抗體和/或任一所述編碼基因。
上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備抑制表皮生長因子受體信號轉導途徑的抑制劑中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。 上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述腫瘤細胞具體可為SW480細胞。 上述抗體和/或任一所述編碼基因在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述腫瘤具體可為結腸癌。 本發(fā)明基于抗體抗原晶體結構的建立，通過計算機模擬，對西妥昔單抗抗體的鼠源可變區(qū)FR表面基因進行突變，使之類似于人抗體FR的型式，從而獲得親和力較西妥昔單抗顯著提高的抗EGFR人源化抗體。實驗結果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結合活性(親和力為6. 13X10—1QM)和抑制腫瘤細胞生長遷移能力；而國外市場上常見抗EGFR人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1. 1X10—9M。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結合，從而保證了其抗腫瘤效應。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達比例更接近l : l，產生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預防和/或治療腫瘤的領域將有廣闊的應用前景。


圖1輕鏈基因、重鏈可變區(qū)基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖。
圖2含有本發(fā)明抗體的表達載體的結構示意圖。
圖3本發(fā)明抗體的還原型SDS-PAGE檢測。
圖4本發(fā)明抗體的免疫印記分析。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 實施例1、抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因的獲得 根據計算機模擬，以鼠_人嵌合抗體西妥昔單抗氨基酸序列為模板，對其鼠源FR表面基因進行人源化改造而設計合成輕鏈氨基酸序列L2和重鏈可變區(qū)氨基酸序列HI ;
輕鏈LI :氨基酸序列如序列表中序列1所示；編碼基因序列如序列表中序列4所示； 輕鏈L2 :氨基酸序列如序列表中序列2所示；編碼基因序列如序列表中序列5所示； 重鏈可變區(qū)HI :氨基酸序列如序列表中序列3所示；編碼基因序列如序列表中序列6所示； 本發(fā)明抗體由輕鏈L2和重鏈可變區(qū)HI組成，將本發(fā)明抗體記作C3。 輕鏈LI的編碼基因和重鏈可變區(qū)H2的編碼基因由人工合成得到。 輕鏈L2的編碼基因以輕鏈L1的編碼基因為模板，采用重疊PCR方法，由引物1、
2、3和4擴增，得到輕鏈L2的編碼基因； 弓|物1 :5， _gtg￡￡^g￡gccgccaccatggacat_3， (Nhe I);(序列7)
2 :5， -gaattcctaacactctcccctgttga_3， (EcoR I);(序歹lj 8)
3 :5， -ggattcaataccctgacttgcccggcaggcaat-3，；(序列9) 4 :5' -attgcctgccgggcaagtcagggtattgaatccaacttacactggtatcagcagaaacca-3' s(序列10) 將擴增得到的各基因進行凝膠電泳檢測，結果與預期大小一致，L和H片段大小分別約為735bp和770bp(圖1) 。 M.相對分子質量標準；A :泳道1為輕鏈基因產物Ll、泳道2為輕鏈基因產物L2 ;B :泳道1為重鏈可變區(qū)基因產物Hl。 再將輕鏈L2的編碼基因和重鏈可變區(qū)HI的編碼基因分別克隆入pMD18-T載體(分別記作重組載體pMD18-T/L2、pMD18-T/Hl)，轉化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質粒并測序鑒定，結果表明得到的基因序列均正確。
實施例2、抗體的制備
—、重組表達載體的構建pIRES雙表達載體購自Clontech公司，產品目錄號為631605 ;pMD18-T表達載體購自Takara Bio Company,產品目錄號為:D504CA. pIRES載體自身含有重鏈恒定區(qū)基因。
將重組載體pMD18-T/L2和pIRES雙表達載體分別用相應的限制性內切酶(NheI和EcoR I)酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段；將輕鏈基因片段L2與載體片段混勻，在連接試劑的作用下，16t:反應12h。轉化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質粒并測 序鑒定，結果該重組表達載體中基因的插入方向正確及插入序列正確，記作重組表達載體 pIRES/L2。 以pIRES/L2為模板，用Xba I和Not I酶切，回收質粒大片段，記作片段1 ;以克隆 有重鏈可變區(qū)基因的pMD18-T/Hl為模板，用Xba I和BamH I酶切，回收重鏈可變區(qū)片段，記 作片段2 ;以克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pIRES載體為模板，用BamH I和Not I酶切，回收重 鏈恒定區(qū)片段，記作片段3 ;將片段1、2和片段3連接，得到重組載體，轉化大腸桿菌DH5a， 挑克隆、提取質粒并測序鑒定。結果表明，得到的重組表達載體的結構正確，插入的基因的 方向及順序正確；抗體的輕重鏈基因共用同一個啟動子，通過IRES序列連接，最終構建了 表達質粒。將重組表達載體記作pIRES/L2/Hl (圖2)。
二、細胞轉化及蛋白表達 293T細胞(293T人胚腎T細胞)購自購自美國菌種保藏中心(又稱美國模式菌種 收集中心，ATCC),產品目錄號為CRL-11268 :Lioofectamine 2000購自Invitrogen公司，產 品目錄號為12566014 ;HyQSFM4CH0培養(yǎng)基購自HyClone公司，產品目錄號為SH30518. 02 ; rProtein A層析柱購自購自GE公司，產品目錄號為17-5079-01。 將293T細胞按IX 107ml分別接種于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中、在含10%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基中，37°C 、5% C02孵箱，培養(yǎng)。取5 y g步驟一中得到的質粒pIRES/L2/Hl轉 染293T細胞，具體操作參照Lipofectamine 2000的試劑說明。得到重組細胞293T-pIRES/ L2/H1。 將重組細胞293T-pIRES/L2/Hl用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6 8h后吸出無 血清培養(yǎng)基，代之以HyQSFM4CH0培養(yǎng)基。相同條件下繼續(xù)共培養(yǎng)84h，間隔12h收取一次 細胞上清，用ELISA法初步檢測抗體的表達。擴大轉染體系，收集細胞培養(yǎng)上清4. 5L，調pH 至6. 0 7. 0，用0. 45 ii m濾膜過濾，再用rProtein A層析柱純化抗體，具體操作參見產品 說明書。 ELISA^去 1.包被用0. 05M0碳酸鹽包被緩沖液將抗體( 一抗為山羊抗人IgG)稀釋 至蛋白質含量為1 10y g/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加O. lml，4。C過夜。次日， 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2.加樣加一定稀釋的待檢樣品0. lml于上述已包被之反應孔中，置37t:孵育1 小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 3.加酶標抗體(二抗為山羊抗人IgG-HRP(山羊抗人IgG-辣根過氧化物酶))于 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0. lml。 37t:孵育0. 5 1小 時，洗滌。 4.加底物液顯色于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0. lml，37°C 10 30分鐘。 5.終止反應于各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml。 6.結果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果反應孔內顏色越深，陽性程 度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以"+ "、"-"號表示。也可測0D值 在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔0D值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2. 1倍，即為陽性。
試劑 (1)包被緩沖液(PH9. 60. 05M碳酸鹽緩沖液):Na2C03 1. 59克，NaHC032. 93克，加 蒸餾水至1000ml 。 (2)洗滌緩沖液(PH7. 4PBS) :0. 15M :KH2P04 0. 2克，Na2HP04 12H202. 9克，NaCl 8. 0克，KC1 0. 2克，Tween-200. 05% 0. 5ml，加蒸餾水至1000ml。 (3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血 清等血清與洗滌液配成5 10%使用。 (4)終止液(2M H2S04):蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml 。
用rProtein A層析柱純化抗體純化介質HiTrap rProtein A FF，5ml，購自GE 公司，目錄號17-5079-01，詳細使用說明書請參閱其公司提供的說明書。
操作 1)清洗，用1M NaOH和ddH20先后清洗管道，將小濾器用0. 1M NaOH煮沸l(wèi)Omin后 再用ddH20浸泡1 2min ; 2)設定程序，連接rProtein A親和層析柱；
3)用20mM結合緩沖液(pH7. 0)平衡層析柱； 4)將已制備好的細胞上清以1 2ml/min的流速上樣；細胞上清制備以12000g 離心15分鐘，取出上清，經過0. 22um硝酸纖維素濾膜過濾除菌。
5)上樣將要結束時用1M洗脫緩沖液(pH3. 0)洗脫目的蛋白；
6)收集蛋白，用Trise堿(pH9. 0)將其pH調至7. 0，電泳檢測；
7)按步驟1)清洗管道和小濾器。 磷酸鈉鹽緩沖液(結合緩沖液)用作ProteinA純化的結合緩沖液。配制方法 為取1M Na2HP04 57. 7ml和1M NaH2P04 42 . 3ml混勻，即為0. 1M pH7. 0的磷酸鈉鹽緩沖液 100ml ，再用蒸餾水稀釋至20Mm備用。 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(洗脫緩沖液)用作ProteinA純化的洗脫緩沖液。配 制方法為取0. IM檸檬酸186ml和0. IM檸檬酸鈉14ml混勻，即為0. 1M pH3. 0的檸檬酸鹽 緩沖液200ml 。
三、蛋白檢測 山羊抗人IgG-HRP抗體購自Sigma公司，產品目錄號為(046K4801);山羊抗鼠 IgGl購自SBA(Southern Biotechnology Associates, Inc.)，產品目錄號為(1010-05);
SDS-PAGE :取15 洗脫液(即抗體溶液)在12%凝膠上進行還原SDS-PAGE電 泳，用考馬斯亮蘭R-250染色。 結果顯示，純化所得抗體的重鏈與輕鏈的相對分子質量分別為25X 103、 50X 103(圖3、圖4)，與預期結果一致。圖3中，泳道2表示本發(fā)明抗體C3，泳道3表示對 照西妥昔單抗。 免疫印跡分析另取洗脫液在12%凝膠上進行還原SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸 纖維素膜上，取出膜用封閉液(含有5X脫脂奶粉的lXPBST)在室溫封閉2h，用l : 5000 稀釋的羊抗人IgG-HRP抗體與之孵育2h(室溫)，再用1XPBST洗膜3次。最后用ECL顯 色，用X線片進行曝光。同時再做加入抗鼠IgGl的對照。圖4中，泳道3表示本發(fā)明抗體C3 ;泳道2表示鼠源單抗陰性對照；泳道4表示陽性對照西妥昔單抗。 免疫印記(12% )分析表明，該抗體可與羊抗人IgG特異性結合。但是也出現了部 分與抗人IgG二抗反應的一些非特異雜交帶(包括商品化的西妥昔單抗)，這可能是純化中 有部分非全長的重鏈片段混合所至。但是上述結果不影響抗體親和力的評價。上述抗體均 不與抗鼠IgGl抗體反應。 由于本抗體的輕鏈和重鏈在一個表達載體上，成比例表達，自動組成含兩條輕鏈
和重鏈的完整抗體。 實施例3、抗體的功能檢測 EGFR蛋白購自(Sigma)，產品目錄號為(E2645-500UN)。
—、 Biacore檢測抗體與抗原的結合能力 用Biacore3000設備測定抗體C3與EGFR的親和力。配制不同pH值(4. 0， 4. 5， 5.0和5.5)的10mmol/L NaAc稀釋EGFR蛋白，在CM5芯片上做預濃縮，選擇最適pH值的 NaAc稀釋蛋白。將純化的抗體(即實施例2中步驟二得到的洗脫液)共價偶聯于CM5傳感 芯片上，流動相為HBS-EP (pH7. 4)，流速20 y 1/min，取五種濃度的抗體C3 (0， 10. 55， 21. 1、 42. 2和84. 4nmol/L)與EGFR蛋白結合親和力的檢測。親和力用Biacore3000附帶軟件計 算。同時以西妥昔單抗為對照。
實驗設3次重復，結果取平均數。 結果顯示C3對抗原EGFR具有良好的結合活性(親和力為6. 13 X 10—"mol/L)。西 妥昔單抗的親和力為1. 1X10—9M。
二、腫瘤細胞侵襲實驗 SW480細胞購自美國菌種保藏中心(又稱美國模式菌種收集中心，ATCC)，產品目 錄號為(ATC(T Number :CCL-228TM);西妥昔單抗抗體購自德國默克里昂制藥公司(原產地 英文商品名ERBITUX;原產地英文藥品名Cetuximab ;中文參考商品譯名愛必妥；分子 結構名西妥昔單抗；產地國家德國；生產廠家德國默克里昂制藥公司)。
用RPMI1640培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司，目錄號為31800-022)培養(yǎng)SW480細 胞。用無血清RPMI1640培養(yǎng)基水化侵襲室(invasion chamber)，孵育2h (37°C ， 5% C02)。 棄無血清RPMI1640，在侵襲室(BD BioCoat Matrigel InvasionChamber購自BD公司， 產品目錄號為354480)的孔室加入750iU RPMI 1640(含10%血清)；在插入(insert)室 中加入475iU RPMI1640(含1%血清)，然后向其中加入25iU消化的SW480細胞(細胞 數> 107500 iU)，最后分別向插入室中加入陰性對照PBS和本發(fā)明抗體，每個樣品均有兩 個復孔，抗體終濃度均為100ng/ml。孵育24h后，將未能穿透侵襲盒基底膜的細胞用無菌棉 簽擦去；穿透基底膜的細胞固定、染色、室溫晾干后，光鏡計數。 在100倍顯微鏡下計算每個插入室中樣品的相應細胞數。再用Du皿ett t3 (雙側 分析)檢驗將抗體組與PBS組比較，若結果為P < 0. 05，可認為兩種處理效果差異有統(tǒng)計學 意義。 運用SPSS12. 0統(tǒng)計軟件對細胞侵襲實驗數據進行單因素4水平方差分析，單因素 4水平方差分析結果顯示F。.。5(3,44) = 2 . 82，P < 0. 05，故可認為細胞數不等或不完全相等。
Du皿ett t3 (雙側分析，下文簡稱t)檢驗結果(表1)顯示PBS組與C3組的t值 為3. 43，且P值小于0. 01，表明抗EGFR抗體C3對SW480腫瘤細胞的侵襲具有一定的抑制
8作用。 表1細胞侵襲實驗的D皿nett' s t3檢測結果
H n 細胞平均數(個)
PBS組 E 86± 16,222~~
C3組 12 56±5.0416**注與PBS組對比，林P=0. 003， **t = 3. 43。序列表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所〈120〉 一種針對表皮生長因子受體的抗體及其編碼基因與應用〈160>10〈210>1〈211>214〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1Glu Leu ValMet ThrGin Ser Pro Ser SerLeuSerAlaSerVal Gly151015Asp Arg ValAsn lieAla Cys Arg Ala SerGinSerlieGluThr Asn202530Leu His TrpTyr GinGin Lys Pro Gly LysAlaProArgLeuLeu lie354045Lys Tyr ThrSer ArgLeu His Ser Gly ValProSerArgPheSer Gly5055 60Ser Gly SerGly ThrAsp Phe Thr Leu ThrlieSerSerLeuGin Pro65707580Glu Asp PheAla lieTyr Tyr Cys Gin GinAsnAsnAsnTrpPro Thr85 9095Thr Phe GlyGly Gly Thr Lys Val Glu lieLysArgThrValAla Ala100105110Pro Ser ValPhe liePhe Pro Pro Ser AspGluGinLeuLysSer Gly115120125Thr Ala SerVal ValCys Leu Leu Asn AsnPheTyrProArgGlu Ala130135 140 9
Lys Val GinTrp Lys Val Asp AsnAla LeuGinSer Gly AsnSerGin145150155160Glu Ser ValThrGlu Gin Asp Ser Lys AspSerThr Tyr SerLeuSer165 170175Ser Thr LeuThrLeu Ser Lys Ala Asp TyrGluLys His LysValTyr180185190Ala Cys GluValThr His Gin Gly Leu SerSerPro Val ThrLysSer195200205Phe Asn ArgGlyGlu Cys210〈210>2〈211>214〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2Glu Leu ValMetThr Gin Ser ProSer SerLeuSer Ala SerValGly151015Asp Arg ValAsnlie Ala Cys ArgAla SerGinAsp lie SerThrAsn202530Leu His TrpTyrGin Gin Lys ProGly LysAlaPro Arg LeuLeulie354045Lys Tyr ThrSerArg Leu His SerGly ValProSer Arg PheSerGly505560Ser Gly SerGlyThr Asp Phe ThrLeu ThrlieSer Ser LeuGinPro65707580Glu Asp PheAlalie Tyr Tyr CysGin GinAsnAsn Asn TrpProThr859095Thr Phe GlyGlyGly Thr Lys ValGlu lieLysArg Thr ValAlaAla100105110Pro Ser ValPhelie Phe Pro ProSer AspGluGin Leu LysSerGly115120125Thr Ala SerValVal Cys Leu LeuAsn AsnPheTyr Pro ArgGluAla130135140Lys Val GinTrpLys Val Asp AsnAla LeuGinSer Gly AsnSerGin145150155160Glu Ser ValThrGlu Gin Asp SerLys AspSerThr Tyr SerLeuSer165 170175
Ser ThrLeuThrLeuSer Lys Ala Asp TyrGluLysHisLysValTyr180185190Ala Cys GluValThrHisGinGly Leu SerSerProValThrLysSer195200205Phe AsnArgGlyGluCys210〈210>3〈211>223〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3Gin ValLysLeuLeuGluGinSer Gly AlaGluValLysLysProGly151015Ala SerValLysValSerCysLys Ala SerGlyPheSerlieGlyAsn202530Tyr GlylieHisTrpValArgGin Ala ProGlyGinArgLeuGluTrp354045Met GlyGlylieTrpSerGlyGly Asn AlaAspTyrAlaGinLysPhe505560Gin GlyArgValThrlieThrArg Asp ThrSerAlaThrThrAlaTyr65707580Met GlyLeuSerSerLeuArgPro Glu AspThrAlaValTyrTyrCys859095Ala ArgValGlyThrTyrTyrAsp Tyr GluPheAspValTrpGlyGin100105110Gly ThrLeuValThrValSerSer Ala SerThrLysGlyProSerVal115120125Phe ProLeuAlaProSerSerLys Ser ThrSerGlyGlyThrAlaAla130135140Leu GlyCysLeuValLysAspTyr Phe ProGluProValThrValSer145150155160Trp AsnSerGlyAlaLeuThrSer Gly ValHisThrPheProAlaVal165170175Leu GinSerSerGlyLeuTyrSer Leu SerSerValValThr Val Pro
180185190Ser SerSerLeuGlyThrGinThr Tyr lieCysAsnValAsn His Lys
195200205
11
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
210215〈210>4〈211>645〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>4gaactcgtcatgacccagtctccatcctccattgcctgccgggcaagtcagagcattg朋gggaaagcccctegactcctgatc朋3tet3g3ttC3gCggcagtggatctggC3C3g3tg朋gattttgcaatctettectgtcagcaaggg3CC朋ggtgga朋tc朋acg朋ctgtgtctgatgagc3gttg3朋tCtggaactgcccccagagaggcc3朋gtecagtgg朋ggtgg卿gtgtC3C3g3gC3gg3C3gC朋gg3CCtg3gC3朋gC3gactecg3ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaac〈210>5〈211>642〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5gaactcgtcatgacccagtctccatcctccattgcctgccgggcaagtcaggatetttctgggaaagcccctegactcctgatc朋3tet3g3ttC3gCggcagtggatctggC3C3g3tg朋gattttgcaatctettectgtcagcaaggg3CC朋ggtgga朋tc朋acg朋ctgtgtctgatgagc3gttg3朋tCtggaactgcccccagagaggcc3朋gtecagtgg朋ggtgg卿gtgtC3C3g3gC3gg3C3gC朋gg3CCtg3gC3朋gC3gactecg3ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaac〈210>6
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys220
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1權利要求
一種抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2. 權利要求l所述抗體的編碼基因。
3. 根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為如下 1)、2)或3)所示:1) 其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3) 與序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70X以上的同源性且 編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；所述輕鏈的編碼基因為如下I) 、 II)或III)所示I) 其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；II) 在嚴格條件下與I)或II)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III) 與序列表中序列5自5'末端起第72bp-102bp位核苷酸具有70X以上的同源性 且編碼所述輕鏈的DNA分子。
4. 擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。
5. 根據權利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為如下引物對1) 一條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中 序列8所示；2) —條引物序列如序列表中序列9所示，所述引物對中的另一條引物序列如序列表中序列io所示。
6. 含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。
7. —種制備權利要求1所述抗體的方法，是將權利要求2或3所述編碼基因導入宿主 細胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，是通過重組載體將權利要求 2或3所述編碼基因導入宿主細胞中的；所述重組載體中既含有權利要求2或3所述重鏈 可變區(qū)的編碼基因又含有權利要求2或3所述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼 基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調控。
9. 一種抑制表皮生長因子受體信號轉導途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細胞侵襲的抑制 劑或一種預防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為權利要求1中所述抗體和/或權利要 求2或3所述編碼基因。
10. 權利要求1中所述抗體和/或權利要求2或3所述編碼基因在制備抑制表皮生長 因子受體信號轉導途徑的抑制劑中的應用、權利要求1中所述抗體和/或權利要求2或3 所述編碼基因在制備抑制腫瘤細胞侵襲的抑制劑中的應用或權利要求l中所述抗體和/或 權利要求2或3所述編碼基因在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種針對表皮生長因子受體的抗體及其編碼基因與應用。該抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列2所示。實驗結果證實，本發(fā)明抗體具有良好的結合活性(親和力為6.13×10-10M)和抑制腫瘤細胞生長遷移能力；而國外市場上常見抗EGFR人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1.1×10-9M。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結合，從而保證了其抗腫瘤效應。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時表達輕鏈和重鏈可變區(qū)。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預防和/或治療腫瘤的領域將有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/15GK101704891SQ20091023780
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權日2009年11月11日
發(fā)明者戴維·威孚, 曹誠, 米歇爾·瑞奇韋茲, 靳彥文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所