專利名稱：：一種艾滋病毒的全長基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及艾滋病毒(HIV)的防治領(lǐng)域，更具體涉及一株HIV病毒的全長基因，同時(shí)還涉及一株HIV病毒的全長基因在制備治療或預(yù)防艾滋病毒的藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，國內(nèi)外研究者曾測定多株HIV的病毒全長基因序列，范圍涉及HIV病毒的多個(gè)亞型。不同亞型的病毒在全球具有不同的流行分布，美國和歐洲的流行毒株以B亞型為主，在非洲和印度的流行毒株以C亞型為主，在我國的流行毒株以泰國B以及B/C重組毒株為主，不同亞型病毒在不同地區(qū)和人種中的分布提示病毒序列的差異具有表型的意義，許多的研究也表明艾滋病的疫苗具有一定的亞型特異性，不同亞型的毒株之間難以產(chǎn)生有效的交叉免疫保護(hù)。這些事實(shí)說明不同亞型的病毒具有不同的免疫原性，不同亞型的病毒也可能具有對(duì)不同人種的致病能力。另外，各亞型病毒的酶和配體組份對(duì)于艾滋病治療藥物的敏感性以及耐藥變異特性也不盡相同，為了今后有效控制中國可能出現(xiàn)的耐藥毒株，可能需要針對(duì)國內(nèi)流行毒株進(jìn)行特征性的治療藥物設(shè)計(jì)。要做好艾滋病的防治工作，需要針對(duì)具體的流行病毒株采用有針對(duì)性的防御措施，因此分離并研究我國流行毒株的全長序列對(duì)于我們后期研發(fā)相關(guān)疫苗以及探索流行毒株的致病能力具有重要意義。流行于中國的B’亞型的HIV病毒全長基因序列最初見于1998年廣西的一株毒株RL42(序列號(hào)U71182)，其后是4株來自我國河南地區(qū)采供血感染人群的毒株序列(序列號(hào)DQ007902，DQ007903，DQ007901，AY180905)。以上流行于我國的5株B，亞型病毒株基因組序列均未作專利申請。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種艾滋病毒(HIV)的全長基因(05CNHB_hp3)，該全長基因分離于中國國內(nèi)現(xiàn)流行毒株，具有更好的代表性。有利于研究中國國內(nèi)流行HIV病毒毒株特有病毒學(xué)特性及有針對(duì)性開發(fā)針對(duì)于中國國內(nèi)流行HIV毒株的各種診斷試劑盒及開發(fā)相關(guān)藥物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種艾滋病毒株的全長基因(05CNHB_hp3)在制備治療或預(yù)防艾滋病毒的藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用(一種HIV病毒的全長基因在制備艾滋病疫苗和預(yù)防HIV病毒藥物的檢測中的應(yīng)用)，以上應(yīng)用對(duì)于中國的艾滋病的預(yù)防與控制具有更好的針對(duì)性。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施基于以上各方面應(yīng)用的設(shè)想，提供分離并克隆一株中國流行的HIV病毒的全長基因，以便希望以此序列和此序列表達(dá)的蛋白為目標(biāo)開展疫苗和治療藥物研究。并利用該全長基因開展了基于其中g(shù)ag基因、gpl20基因的疫苗應(yīng)用以及基于其中逆轉(zhuǎn)錄酶基因的抗病毒藥物檢測的應(yīng)用，基于該全長基因的實(shí)際應(yīng)用將對(duì)中國艾滋病毒防控產(chǎn)生積極影響。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案一株HIV病毒(艾滋病毒)的全長基因，該全長基因命名為05CNHB_hp3，該全長基因分離于湖北省的一例艾滋病患者，含有該全長基因的質(zhì)粒(T0P0/05CNHB-hp3)保存于大腸桿菌ToplO中，該大腸桿菌命名為Topl0/05CNHB-hp3(EscherichiacoliTopl0/05CNHB-hp3)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2006年6月20日，保藏號(hào)為=CCTCCNO:M206056oΑ、國內(nèi)流行毒株全長序列的克隆本發(fā)明所獲得的HIV-I國內(nèi)流行株來自于湖北省的一例HIV感染者，將該患者的全血用淋巴細(xì)胞分離液分選其中的外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)，將該HIV陽性的PBMCs與健康人來源的PBMCs進(jìn)行混合共培養(yǎng)，用QIAGEN公司的核酸純化試劑盒提取共培養(yǎng)細(xì)胞的總DNA，分兩段分別擴(kuò)增該DNA中的9000bp和ISOObp的片段，使兩個(gè)片段總長度可以覆蓋全長的HIV基因，分別將擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物連接入Invitrogen公司的pCR-XL-T0P0載體，分別獲得連接有ISOObp和9000bp的載體質(zhì)粒，將所獲得的兩個(gè)質(zhì)粒T0P0-HIV9K和T0P0-HIV1.8K均用PvuI和BspT104I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收TOPO-HIV9K質(zhì)粒中酶切下來的11.2kb片段和T0P0-HIV1.8K質(zhì)粒中酶切下來的2kb片段，將回收的兩個(gè)片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO(來源寫明)，獲得了具有HIV-I全長基因的質(zhì)粒T0P0/05CNHB-hp3克隆Topl0/05CNHB-hp3，經(jīng)測序顯示所克隆的一種HIV全長基因，一種分離的艾滋病毒株的全長基因，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。SEQIDNO.1是本發(fā)明提供的一種HIV病毒全長基因的核苷酸全序列，其編碼區(qū)全長9642個(gè)核苷酸，此全長基因編碼多個(gè)蛋白以及非蛋白的病毒特征序列。該基因的功能鑒定數(shù)據(jù)或該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性功能如下HIV基因組長約9.29.7kb，含gag、Pol、enV、3個(gè)結(jié)構(gòu)基因，及至少6個(gè)調(diào)控基因(TatRev、Nef、Vif、VPU、Vpr)并在基因組的5'端和3'端各含長末端序列。HIVLTR含順式調(diào)控序列，它們控制前病毒基因的表達(dá)。已證明在LTR有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子并含負(fù)調(diào)控區(qū)。1.gag基因能編碼約500個(gè)氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。2.Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。3.env基因編碼約863個(gè)氨基酸的前體蛋白并糖基化成gpl60，gpl20和gp41。gpl20含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gpl20V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gpl20與跨膜蛋白gp41以非共價(jià)鍵相連。gp41與靶細(xì)胞融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明gp41亦有較強(qiáng)抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。4.TaT基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mRNA的翻譯。5.Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對(duì)env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。6.Nef基因編碼蛋白P27對(duì)HIV基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIvcDNA的LTR，抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄?？赡苁荋IV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必箭ο7.Vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。8.VPU基因?yàn)镠IV-I所特有，對(duì)HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。9.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。B、基于gag基因的DNA疫苗ρ⑶NA-gag在誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體中的應(yīng)用通過引物設(shè)計(jì)在上下游引物上分別加入有EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，用該引物對(duì)gag-F5‘-GAAGAATTCATGGGTGCGAGAGCGTCAG-3‘和gag-R5‘-GAAGGATCCTTATTGGGACGAGGGGTCG-3‘?dāng)U增全長基因質(zhì)粒T0P0/05CNHB-hp3中的gag基因，并利用弓丨入的酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體P⑶NA3.1(購自Invitrogen公司，下同)中獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-gag，載有全長基因中786-2292bp區(qū)間的完整的gag基因；通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞證實(shí)gag蛋白可正常表達(dá)；將該真核表達(dá)載體通過肌肉注射方式免疫小鼠，可在小鼠血清中檢測到gag蛋白的特異性抗體，證實(shí)該基因作為疫苗應(yīng)用可誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。C、基于gpl20基因的DNA疫苗ρ⑶NA_gpl20在誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體中的應(yīng)用·通過引物設(shè)計(jì)在上游引物gpl20-F:5，-GGATCCGCCATGGAAAAATTGTGGGTCACAGT-3，中引入BamHI酶切位點(diǎn)和起始密碼ATG，在下游引物gpl20-R5’-CTCGAGTTATCTTTTTTCTCTTTGCACCACACT-3’中引入XhoI酶切位點(diǎn)和終止密碼，用該對(duì)弓丨物擴(kuò)增全長基因質(zhì)粒T0P0/05CNHB-hp3中的gp120基因，并利用引入的酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體P⑶NA3.1中獲得真核表達(dá)質(zhì)粒ρ⑶NA-gpl20，載有全長基因中6319-7772bp區(qū)間的完整的gpl20基因；通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(購自北京北方偉業(yè)有限公司)證實(shí)gpl20蛋白可正常表達(dá)；將該真核表達(dá)載體通過肌肉注射方式免疫小鼠，可在小鼠血清中檢測到gpl20蛋白的特異性抗體，證實(shí)該基因作為疫苗應(yīng)用可誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。D、基于逆轉(zhuǎn)錄酶基因的藥物敏感性檢測中的應(yīng)用用上游弓丨物RT-L:CGGCATATGCCCATTAGTCCTATTGAGA和下游弓丨物RT-RTTATAGTACTTTCCTGATTCCAGCA擴(kuò)增全長基因質(zhì)粒T0P0/05CNHB_hp3的逆轉(zhuǎn)錄酶基因，并將該擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD18-T(購自寶生物公司)載體中得到克隆有RT基因的載體克隆PMD-RT(來源寫明)，其中載有對(duì)應(yīng)于全長基因2549bp至4228bp區(qū)間的逆轉(zhuǎn)錄酶基因；用引物對(duì)M41L-F:AAATTTGTACAGAACTGAAAAAGAAGGGA和M41L-RCCCTTCTTTTTCCAGTTCTGTACAAATTTC對(duì)pMD-RT質(zhì)粒引入突變M41L，獲得引入突變的質(zhì)粒PMD-RT/41L；將原有的RT基因和M41L突變型的RT基因分別克隆到表達(dá)載體pET32a(購自北京捷瑞生物)中，獲得表達(dá)質(zhì)粒ρΕΤ-ρ66、ρΕΤ-ρ66ΤΜ41、ρΕΤ-ρ51、ρΕΤ-ρ51ΤΑΜ41，在體外原核表達(dá)和純化RT蛋白，并檢測原RT蛋白和M41L突變型RT蛋白對(duì)于抗逆轉(zhuǎn)錄藥物的抗性；結(jié)果證實(shí)了M41L突變可提高RT蛋白對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物的抗性。證實(shí)該基因在應(yīng)用于抗逆轉(zhuǎn)錄藥物的檢測時(shí)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了一株HIV病毒(艾滋病毒)的全長基因，該全長基因命名為05CNHB-hp3,含有該全長基因的質(zhì)粒T0P0/05CNHB-hp保存于大腸桿菌ToplO中，該大腸桿菌命名為Topl0/05CNHB-bp3(EscherichiacoliTopl0/05CNHB_hp3)，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2006年6月20日，保藏號(hào)為CCTCCN0:M206056。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明所獲得的HIV病毒株序列來自于我國現(xiàn)流行毒株，該毒株的全長序列并不等同于以往毒株，具有中國流行株的自有特征?；谠撔蛄芯幋a的gag、gpl20基因通過克隆到表達(dá)載體中，該載體DNA肌肉注射小鼠后可在小鼠血清中檢測到相應(yīng)抗體，證實(shí)該載體DNA可作為DNA疫苗的應(yīng)用。基于該序列編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因，在體外原核表達(dá)后可檢測出表達(dá)蛋白具有逆轉(zhuǎn)錄功能，對(duì)于該基因引入相應(yīng)氨基酸突變可導(dǎo)致表達(dá)的蛋白對(duì)于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的敏感性改變，證實(shí)該基因具有檢測RT酶對(duì)藥物敏感度的應(yīng)用。(請補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))圖1為一種HIV病毒的全長基因(05CNHB_hp3)的擴(kuò)增和克隆流程圖。圖2為質(zhì)粒05CNHB_hp3被MluI和NotI內(nèi)切酶酶切片段瓊脂糖凝膠電泳照片。用限制性內(nèi)切酶MluI和NotI酶切質(zhì)粒p05CNHB_hp3。泳道1酶切質(zhì)粒p05CNHB_hp3后有9.8kb片段切出；泳道2=DNA分子量標(biāo)記。圖3為9kb長度的PCR產(chǎn)物照片。以Primer-IF和Primer-IR擴(kuò)增經(jīng)分離的病毒株05CNHBhp感染健康人外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)提取的細(xì)胞DNA產(chǎn)生的片段。泳道1=PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段9040bp；泳道2=DNA分子量標(biāo)記。圖4為1.8kb長度的PCR產(chǎn)物照片。以Primer_2F和Primer_2R擴(kuò)增經(jīng)分離的病毒株05CNHBhp感染健康人外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)提取的細(xì)胞DNA產(chǎn)生的片段。泳道1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段1831bp；泳道2=DNA分子量標(biāo)記。圖5為表達(dá)載體pCDNA-gag誘導(dǎo)表達(dá)gag蛋白的westernblot結(jié)果照片。泳道1是蛋白marker，泳道2是空載體，泳道3是未誘導(dǎo)的細(xì)胞上清，泳道4是經(jīng)誘導(dǎo)的ρ⑶NA-gag表達(dá)上清。圖6為ELISA法測定不同稀釋度的抗血清，可見在IO5稀釋度下仍可檢測出P24的抗體。圖7為表達(dá)載體pCDNA_gpl20在細(xì)胞中表達(dá)上清的westernblot結(jié)果。顯示gpl20蛋白得以正常表達(dá)。圖8為ELISA法測定免疫小鼠不同濃度稀釋抗血清中g(shù)pl20抗體。結(jié)果顯示免疫小鼠血清稀釋IO4倍仍能檢測出gpl20的抗體。圖9為RT解除末端類核苷封閉延伸底物長度結(jié)果。與野生型RT比較，RTTam41能夠更有效地將封閉的模板_引物末端AZTMP刪除并延伸獲得38bp的終產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一株HIV病毒的全長基因克隆一、HIV陽性材料獲取和細(xì)胞分離HIV1型病毒感染者血液通過湖北省武漢市疾病預(yù)防控制中心采集，健康人血液由湖北省武漢市中心血站提供。載體試劑盒T0P0XLPCRCloningKit購自美國Invitrogen公司。淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。植物血球凝集素(PHA)、白細(xì)胞介素(IL-2)購自長春生物制品研究所。1.分離血液PBMCs1)抗凝全血倒入尖底離心管中，室溫(20-25°C，以下相同)下2，OOOrpm/min離心30mino2)取中間白細(xì)胞富集層，置入離心管中，并加入其4倍體積含牛血清(體積比，下同)的PBS緩沖液。3)另取一尖底離心管，預(yù)先在其中加入淋巴細(xì)胞分離液，其上緩緩加入細(xì)胞-PBS混合液，室溫下2，OOOrpm/min,離心30min。4)步驟三離心后液體分上下兩層，取兩層液體中間界面的淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入含牛血清的PBS重懸，常溫下(25°C-30°C)2，000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin。5)棄上清，加入含牛血清的PBS重懸，2，OOOrpm/min離心lOmin。6)棄上清，用含有10%牛血清1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37°C5%CO2(質(zhì)量比，下同)培養(yǎng)。2.共培養(yǎng)感染者PBMCs和健康人PBMCs，分離擴(kuò)增HIV-I病毒。將感染者PBMCs與用PHA刺激生長3天的健康人PBMCs混合，用含有20U/ml的IL-2、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，37°C5%CO2培養(yǎng)。二、HIV全長基因擴(kuò)增和克隆1、用Qiagen公司生產(chǎn)的細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(QIAampDNAMiniKit)提取細(xì)胞基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增病毒全長基因用上游Primer-IF:aaatctctagcagtggcgcccgaacag禾口下游弓|物Primer-IRgcactcaaggcaagctttattgaggct做引物對(duì)擴(kuò)增從HIV病毒全長基因5'端LTR末端與PBS位點(diǎn)連接區(qū)起始至3'端LTR近TO區(qū)的R區(qū)末端共計(jì)9kb片段(圖3)。用上游引物Primer-2F:tggaagggctaatttac禾口下游弓丨物Primer-2R:tcatcatttcttctagtgtagc做弓丨物對(duì)擴(kuò)增HIV病毒全長基因5'端1.Skb的片段(圖4)。反應(yīng)條件如下使用大連寶生物公司生產(chǎn)的LATaqDNA聚合酶，在無菌PCR管中加入4ullOXLATaqPCR緩沖液，2ulIOmM4dNTPs，20uM上游及下游引物各lul，模板DNA，2ULATaq聚合酶，加水至40ul總體積。擴(kuò)增9kb的反應(yīng)條件為94°C5min，94°C10s,62°C30s，68°ClOmin，10個(gè)循環(huán)；94°C10s，55°C30s,68°ClOmin，20個(gè)循環(huán)；72°CIOmin;4°C⑴；擴(kuò)增1.8kb的PCR擴(kuò)增條件為94°C5min,94°C30s,49°C30s,72°C2minl0s,35個(gè)循環(huán)；72°CIOmin；4°C⑴。3、TAE-瓊脂糖凝膠電泳和回收PCR產(chǎn)物。分別用0.7%、1%(質(zhì)量體積比，下同)瓊脂糖凝膠(含lOng/mlEB)電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)，切取含PCR產(chǎn)物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收，PCR產(chǎn)物最后溶于30ul的ElutionBuffer中。4、DNA連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌在無菌Eppendorf管中加入4ulPCR產(chǎn)物，IulpCR_XL-TOPOvector，混勻，室溫連接5min，加入Iul6XTOPOCloningStopsolution終止連接反應(yīng)；將2ul連接產(chǎn)物加入到T0P0XLPCRCloningKit的TOPlO感受態(tài)細(xì)菌，混勻，2，500V電擊轉(zhuǎn)化，加入450ulSOC培養(yǎng)液，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)lh，將混合液涂布在硫酸卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基上，370C培養(yǎng)過夜。5、DNA序列測定將篩選出的陽性克隆菌送Irwitrogen上海英俊測序服務(wù)公司測序鑒定。6、質(zhì)粒DNA制備通過菌落PCR鑒定，從上述步驟4中硫酸卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上挑取含目的片段的單菌落，接種于5ml含硫酸卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜(37°C,200rpm/min)。在1.5ml無菌Eppendorf管中，倒入1.5ml菌液，提取質(zhì)粒DNA，保存于-20°C備用。7、限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒DNA。將9KB和1.8KB片斷克隆質(zhì)粒用PvuI和BspT104I做雙酶切，酶切反應(yīng)參照限制性內(nèi)切酶說明書操作，反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，回收操作與PCR產(chǎn)物回收相同。8、兩質(zhì)粒酶切片段重組連接3'端9KB片段克隆質(zhì)粒中酶切下來的11.2kb片段和5'端1.8KB短片段克隆質(zhì)粒中酶切下來的2kb片段按照摩爾比110比例，用T4DNA連接酶于16°C連接過夜。9、酶切片段重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌將步驟8中連接產(chǎn)物20ul加入到IOOul的T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰浴30min；42°C水浴熱休克90s，并迅速放回冰上冰浴2min；加入880ulLB培養(yǎng)基，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)Ih；將培養(yǎng)液低速離心，去除上清900ul，重懸沉淀，涂布于硫酸卡那霉素抗性培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。10、從平板中挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定獲得HIV-I全長基因克隆質(zhì)粒Topl0/05CNHB-hp3，見圖2。一種分離艾滋病毒株的全長基因，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。實(shí)施例2基于HIV-Igag基因的DNA疫苗構(gòu)建和應(yīng)用一、HIV衣殼蛋白gag基因DNA疫苗真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定1、設(shè)計(jì)一對(duì)分別含有EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)的引物用于擴(kuò)增gag基因，正向引物為gag-F5‘-GMGMTTCATGGGTGCGAGAGCGTCAG-3‘以及反向引物gag-R5‘-GMGGATCCTTATTGGGACGAGGGGTCG-3‘，用該對(duì)引物擴(kuò)增質(zhì)粒Topl0/05CNHB_hp3中相應(yīng)的DNA片段；2、將上述擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切，通過瓊脂糖電泳膠回收1.5K的酶切片段，獲得對(duì)應(yīng)于全長基因中786-2292bp區(qū)間的片段，該DNA片段為完整的gag基因；3、用上述同樣的內(nèi)切酶處理真核表達(dá)載體ρ⑶NA3.1(購自Invitrogene公司)，瓊脂糖電泳膠回收該雙酶切后的載體；4、用T4DNA連接酶將上述gag基因片段連接入表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a(購自大連寶生物公司)，獲得表達(dá)gag基因的真核表達(dá)載體ρ⑶NA-gag。5、用EcoRI和BamHI雙酶切鑒定所獲得的ρ⑶NA_gag表達(dá)載體，并同時(shí)將所得載體質(zhì)粒送至上海英駿公司進(jìn)行測序鑒定。以上步驟具體操作按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。二、質(zhì)粒真核表達(dá)和產(chǎn)物鑒定所獲得的真核表達(dá)載體pCDNA-gag通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定，其操作步驟是1、轉(zhuǎn)染前一天，在6孔培養(yǎng)板中接種293T細(xì)胞；2、當(dāng)細(xì)胞生長至90%孔面積時(shí)，用Lipofectamine2000試劑將pCDNA-gag質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞，具體步驟參閱Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書。3、轉(zhuǎn)染6h后，吸棄轉(zhuǎn)染液，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640液2ml，繼續(xù)孵育48h，后收集細(xì)胞，用Trizol試劑裂解細(xì)胞并提取總蛋白。4、將上述從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的的蛋白做SDS-PAGE膠電泳，并用HIVP24單抗做Westernblot鑒定表達(dá)的GAG蛋白。三、質(zhì)粒DNA制備和小鼠免疫操作按質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行，DNA用生理鹽水調(diào)整濃度至lyg/μ1，20°C保存待用。6周齡的BALB/C小鼠，隨機(jī)分成2組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組肌肉注射質(zhì)粒ρ⑶NA-gag100μ1/只；對(duì)照組肌肉注射空質(zhì)粒P⑶ΝΑ3.1100μ1/只。每只小鼠在每次接種前24h均需用0.25%(質(zhì)量體積比)的布比卡因ΙΟΟμΙ預(yù)處理，分別在2、4周后同樣劑量加強(qiáng)免疫，2組均在各次免疫前剪尾取血，6周時(shí)眼球取血進(jìn)行免疫反應(yīng)檢測。四、免疫小鼠的免疫反應(yīng)檢測用ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性抗HIV_p24抗體，具體操作如下1、用重組表達(dá)的HIV_lp24蛋白作為包被抗原包被酶標(biāo)板，3%(質(zhì)量體積比)BSA封閉；2、加入不同稀釋度的待測小鼠血清，37°C孵育30分鐘；3、PBST緩沖液洗板五次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37°C孵育30分鐘；4、PBST緩沖液洗板五次，加底物顯色，37°C反應(yīng)10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm測量各孔OD值。結(jié)果顯示經(jīng)免疫小鼠的血清稀釋IO5仍能檢測到P24的抗體(見圖6)，說明該疫苗應(yīng)用取得了有效的免疫反應(yīng)。實(shí)施例3HIV-Igpl20基因的DNA真核表達(dá)載體構(gòu)建和疫苗應(yīng)用一、HIV-I膜蛋白gpl20基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定1、設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增HIV-I的gpl20基因并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和起始密碼，上游引物5，-GGATCCGCCATGGAAAAATTGTGGGTCACAGT-3，中引入了BamHI酶切位點(diǎn)和起始密碼ATG；下游引物5，CTCGAGTTATCTTTTTTCTCTTTGCACCACACT-3’中引入了XhoI酶切位點(diǎn)和終止密碼。用該對(duì)引物擴(kuò)增質(zhì)粒Topl0/05CNHB-hp3中相應(yīng)的DNA片段；2、將上述擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切，通過瓊脂糖電泳膠回收1.4K的酶切片段，獲得對(duì)應(yīng)于全長基因中6319-7772bp區(qū)間的片段，該DNA片段為完整的gpl20基因；3、用上述同樣的內(nèi)切酶BamHI和XhoI處理真核表達(dá)載體ρ⑶NA3.1，瓊脂糖電泳膠回收該雙酶切后的載體；4、用T4DNA連接酶將上述gpl20基因片段連接入表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，獲得表達(dá)gpl20基因的真核表達(dá)載體ρ⑶NA-gpl20g。5、用BamHI和XhoI雙酶切鑒定所獲得的表達(dá)載體ρ⑶NA_gpl20g，并同時(shí)將該載體質(zhì)粒送至上海英駿公司進(jìn)行測序鑒定。以上操作具體步驟按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。二、質(zhì)粒真核表達(dá)和產(chǎn)物鑒定所獲得的真核表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定，其操作步驟是1、轉(zhuǎn)染前一天，在6孔培養(yǎng)板中接種293T細(xì)胞；2、當(dāng)細(xì)胞生長至90%時(shí)，用Lipofectamine2000試劑將pCDNA_gpl20質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞，具體步驟參閱Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書，。3、轉(zhuǎn)染6h后，吸棄轉(zhuǎn)染液，加入含有10%FCS的RPMI1640液2ml，繼續(xù)孵育48h，后收集細(xì)胞，用TrizolLS試劑裂解細(xì)胞并提取總蛋白(購自irwitrogene公司)，具體操作參見TrizolLS試劑盒說明書。4、將上述從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的的蛋白做SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后一抗為13000兔抗HIV-lgpl20多克隆抗體，二抗為1200的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAB顯色進(jìn)行Westernblot分析以鑒定表達(dá)的gpl20蛋白。Westernblot分析顯示gpl20蛋白得以正常表達(dá)(見圖7)。三、質(zhì)粒DNA制備和小鼠免疫操作按質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行，DNA用生理鹽水調(diào)整濃度至1μg/μ1，"20°C保存待用。6周齡的BALB/C小鼠，隨機(jī)分成2組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組肌肉注射ρ⑶NA_gp120質(zhì)粒100μ1/只；對(duì)照組肌肉注射P⑶ΝΑ3.1空質(zhì)粒100μ1/只。每只小鼠在每次接種前24h均需用0.25%的布比卡因100μ1預(yù)處理，分別在2、4周后同樣劑量加強(qiáng)免疫，2組均在各次免疫前剪尾取血，6周時(shí)眼球取血進(jìn)行免疫反應(yīng)檢測。四、免疫小鼠的免疫反應(yīng)檢測用ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性抗HIVgpl20抗體，具體操作如下1、用重組表達(dá)的HIV_lgpl20蛋白作為包被抗原包被酶標(biāo)板，3%(什么比？)BSA封閉；2、加入不同稀釋度稀釋的待測小鼠血清，37°C孵育30分鐘；3、PBST緩沖液洗板五次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37°C孵育30分鐘；4、PBST緩沖液洗板五次，加底物顯色，37°C反應(yīng)10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm測量各孔OD值。結(jié)果顯示免疫小鼠血清稀釋IO4倍仍能檢測出gpl20的抗體，說明該疫苗的應(yīng)用取得了有效的免疫反應(yīng)(見圖8)。實(shí)施例4:HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,RT)基因的耐藥性檢測中的應(yīng)用一、HIV-IRT基因克隆和突變導(dǎo)入用上游弓丨物RT-L:CGGCATATGCCCATTAGTCCTATTGAGA和下游弓丨物RT-RTTATAGTACTTTCCTGATTCCAGCA擴(kuò)增質(zhì)粒p05CNHB_hp3的逆轉(zhuǎn)錄酶基因并相應(yīng)引入起始密碼和終止密碼，用瓊脂糖凝膠電泳回收的PCR產(chǎn)物連接pMDIS-T載體(購自寶生物公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得克隆有p05CNHB_hp的逆轉(zhuǎn)錄酶基因的質(zhì)粒pMD-RT。具體操作《分子克隆》中有詳細(xì)說明。用弓I物對(duì)M41L-F:AAATTTGTACAGAACTGAAAAAGAAGGGA禾口M41L-RCCCTTCTTTTTCCAGTTCTGTACAAATTTC對(duì)pMD-RT質(zhì)粒進(jìn)行突變引入1、以pMD-RT質(zhì)粒為模板，用引物M41L-F和M41L-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共20個(gè)循環(huán)。2、在擴(kuò)增產(chǎn)物20μ1中加入DPNI內(nèi)切酶1μ1，以消化原質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在氨芐青霉素LB平板上挑取克隆，獲得引入M41L突變的質(zhì)粒pMD-RT/41L。二、HIV-IRT原核表達(dá)載體的構(gòu)建以pMD-RT和pMD_RT/41L的克隆為模板擴(kuò)增分別擴(kuò)增RTp66和p51，用于擴(kuò)增p66和p51基因的引物對(duì)(p66L/p66R，p66L/p51R)在引物的兩端分別加入了酶切位點(diǎn)NdeI和Xhol。RTp66和p51的PCR產(chǎn)物用QIAquickGelExtractionkit進(jìn)行膠回收純化。PCR產(chǎn)物回收后直接用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，再與同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET32a(購自北京捷瑞生物)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.coli.DH5α(購自大連寶生物公司)，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序，確定Ρ66和ρ55的閱讀框是否正確。pET-p66WT、pET-p66TAM41、pET-p51WT、pET-p51M41。三、HIV-IRTp66和p51蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pET_p66和pET_p51重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)e.coli.AD494，在含30μg/mlKan+的LB固體平皿上涂板。分別挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于30μg/mlKan+的LB培養(yǎng)基，37°C200rpm/min搖至對(duì)數(shù)生長期(A_約0.6^0.8)。1、誘導(dǎo)表達(dá)加入0.ImMIPTG的培養(yǎng)物在30°C下分別誘導(dǎo)5h，然后取IOOml誘導(dǎo)培養(yǎng)物，4°C，12000rpm/min離心lOmin，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體，用5ml蛋白重懸液重懸菌體，經(jīng)超聲波破碎以后，取Iml破碎后產(chǎn)物，4°C，12000rpm/min離心lOmin，得到細(xì)菌裂解上清及沉淀，上清和沉淀分別加入適量的上樣緩沖液。2、SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)與純化后的蛋白均以SDS-PAGE進(jìn)行檢測。制備12%(質(zhì)量體積比，下同)分離膠與4%積層膠，電泳系統(tǒng)為Amershammini-veticalgelelectrophoresis。在樣品中加入等體積的2X上樣緩沖液，沸水浴5min后立即冰浴，12000rpm/min，離心lmin。凝膠孔中加入10μ1的樣品，先以90V電壓下電泳，待溴酚蘭指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓為150V至電泳結(jié)束。取下分離膠考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色。棄去染色液，加入脫色液，室溫脫色至背景透亮。3、HIV-IRTp66和p51蛋白的親和純化將培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期的菌液按1100比例轉(zhuǎn)接至400ml新鮮的LB培養(yǎng)基(含30μg/ml的Kan+)，37°C200rpm/min搖至對(duì)數(shù)生長期(OD600=0.60.8)，然后加入IPTG至終濃度0.ImM，在30°C下誘導(dǎo)表達(dá)5h。4°C8000rpm/min離心IOmin收集表達(dá)菌體，用預(yù)冷的PBS洗滌菌體一次，4°C，8000rpm/min離心lOmin，用15ml的蛋白重懸緩沖液重懸菌體。菌體充分重懸后，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，用超聲波裂解菌體(冰浴)，4°C，12000g離心20min去除不溶物，收集上清。上清用2ml鎳螯合His-蛋白親和層析樹脂純化。4、蛋白濃度測定參照Bradford方法測定蛋白濃度，用TIANGEN公司的Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。(1)將0μ1、2μ1、4μ1、6μ1、8μ1、10μ1、14μ1、18μ1BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmg/ml)分別加入到試管中，加入PBS補(bǔ)足到οομ1；(2)將適當(dāng)體積的樣品加入到試管中，并用PBS補(bǔ)足到100μ1；(3)向各試管中加入500μ1考馬斯亮藍(lán)染液(G-250)，混勻，室溫放置5-lOmin；(4)用印pendorf公司Biophotometer選中Bradford，測定BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋品的595nm的吸光值(A595)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品的A595，直接獲得樣品中蛋白濃度。5、HIV-IRT蛋白聚合酶活性檢測利用Roche公司的ReversetranscriptaseAssay(colorimetric)kit檢測含有F214L突變及其他突變的HIV-IRTp66和p51蛋白的聚合酶活性。(1)將野生型和M41L突變的HIV-IRTp66和p51蛋白分別按照摩爾比11進(jìn)行混勻，將混勻后的蛋白分別命名為RTwt、RTtam41；(2)用lysisbuffer稀釋100倍、1000倍，取40μ1力卩入Eppordorf管中，再力口入20μ1reactionmixture[含有template/primer:poly(A)Xoligo(dT)15)以及nucleotides(DIG-dUTP，biotin-dUTP和dTTP)]，37°C溫育8h進(jìn)行反應(yīng)；(3)將上述60μ1反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至Microplatemodules中，并用coverfoil覆蓋，37°C溫育Ih；(4)將Microplatemodules中的反應(yīng)液移去，每個(gè)反應(yīng)孑L用250μIwashingbuffer洗滌5次，每次30s；(5)每孔加入200μ1anti-DIG-POD，并用coverfoil覆蓋，37°C溫育Ih0(6)移去每孔中的溶液，用250μ1washingbuffer洗滌5次，每次30s；(7)每孔加入200μ1ABTs底物溶液，室溫下放置顯色，用酶標(biāo)儀讀板(吸收波長405nm)。四、HIV-IRT核苷酸刪除實(shí)驗(yàn)(Excisionassays)1、模板引物退火<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2XNaCl+乙酸鎂(300raM)5ddH202總體積10將上述反應(yīng)體系加熱至90°C，3min，緩慢降至室溫。用IOXH印es稀釋4倍，至終濃度0.75μMo2、配制如下反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將上述反應(yīng)體系在37°C溫育lOmin。3、將AZT-TP(IOmM)或d4TTP(10mM)用IOXH印es，IOX乙酸鉀，IOXDTT稀釋至終濃度62.5μM04、取20μ1稀釋后的AZTTP(62.5μΜ)或d4TTP(62.5μΜ)與20μ1反應(yīng)體系(2)混合，37°C溫育lh，加熱至90°C，5min,終止反應(yīng)并滅活RTWT。立即冰浴5min。5、配制如下反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在如上體系中分別加入10(T200nmol的RTWT、RTtam41,并用ddH20補(bǔ)足至10μ1。6、將10μ1反應(yīng)體系(5)與40μ1反應(yīng)體系(4)混合，37°C溫育，在Omin，5min，IOmin,20min,30min,40min,60min,90min取5μ1，90°C加熱5min終止反應(yīng)，立即冰浴5min,加入5μ12Χ甲酰胺上樣緩沖液，準(zhǔn)備進(jìn)行核酸變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。7、核酸變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(20%)按如下體系配制變性變性聚丙烯酰胺凝膠<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>混合上述試劑，在55°C水浴中加熱3min，促進(jìn)尿素溶解。從水浴中取出溶液，冷卻至室溫，不斷攪拌混合物。加入330μ1新配制的1.6%的過硫酸銨，混勻。加入5μITEMED，混勻溶液，灌膠。凝膠孔中加入10μ1的樣品，200V電壓下電泳2.5h。核苷酸刪除實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為兩步，首先，將HIV-IRTwt與模板-引物以及AZT三磷酸(AZTTP)或d4T三磷酸(d4TTP)共同孵育，引物末端摻入AZTTP或d4TTP而被封閉；然后，分別加入待檢測的重組酶(RTWT、RTtam41)、dNTPs和3.2mM的ATP進(jìn)行引物解封閉和延伸反應(yīng)，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測38nt長度產(chǎn)物鏈的產(chǎn)生情況。與比野生型RT比較，RTtam41能夠更有效地將封閉的模板_弓丨物末端AZT-MP和d4T-MP刪除而產(chǎn)生38bp的最后產(chǎn)物，證實(shí)了該突變的耐藥特性。(圖5)所涉及的序列及記號(hào)1.SEQIDNO.1的信息SEQIDNO.1是本發(fā)明提供的一株HIV病毒全長基因的核苷酸全序列，其編碼區(qū)全長9642個(gè)核苷酸，此全長基因編碼多個(gè)蛋白以及非蛋白的病毒特征序列。(1)序列特征長度9642bp類型核苷酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸。(3)序列描述:SEQIDNO.1(4)序列表見下述內(nèi)容。SEQUENCELISTING<110>中國科學(xué)院武漢病毒研究所<120>—種艾滋病毒的全長基因及應(yīng)用<130>—種艾滋病毒的全長基因及應(yīng)用<160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>9641<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)<400>1tggaagggctaatttactcccaaaagagacaagagatccttgatctgtgggtctaccata60cacaaggcttcttccctgattgggacaactatacaccagggccaggaatcagataccctc120tgacctttggatggtgcttcaagctagtaccagttgatccagagcaggtagaagaagcca180acaaaggagagaacagctgcttgctacatcctataagccaacatggaacagatgacccag240agagagaagtgctgatgtggaagtttgacagccacctagccttccatcacatggcccgag300agaaacatcctgagttctacaaagactgctgacactgagctatctacaagggactttccg360ctggggactttccagggaggcgtggcatgggcgggaccggggagtggcgagccctcagat420gctgcatataagcagccgcttttgcctgtactgggtctctctagtcagaccagatccgag480cctgggagctctctggctgattagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcctt540gagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctca600gaccctttagtttgtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacgcgaaagcg660aaagtgagaccagaggagatctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacagca720agaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccattttttgactagcggaggctagaagga780gagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagtggcggacaattggatagatgggaaagaa840ttcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagca900gggagctggaacgattcgcagttaatcctggcctcttagaaacagcagaaggttgtagac960aaatactgcaacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaattgaaatcattat1020tcaatgcagtagcagtcctctattgtgtgcatcaaaggatagaggtaaaagacaccaagg1080aagctttagagaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaggcacagcaagcag1140cagctgctgacacaggaaacaacagccaggtcagccacaattaccctatagtgcaaaacc1200ttcaggggcaaatggtacatcagcccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaagg1260tagtagaagagaaggcttttaatccagaagtaatacccatgtttacagcattatcagaag1320gagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacggtggggggacatcaggcagcca1380tgcagatgttaaaagaaaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacacccag1440tgcaggcagggccagttgcaccaggccagctgagagatccaaggggaagtgacatagcag1500gaactactagtactcttcaggagcaaataggatggatgacagctaatccacctgtcccag1560taggagaaatctataaaggatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtata1620gccctaccggtattctggacataagacaaggaccaaaggaaccctttagagactatgtag1680acaggttctataagactctaagagccgaacaagcttcacaagatgtaaaaaattggatga1740cagaaaccttgttggtccaaaattcgaacccagattgtaggactattttaaaagcattgg1800gaccaggagctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtggggggacccagcc1860ataaagcaagaatattggctgaagcaatgagccaagtaacaaattcagctaatataatga1920tgcagagaggcaatttcaggaaccaaagaaagattgtcaagtgtttcaattgtggcaaag1980aagggcacatagccaaaaattgtagggcccccaggaaaaagggctgttggagatgtggaa2040aggaaggacaccaaatgaaggagtgtactgagagacaggctaattttttagggaaaatct2100ggccttcccacaaggggaggccagggaattttcttcagagcagaccagagccatcagccc2160caccagaggagagcttcaggttcggggaggagacaacaactccacctcagaagcaggagc2220cgatagacaaggaactatatcctttaacctccctcagatcactctttggcaacgacccct2280cgtcccaataaagataggggggcaaataaaggaagctctgttagatacaggagcagatga2340tacagtattagaagacatgaatttgccaggaagatggaaaccaaaaatgatagggggaat2400tggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcagatacccatagaaatctgcggacacaa2460ggctgtaggtacagtactaataggacctacacctatcaacataattgggagaaatctgtt2520gactcagcttggttgcactttaaattttcccattagtcctattgaaactgtaccagtaaa2580attaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaat2640aaaagcattaatggaaatttgtacagaaatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgg2700gcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatg2760gagaaaattagtagattttagggaacttaataaaagaactcaagacttctgggaagttca2820attaggaataccacatccggcagggttgaagaagaaaaaatctgtaacagtcctggatgt2880gggtgatgcatatttctcggtccctttagatgaggacttcaggaagtatactgcatttac2940catacctagtaggaacaatgagacaccagggatcagatatcagtacgatgtgcttccaca3000gggatggaaaggatcaccagcaatattccaatgtagcatgacaaaaatcttagagccttt3060tagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatc3120tgacttagaaatagggcagcatagagcaaaagtagaggaactgagagaacatttgttgag3180gtggggatttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcctttggatggg3240ttatgaactccatcctgataaatggacggtacagcctatagtgctgccagaaaaggacag3300ctggactgtcaatgacatacagaagttagtgggaaaattaaattgggcaagtcagattta3360tgcagggattaaggtaaaggaattatgtaaactacttaggggaaccaaagcattaacaga3420agtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcggaaaacagggaaattctaaa3480agaaacagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaa3540gcagggactaggtcaatggacataccaaatttatcaagagcaatataaaaatctgaaaac3600aggaaaatatgcaagaatgaggggtgctcacactaatgatgtaaaacaattaacagaggc3660agtgcaaaaaatagccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaact3720acccatacaaaaggaaacatgggaagcatggtggacagagtattggcaagccacatggat3780tcctgagtgggagtttgtcaatacccctcccttagtgaaattatggtatcagttagagaa3840ggaacccatagaaggagcagaaactttctatgtagatggggcagctaatagggagactaa3900attaggaaaagcaggatatgttactaacaaaggaagacaaagagttgtcaccctaaatga3960cacaacaaatcagaagactgagttacatgcaattcatttagctttgcaggattcaggagc4020agaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattggggatcattcaagcacaaccaga4080taagagtgaatctgaattagtcagtcaaataatagaacagttaataaaaaaggaaaaaat4140ctacctggcatgggtgccagcacacaagggaattggagggaatgaacaaatagataaatt4200agtcagtgctggaatcaggaaagtactatttttagatggaatagataaggcccaagaaga4260acatgagaaatatcacaataactggagagcaatggctagtgattttaacataccacctgt4320ggtagcaaaagaaatagtagcctgctgtgataaatgtcagctgaaaggagaagccatgca4380tggacaagtagactgtagcccaggaatatggcaactagattgtacacatctagaaggaaa4440aattatcctggtagcggttcatgtagccagtggatatatagaagcagaaattattccaac4500agagacagggcaagaaacagcatactttatcctaaaattagcaggaagatggccagtgaa4560aacaatacatacagacaatggcagaaattttaccagtacttcagttaaggccgcctgttg4620gtgggcagggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtagt4680agaatctatgaataatgagttaaagaaaattataggacaggtaagagatcaagctgaaca4740tcttaagacagcagtacaaatggcagtatttatccacaattttaagagaaaaggggggat4800tggggggtacagtgcaggggaaaggatagtagacataatagcaacagacatacaaactag4860agaactacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcag4920agatccactttggaaaggaccagcaaagcttctgtggaaaggtgaaggggcagtagtgat4980acaagataatagtgacataaaagtagtgccaagaagaaaagcaaagatcattagggacta5040tggcaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggattagaacat5100ggaaaagcttagtaaaacaccatatgtatatttcaaggaaagctaaaggatggtgttata5160aacaccactatgatagcactcatccaaaaataagttcagaagtacacatcccactagggg5220atgctaaattggtaataacaacatattggggtctgcatacaggagaaagagactggcatt5280tgggccagggagtctccatagaatggaggagagacagatatagcacacaagcagaaccta5340gcctagcagaccaactaattcatctgtattattttgattgtttttcagaatctgccataa5400gaaaagccattttaggacgtgtagttagctctagttgcaattatccagaaggacatagca5460aggtaggatccctacagtacttggcactagcagcattagtaacaccaaaaaggagaaagc5520cacctttgcctagtgttgcgaaactgacagaggatagatggaacaagccccagaggatca5580agggccacagagggaaccatacaatgagtggacactagagcttttagaggagattaaaag5640ggaagctgttagacattttcctaggagatggctccatgagttgggacaatacatctatga5700aacatatggggatacttgggtaggagtggaagccataataagaattctgcaacaactgct5760gtttactcatttcagaattggatgtcaacatagcagaataggcattactcgacagaggag5820agcaagaaatggagccagtagatcctagattagagccctggaagcatccaggaagtcagc5880ctaagactgcttgtaacaattgctattgtaaaaaatgcagctttcattgccaagtttgtt5940tcacaaaaaaaggcttaggcatctcctatggcaggaagaagagaagacaacgacgaagaa6000ctcctcaagacagtcaaactcatcaagtttctctaccaaagcagtaagtaatatatgtaa6060tgcaatctttgcaagctttaaccatttttgcaatagtagctttaatagtagtagcaataa6120tagcaatagttgtgtggaccatagtattactagaatataggaaaatattaagacagagaa6180aaatagataggttaattgatagaataagagaaagagcagaagacagtggcaatgagagcg6240acggggatcaggaagaattatcagcattggagatggggcaccttattcctcggaatgctg6300atgatctgtagtgctgcagaaaaattgtgggtcacagtctattatggggtacctgtatgg6360aaagaaacaactaccactctattttgtgcatcagaggctaaagcatatgctacagaggta6420cataatatttgggccacacatgcctgtgtacccacagaccccaacccacaagaagtagtc6480ttggaaaatgtgacagaaaattttaacatgtgggaaaataacatggtagaacagatgcat6540gaagatataatcagtttatgggatcaaggcctaaagccatgtgtaagattaaccccactc6600tgtgttactttaaattgcactgatttcaagagtaatagtaccagtagtaataacagtagt6660acaacagagaaaggagaaataaaaaactgctctttcaatatcaccacaagcacaggaact6720aaggtaagagactctgcactttttaataagcttgatgtattaccaatagataatagtagt6780accagctataatagtagtaccagcaataggtatcacagctataggttgatacattgtaac6840acctcaagaattacacaagcttgtccaaaggtatcctttgagccaattcccatacattat6900tgtaccccggctggttttgcgctcctaaagtgtaacaataaaacgttcaatggaatagga6960ccatgtacaaatgtcagtacagtacaatgtacacatggaattagaccagtagtaacaact7020caactgctgttgaatggtagtttagcagacgaagaggtagtaattagatctaaaaatttc7080acagacaatgctaaaatcataatagtacagctgaaacaatccgtagaaattaattgtaca7140agacccaacaacaatacaagaaaaaggataactatgggaccagggagagtattgtataca7200acaggacaaatagtaggagatataagaaaagcacattgtaaccttagtagaccacaatgg7260gatgacactctaagacaggtagttggaaaattaagagaacaatttgggaacaaaacaata7320atctttaatcaatctgcaggaggggatccagaggttgtaatgcacatttctaattgtgga7380ggggaatttttctactgtaatacctcacgactgtttaatagtacttggtataataatggt7440acttggaataatgctagtactgggaatgatagcactattatactcccttgcagaataaaa7500caaattgtaaacaggtggcaggaagtagggaaagcaatatatgcccctcccattgcagga7560ccaattaattgttcatcaaaaattacagggttactattaacaagagatggtgggattaat7620aagactgacaccgagaccttcagacctggaggaggagatatgagagacaattggagaagt7680gaattatataaatataaagtagtgaaaattgaaccattaggagtagcacccaccagggca7740aagagaagagtggtgcaaagagaaaaaagagcagtgggagcaataggagcgatgttcctt7800gggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaataacgctgacggtacag7860gccagacaattgttgactggtatagtgcaacagcaaagaaatttgctgagagctattgag7920gcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagagtc7980ttggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctagggatttggggttgctctgga8040aaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctcacgat8100gagatttggaataacatgacttggatggagtgggaaagacaaattgacaattatacagca8160gaaatatacaccttaattgaacaatcgcagaaccaacaagaaaagaatgagttagaacta8220ttggaattggataagtgggcaagcttgtggaattggtttaacatgacacaatggctgtgg8280tatattaaaatattcataatgatagtaggaggcttgataggtttaagaataatttttgct8340gtactttctatagtaaatagagttaggcagggatactcaccattgtcattgcagacccac8400ttcccaacccagaggggacccggaaggcccgaaggaatcgaagaagaaggtggagagcga8460gacagaggcagatccgagagattagtgaacggattcttgacacttatctgggaggatcta8520cggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtagcgagg8580attgtggaacttctgggacgcagagggtgggaagccctcaaatattgggggaatctcctg8640cagtattggattcaggaactaaagaatagtgctattagcttgcttaacgccacagccata8700gcagtaggtgaagggacagataggattatagaagtagcacaaagagcttggagagctatt8760ctcaacatacctacaagaatcagacagggcctcgaaagagctttgctataagatgggagg8820caagtggtcaaaaggttgtatggctggatggcctagtgtgagggaaagaatggaacgagc8880tgagccagcagcagatggggtgggagcagtatctcgagacctgggaagacatggagcaat8940cacaagtagcaatacagcaaatgatgcctgtgtatggctagaagcacaagaggaggagga9000agtgggctttccagtcagacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaagggagcgtt9060agatctcagccactttttaagagaaaaggggggactggaagggctaatttactcccaaaa9120gagacaagagatccttgatctgtgggtctaccatacacaaggcttcttccctgattggca9180taactacacaccagggccagggatcagataccctctgacctttggatggtgcttcaagct9240agtaccagttgatccagagcaggtagaagaagccaacaaagaagagaacaactgcctgct9300acatcctatgagccaacatggaacagatgacccagagagagaagtgctgatgtggaagtt9360tgacagccgcctagccttccatcacatggcccgagagaaacatcctgagttctacaaaga9420ctgctgacaccgagctttctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtga9480catgggcgggaccggggagtggcgagccctcagatgctgcatataagcagccgcttttgc9540ctgtactgggtctctctagtcagaccagatccgagcctgggagctctctggctgattagg9600gaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgc964權(quán)利要求一種艾滋病毒株的全長基因，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述的一種艾滋病毒株的全長基因在制備治療或預(yù)防艾滋病病毒的藥物檢測中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種艾滋病毒的全長基因及應(yīng)用，將該HIV陽性的PBMCs與健康人來源的PBMCs進(jìn)行混合共培養(yǎng)，提取共培養(yǎng)細(xì)胞的總DNA，分兩段分別擴(kuò)增，使兩個(gè)片段總長度覆蓋全長的HIV基因，將擴(kuò)增所得9000bp和1800bp的片段連接入-XL-載體，獲得兩個(gè)質(zhì)粒TOPO-HIV9K和TOPO-HIV1.8K，將所獲得的質(zhì)粒均用PvuI和BspT104I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收TOPO-HIV9K質(zhì)粒中酶切下來的11.2kb片段和TOPO-HIV1.8K質(zhì)粒中酶切下來的2kb片段，將回收的片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，獲得了HIV-1全長基因的質(zhì)粒TOPO/05CNHB-hp3克隆Top10/05CNHB-hp3，經(jīng)測序顯示所克隆的一種HIV全長基因，序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。此hiv-1全長克隆有利于開發(fā)各種診斷試劑盒及相關(guān)藥物。該基因在制備治療或預(yù)防艾滋病毒的藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，對(duì)于中國的艾滋病的預(yù)防與控制具有更好的針對(duì)性。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101812469SQ20091027233公開日2010年8月25日申請日期2009年9月29日優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日發(fā)明者楊榮閣,童驍,譚建新申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所