專利名稱：藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulea)ZH01制備殼低聚糖的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藍(lán)色犁頭霉04fc^flcoe /ea)ZH01制備殼低聚糖的用途，屬 于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖是自然界儲(chǔ)存量最豐富的唯一堿性多糖，具有良好的生物相容性和生 物可降解性。由于其天然的抗菌性能而在醫(yī)學(xué)、印染、化工、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域 有著廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。
目前，工業(yè)化生產(chǎn)的殼低聚糖都是市售殼聚糖化學(xué)法或酶法降解而成。酶法 成本高，難以工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)法通常是用甲殼素強(qiáng)堿熱解法脫乙酰制備殼聚糖， 不僅對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，同時(shí)產(chǎn)品殼聚糖的質(zhì)量不穩(wěn)定，如脫乙酰度不均勻、 分子量變化大、乙?；诘奈恢貌荒芄潭ǖ取７肿恿亢兔撘阴６仁菤ぞ厶堑膬?個(gè)重要的分子參數(shù)，決定著殼聚糖的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性。不同分子量的殼 聚糖性質(zhì)差異很大，而殼聚糖的許多獨(dú)特功能只有分子量降低到一定程度時(shí)才能 表現(xiàn)出來。
利用一些可產(chǎn)殼聚糖的菌株為原料，通過微生物發(fā)酵法來制備殼聚糖，可大 大減輕對環(huán)境的污染，但目前所使用的菌株制備出的殼聚糖產(chǎn)量往往不高，而且 通常難以得到所需分子量的殼低聚糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種藍(lán)色犁頭霉04fc/a^ coen^a) ZH01制備殼低聚糖的用途。該藍(lán)色犁頭霉(X&^a coenJefl) ZH01菌株已保藏在 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏 編號為CCTCCNO: M209128，保藏日期為2009年6月19日。該菌株的形態(tài)特 征為菌絲較粗，白堊色，形成的菌落較疏松，呈絨毛狀，形成大量孢子。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是藍(lán)色犁頭霉04fo/c/^ coera/ea) ZH01制備殼低 聚糖的用途。
所述殼低聚糖的制備過程是將藍(lán)色犁頭霉C4fc^acoenz/ea)ZH01接種、斜面 培養(yǎng)后進(jìn)行固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵得到菌絲體，然后用NaOH溶液脫蛋白，得到甲殼素 和殼低聚糖的混合物，再用乙酸溶液對該混合物進(jìn)行回流處理分離出甲殼素，將剩余的溶液離心后，用NaOH溶液將上層清液調(diào)pH值為9~10，充分離心并水洗 至上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖。
上述制備過程的具體步驟是
(1) 將藍(lán)色犁頭霉(JfcWa ZH01接種于盛有PDA培養(yǎng)基的斜面試管， 然后于3(TC恒溫培養(yǎng)144h，得到斜面種子；
(2) 取培養(yǎng)后的藍(lán)色犁頭霉04fo^acoenz/ea)ZH01斜面配成孢子懸液，然后按 1.8xl09個(gè)孢子數(shù)/kg發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，于 3(TC恒溫培養(yǎng)168h使之固態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體；固態(tài)發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng)基中各 組分及其含量分別為1 1.5cmx4 7cm的土豆片20g、蔗糖0.2g、尿素0.2g、K2HPO4 0.03g、 MgS04-7H20 0.02g禾B20mL水，自然pH;或者用接種環(huán)取3環(huán)培養(yǎng)后的 藍(lán)色犁頭霉046sWa coera/ea) ZH01斜面，接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，在 180r/min、 28。C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72h使之液態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體；液態(tài)發(fā)酵所用的 發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨2g、D-葡萄糖4g和200mL 水，起始pH為4.5。
(3) 將菌絲體與發(fā)酵培養(yǎng)基分離，清水沖凈，于-2(TC凍干后研磨、過20-40目 篩，得到菌絲干粉，然后將菌絲干粉與過量的質(zhì)量百分比濃度為2~10%的NaOH 溶液混勻，于115 12rC充分脫蛋白，抽濾并用水反復(fù)沖洗至濾液澄清，得到的固 體即為甲殼素和殼低聚糖的混合物；
(4) 將甲殼素和殼低聚糖的混合物與過量的質(zhì)量百分比濃度為2~10%的乙酸溶 液混勻，于80 95。C充分回流，分離出甲殼素，然后將剩余溶液離心，所得上層 清液用質(zhì)量百分比濃度為20~40%的NaOH溶液調(diào)pH為9~10，充分離心并水洗至 上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖。
上述由藍(lán)色犁頭霉04foWa coera/ea) ZH01制備出的殼低聚糖Mw為5 10kDa。 細(xì)胞中存在的氨基糖核苷酸是尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺(UDP-GlcNAc)， 通過甲殼素合成酶的催化，UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)變成N-乙酰-D-葡糖胺，即甲殼素，緊 接著，幾丁質(zhì)脫去乙?；?，形成殼聚糖。本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色犁頭 霉04fcW/a coww/m) ZH01菌株中不僅存在甲殼素合成酶和甲殼素脫乙酰酶，還存 在殼聚糖酶。而殼聚糖酶是專一性降解殼聚糖的水解酶，可以將殼聚糖進(jìn)行降解， 進(jìn)而得到聚合度較低的殼低聚糖。
因此，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明將藍(lán)色犁頭霉04fcW&coem/e")ZH01菌株用于制備殼低聚糖，在制備過程中，無需額外添加酶作為催化劑即可實(shí)現(xiàn)殼聚糖的降解，得到聚合度較低的殼低聚糖，并且對環(huán)境無污染。


圖1為培養(yǎng)基上生長的藍(lán)色犁頭霉04fcW/acoen^a)ZH01菌株的形態(tài)特征
生物材料保藏信息
本發(fā)明的藍(lán)色犁頭霉04feWz'a coera/w) ZH01菌株己保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:M209128，保藏日期為2009年6月19日。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明的藍(lán)色犁頭霉04fe/^acoen^a)ZH01菌株的形態(tài)特征為菌絲較粗，白堊色，形成的菌落較疏松，呈絨毛狀，形成大量孢子。
以下實(shí)施例中所用的百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。實(shí)施例1
(1) 培養(yǎng)基的配制-
斜面培養(yǎng)基PDA (potato dextrose agar)培養(yǎng)基，配制方法為稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加10 20g葡萄糖和17 20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管5 10ml (具體分裝量可視試管大小而定， 一般不超過試管體積的2/3)， 15磅蒸氣(121°C)滅菌20分鐘后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?br> 發(fā)酵培養(yǎng)基在500mL三角瓶中裝1 1.5cmx4 7cm的土豆片20g,然后將蔗糖0.2g、尿素0.2g、 K2HPO4 0.03g和MgS(V7H2O0.02g溶于20mL水，添加到該三角瓶中，自然pH。
(2) 將藍(lán)色犁頭霉G4foWa comz/ea) ZH01用接種環(huán)取1環(huán)接種于盛有PDA培養(yǎng)基的斜面試管，于30'C恒溫培養(yǎng)144h，得到斜面種子；取培養(yǎng)后的藍(lán)色犁頭霉G4feW/acoen^a)ZH01斜面配成孢子懸液，然后按1.8xl(^個(gè)孢子數(shù)/kg發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，于30'C恒溫培養(yǎng)168h使之固態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體。(3) 將菌絲體與培養(yǎng)基分離，清水沖凈，-20匸凍干，研磨，過20目篩得到菌絲干粉。將菌絲干粉與過量的2~10% NaOH溶液混勻，于12rC處理菌絲干粉15min使之脫蛋白，抽濾并用水反復(fù)沖洗濾渣至濾液澄清，得到的固體即為甲殼素和殼低聚糖的混合物；
(4) 將甲殼素和殼低聚糖的混合物與過量的2 10%的乙酸溶液混勻，于80 95。C回流24h，分離出甲殼素，然后將剩余溶液離心，所得上層清液用20%的NaOH溶液調(diào)pH,，充分水洗至上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖，其產(chǎn)率為6.12g/kg底物(底物為甲殼素和殼聚糖的混合物)，純度為83%，脫乙酰度為85°/。， Mw為6.4kDa。
實(shí)施例2
(1) 培養(yǎng)基的配制斜面培養(yǎng)基與實(shí)施例l相同。
發(fā)酵培養(yǎng)基將酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨2g和D-葡萄糖4g溶于200mL水，然后添加到1000mL三角瓶中，起始pH為4.5。
(2) 將藍(lán)色犁頭霉04fo/力fl coenz/efl) ZH01用接種環(huán)取1環(huán)接種于盛有PDA培養(yǎng)基的斜面試管，于3(TC恒溫培養(yǎng)144h，得到斜面種子；用接種環(huán)取3環(huán)培養(yǎng)后的藍(lán)色犁頭霉04fc/力"ZH01斜面接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，在180r/min、 28。C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72h進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體。
(3) 將菌絲體與培養(yǎng)基分離，清水沖凈，-20°〇凍干，研磨，過20目篩得到菌絲干粉。將菌絲干粉與過量的2~10% NaOH溶液混勻，于12rC充分處理菌絲干粉使之脫蛋白，抽濾并用水反復(fù)沖洗濾渣至濾液澄清，得到的固體即為甲殼素和殼低聚糖的混合物；
(4) 將甲殼素和殼低聚糖的混合物與過量的2%的乙酸溶液混勻，于95'C回流24h，分離出甲殼素，然后將剩余溶液離心，所得上層清液用40%的NaOH溶液調(diào)pH=10，充分水洗至上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖，產(chǎn)率為7.93%,純度為86.1%，脫乙酰度為84.5%， Mw為6.6kDa。
權(quán)利要求
1.藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulea)ZH01制備殼低聚糖的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)色犁頭霉04&Wa coenJea) ZH01制備殼低聚糖的用 途，其特征在于制備過程是將藍(lán)色犁頭霉04Zm'&fl coew/ea) ZH01接種、斜 面培養(yǎng)后進(jìn)行固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵得到菌絲體，然后用NaOH溶液脫蛋白，得到甲 殼素和殼低聚糖的混合物，再用乙酸溶液對該混合物進(jìn)行回流處理分離出甲殼 素，將剩余的溶液離心后，用NaOH溶液將上層清液調(diào)pH值為9 10，充分離 心并水洗至上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的藍(lán)色犁頭霉046w'c/fa coe /ea) ZH01制備殼低聚糖的用途，其特征在于制備過程的具體步驟為(1) 將藍(lán)色犁頭霉04fcW/a coe/^/e") ZH01接種于盛有PDA培養(yǎng)基的斜面試管， 然后于3(TC恒溫培養(yǎng)144h，得到斜面種子；(2) 取培養(yǎng)后的藍(lán)色犁頭霉04foWa coerw/ea) ZH01斜面配成孢子懸液，然后按 1.8xl(^個(gè)孢子數(shù)/kg發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，于 3(TC恒溫培養(yǎng)168h使之固態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體；固態(tài)發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng)基 中各組分及其含量分別為1 1.5cmx4 7cm的土豆片20g、蔗糖0.2g、尿素0.2g、 K2HP04 0.03g、 MgS04'7H20 0.02g和20mL水，自然pH;或者用接種環(huán)取3 環(huán)培養(yǎng)后的藍(lán)色犁頭霉04fefc^ coen^a) ZHOl斜面，接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基 的三角瓶，在180r/min、 28。C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72h使之液態(tài)發(fā)酵，得到菌絲體； 液態(tài)發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨2g、 D-葡萄糖4g和200mL水，起始pH為4.5 。(3) 將菌絲體與發(fā)酵培養(yǎng)基分離，清水沖凈，于-2(TC凍干后研磨、過20~40目 篩，得到菌絲干粉，然后將菌絲干粉與過量的質(zhì)量百分比濃度為2 10。/。的NaOH 溶液混勻，于H5 12rC充分脫蛋白，抽濾并用水反復(fù)沖洗至濾液澄清，得到 的固體即為甲殼素和殼低聚糖的混合物；(4) 將甲殼素和殼低聚糖的混合物與過量的質(zhì)量百分比濃度為2~10%的乙酸溶 液混勻，于80 95'C充分回流，分離出甲殼素，然后將剩余溶液離心，所得上 層清液用質(zhì)量百分比濃度為20~40%的NaOH溶液調(diào)pH為9 10，充分水洗至 上層清液為中性，離心、烘干沉淀，得到殼低聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的藍(lán)色犁頭霉(Jfe/^" oww/e") ZH01制備殼 低聚糖的用途，其特征在于所述殼低聚糖Mw為5 10kDa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulea)ZH01制備殼低聚糖的用途。將該菌株接種、斜面培養(yǎng)后進(jìn)行固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵得到菌絲體，然后用NaOH溶液脫蛋白，得到甲殼素和殼低聚糖的混合物，再用乙酸溶液對該混合物進(jìn)行回流處理分離出甲殼素，將剩余溶液離心后，用NaOH溶液將上層清液調(diào)pH值為9～10，充分水洗至上層清液為中性，離心、烘干沉淀，即得到殼低聚糖。采用該菌株制備的殼低聚糖M_w為5～10kDa，且制備過程對環(huán)境無污染。
文檔編號C12P19/00GK101654690SQ200910272168
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者杜予民, 王偉平, 邱雁臨 申請人:武漢大學(xué)