專利名稱：檢測人甲型流感病毒h1和/或h3亞型的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物及檢測方法。
背景技術(shù)：
流感是一種由流感病毒引起的、通過呼吸道傳播的傳染性疾病。歷史上流感的大 流行曾經(jīng)給人類造成過很嚴(yán)重的后果，例如1918年爆發(fā)的由Hmi亞型流感病毒引起的“西 班牙流感”。它是20世紀(jì)最具災(zāi)難性的流感病毒，在不到一年時(shí)間里感染了全世界一半的 人口，導(dǎo)致數(shù)千萬人死亡。流感大流行通常是由一種新出現(xiàn)的或者以前人未曾感染過的病 毒引起的，人體對這種新病毒沒有免疫力，再加上其傳播范圍廣、速度快，而疫苗的研制和 生產(chǎn)又很難立即跟上，所以容易造成許多人感染甚至死亡。近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一 體化程度的不斷加深，世界各國之間的人員往來和流動(dòng)日益頻繁和密切，從而使流感病毒 在全球的播散和蔓延速率進(jìn)一步加快，一旦某個(gè)國家或地區(qū)流感爆發(fā)，疫情將會在短時(shí)間 內(nèi)迅速播散至世界各地。2009年發(fā)生的新型甲型Hmi型流感疫情正是如此。2009年4月，墨西哥確診了首例新型甲型Hmi型流感病例。在隨后的4月至5月 期間，新型甲型Hmi型流感疫情在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，僅僅一個(gè)多月的時(shí)間內(nèi)，全球多 個(gè)國家和地區(qū)均發(fā)生了新型甲型Hmi型流感疫情。以疫情最為嚴(yán)重的墨西哥和美國為例， 截至2009年5月14日，墨西哥全國確診新型甲型Hmi流感病例上升至2720例，其中死亡 人數(shù)上升至64人；而在美國五十個(gè)州中，已有四十七個(gè)州宣布發(fā)現(xiàn)新型甲型Hmi流感病 例，患者總數(shù)也上升至4298人，比前一天增加946人。我國內(nèi)地也于5月11日確診了首例 新型甲型Hmi流感病例，截至2009年5月19日，已經(jīng)出現(xiàn)4例新型甲型Hmi流感病例， 均為輸入性流感病例。世界衛(wèi)生組織已于2009年4月29日宣布全球流感大流行警告級別 為5級，并且隨著新型甲型Hmi流感疫情在世界范圍內(nèi)的不斷蔓延，爆發(fā)全球流感大流行 的風(fēng)險(xiǎn)日益提升，世界衛(wèi)生組織已于5月初明確表示不排除把警告級別升至6級，即宣布流 感大流行到來的可能性。此次新型甲型Hmi型流感疫情發(fā)生后，世界各國的科學(xué)家們立即展開了相關(guān)的 科學(xué)研究工作。最新的調(diào)查和研究結(jié)果顯示，每個(gè)感染新型甲型Hmi型流感的墨西哥患者 都會導(dǎo)致增加1. 2至1. 6個(gè)新病例，證明流感病毒的人際傳播在不斷發(fā)生。這一流感病毒 的傳染率，到目前為止是1/3，全球范圍內(nèi)可能會有20億人受到這種流感病毒的感染，一場 全球性大流感現(xiàn)在已經(jīng)初見端倪。但是由于目前尚不能確定新型甲型Hmi型流感病毒的 毒性、可傳播性和病毒的起源，并且該病毒的潛伏期和傳染期也不是很明確，因此科學(xué)家們 還無法判斷其在世界范圍內(nèi)擴(kuò)散的程度。盡管目前新型甲型Hmi流感病毒仍在擴(kuò)散，而且如何演變尚不可預(yù)知，但只要全 球通力合作，充分做好疫情的監(jiān)控和防范工作，就可以最大限度地減少流感病毒對人類的 危害。早期確診新型甲型Hmi流感病毒感染病例，及時(shí)進(jìn)行病例的隔離和治療，是阻止流 感疫情蔓延的重要措施。然而，隨著流感病毒不斷地在人際之間傳播，其發(fā)生變異以及毒力 由弱變強(qiáng)的可能性都是存在的，特別是病毒血凝素(HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的具有高度的變異性和變異的不確定性的特點(diǎn)，使得流感病毒的診斷和分型方法一直滯后于其 疫情的爆發(fā)。因此，在較短的時(shí)間內(nèi)研制出快速、特異、靈敏的檢測方法和診斷試劑，是對抗 新型甲型Hmi流感病毒的首要任務(wù)。由于單克隆抗體技術(shù)的普遍應(yīng)用，許多以單抗為基礎(chǔ)、針對甲型流感病毒的ELISA 和膠體金診斷試劑盒已研制成功，例如甲型流感病毒膠體金診斷試劑對來自疫區(qū)飛機(jī)的乘 客進(jìn)行快速篩查，不失為一種有價(jià)值的方法隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已被大量應(yīng)用于甲型流感病毒的快速 診斷。此次疫情爆發(fā)后世界衛(wèi)生組織陸續(xù)公布的流感病毒快速檢測方法，均是基于新型甲 型Hmi流感病毒核酸的熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)。該技術(shù)設(shè)計(jì)的試劑易于制備，且具有 快速、靈敏、易于在基層推廣的優(yōu)點(diǎn)。但是這些方法還存在一定的缺陷，如所使用的引物和 探針的序列特異性低，難以對當(dāng)前新型甲型Hmi流感病毒的基因組散在的多處變異進(jìn)行 特異性診斷，易于與以往的季節(jié)性甲型Hmi流感病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)或不能擴(kuò)增出在引物 或探針位置出現(xiàn)變異的新型甲型Hmi流感病毒株，從而導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此， WHO不將其作為確診的診斷方法?；谶@些實(shí)際問題，我們根據(jù)以往的流感病毒和最新公布 的新型Hmi流感病毒基因組序列，在各型流感病毒基因組的相對保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過 對擴(kuò)增片段的序列測定和生物信息學(xué)分析，可以準(zhǔn)確地檢測H1、H3、H5、H9等具有爆發(fā)潛力 的流感病毒及其亞型。這種基于流感病毒核酸序列測定的特異性檢測方法，不僅可以用于 新型Hmi病毒的快速診斷和分型，并且在今后還可以推廣至其它具有爆發(fā)潛力的流感病 毒的監(jiān)測工作中去。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物。本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提出一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的方法。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物，包含由SEQ ID NO 1至SEQID NO 6所示的任一核苷酸序列。其中，本發(fā)明的檢測人甲型流感病毒引物的第一優(yōu)選方案為檢測人甲型流感病 毒Hl和/或H3亞型的引物選自下述四組引物中的至少一組(1)用于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl靶核酸序列的引物對包括由SEQ ID NO 1所示核 苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的至少15 個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核 酸引物；(2)用于擴(kuò)增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物對包括由SEQ ID NO :4所示核 苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的至少15 個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核 酸引物；本發(fā)明的檢測人甲型流感病毒引物的第二優(yōu)選方案為檢測人甲型流感病毒Hl 和/或H3亞型的引物選自下述四組引物中的至少一組
(1)用于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl靶核酸序列的引物對包括由SEQ ID NO 1所示核 苷酸序列的核酸引物、由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO :3所示 核苷酸序列的核酸引物；(2)用于擴(kuò)增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物對包括由SEQ ID NO :4所示核 苷酸序列的核酸引物、由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO :6所示 核苷酸序列的核酸引物；本發(fā)明還涉及一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的方法，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)以步驟⑴提取的核酸為模板，用本發(fā)明的引物序列，PCR擴(kuò)增病原體的靶核 酸序列；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并分析結(jié)果?；驕y序技術(shù)由于具備特異、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，被WHO推薦為診斷新型甲型Hmi流感 的確診方法。因此，根據(jù)以往的流感病毒和WHO最新公布的新型甲型Hmi流感病毒基因組 序列，在甲型流感病毒各亞型基因組的相對保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，使用RT-PCR擴(kuò)增病毒 HA基因序列，然后使用測序后的數(shù)據(jù)分析方法，鑒定序列對應(yīng)的病毒類型?；谏鲜霾呗?，相關(guān)引物設(shè)計(jì)原則是1)引物選在HI、H3等病毒亞型某個(gè)相對保 守的位置；2)引物擴(kuò)增片段信息可用以區(qū)分H1，H3，H5，H9四種感染人的亞型，特別是能區(qū) 分2009年北美新型甲型流感病毒和常規(guī)Hmi流感病毒；3)引物應(yīng)符合常規(guī)的PCR引物設(shè) 計(jì)原則。我們選擇H1，H3，H5和H9作為區(qū)分對象，因?yàn)檫@幾種亞型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以感染人群， 現(xiàn)在或者將來已經(jīng)或可能在人間傳播，有的還具有爆發(fā)的潛力。從NCBI的Influenza Virus Resource下載了最新的流感病毒序列數(shù)據(jù)及相關(guān)的 描述信息(截至2009年5月；共187327個(gè)序列條目，涉及到的樣本為23094個(gè))，同時(shí)構(gòu) 建了本地的流感綜合信息系統(tǒng)(http://lifecenter. sgst. cn/flu)。由于流感序列很多， 并且各種亞型在數(shù)據(jù)庫里面存儲的數(shù)目不一致，因此，為保證計(jì)算上可行，我們通過本地系 統(tǒng)，對各種亞型分別按時(shí)間順序選擇了最近的50條樣本信息詳細(xì)并且序列數(shù)據(jù)完整的HA 序列。匯總后，共得到300條HA序列，其中，宿主是禽類的197個(gè)，是人的69個(gè)，是豬的15 個(gè)，宿主是鼠兔(Plateau pika)的1個(gè)，以及宿主標(biāo)注為環(huán)境的18個(gè)。隨后，利用并行化 的 Clustalw 軟件(Bioinformatics, 2003，19 (12)，1585-1586)對這 300 條序列進(jìn)行多重比 對，在相對保守區(qū)域選擇候選引物。據(jù)此，我們選取了 HA序列的聯(lián)配位置750nt和IlOOnt附近的序列分別作為正向 和反向引物。該正反引物直接的序列的聯(lián)配情況見圖1。圖1中框線區(qū)域就是現(xiàn)今流行的 新型甲型Hmi流感病毒HA基因的部分區(qū)域。由于本文設(shè)計(jì)的甲型流感病毒的鑒定方法是 基于對正反引物間的序列測序來實(shí)現(xiàn)，所以我們對圖1中的序列根據(jù)序列相似性繪制聚類 樹以判斷引物間的序列對病毒分型的效果(見圖2)。從圖2可以看出，我們選取的引物間 的序列在理論上可以很好地區(qū)分Hl，H2，H3，H5，H7和H9(選取的300條序列，全部正確的 分到所該分的亞型中)。另外，如箭頭所指位置，2009年新型甲型Hmi流感病毒獨(dú)立分成 一簇，和其它Hl亞型病毒明顯區(qū)分開了。這說明在該區(qū)域兩側(cè)設(shè)計(jì)保守引物，對相應(yīng)產(chǎn)物 的序列進(jìn)行測序可以把H1，H2，H3，H5，H7和H9區(qū)分開，特別是還可以鑒定出新型甲型Hmi 流感病毒。
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WHO在2009年4月28日，公布了檢測甲型流感病毒Hmi的熒光定量PCR方法，該 試劑易于制備，且具有快速、靈敏、易于在基層推廣的優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)用熒光定量PCR方法， 所設(shè)計(jì)探針序列的特異性低，難以區(qū)別不同的甲型Hmi流感病毒的基因組，因此易于與以 往的季節(jié)性甲型Hmi流感病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。此外，由于流感病毒 的變異是非常常見的，引物或探針出的變異，會導(dǎo)致不能擴(kuò)增出在引物或探針位置出現(xiàn)變 異的新型甲型Hmi流感病毒株，而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。測序技術(shù)由于具備特異、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，被WHO推薦為診斷新型甲型Hmi流感的確 診方法。因此，我們根據(jù)以往的流感病毒和WHO最新公布的新型甲型Hmi流感病毒基因組 序列，在甲型流感病毒各亞型基因組的相對保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，使用RT-PCR擴(kuò)增病毒 HA基因序列，然后使用測序后的數(shù)據(jù)分析方法，鑒定序列對應(yīng)的病毒類型。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，不僅可以對此次流行的新型甲型Hmi流感病毒進(jìn)行確 診，且可通過生物信息學(xué)對其重要變異進(jìn)行分析，進(jìn)而為國家制定有效防控措施提供科學(xué) 依據(jù)。例如，由于流感病毒的高變異型，發(fā)生在流感病毒唾液酸結(jié)合位點(diǎn)(HA蛋白上)的變 異，將可能影響病毒的侵襲力的強(qiáng)弱。另外，這種基于測序獲得的抗原表位信息，無疑對有 效疫苗和藥物的研制有著重要的參考價(jià)值。


圖1是引物擴(kuò)增區(qū)域的序列對比圖；圖2是各分型引物之間的序列根據(jù)相似性對病毒分型的效果圖；圖3是不同標(biāo)本的Hl和H3分型引物PCR產(chǎn)物電泳圖；圖4是引物敏感度性優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的電泳圖；圖5是人和豬甲型流感病毒Hl和H3多變區(qū)域測序后的分型情況。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提出的具體實(shí)施方式
，僅限于對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說 明，并不對本發(fā)明的技術(shù)方案做出限制。實(shí)施例11.材料1. 1 毒株樣本、RNA 和 cDNA人來源Hl亞型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株(上海疾病預(yù)防控制中心，廣州疾病預(yù)防控制中心)H3亞型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株(上海疾病預(yù)防控制中心，廣州疾病預(yù)防控制中心)豬來源HlNl型毒株亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所)HlNl型毒株HA基因克隆質(zhì)粒(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所)H3N2型毒株HA基因克隆質(zhì)粒(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所)1. 2主要儀器和試劑干式恒溫加熱器(GL-150，海門其林貝爾儀器制造有限公司)，透射式紫外分 析儀(天能2500，Tanon)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5810R)，臺式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5417R)，低溫冰箱(SanYo Medical freezer),電子分析天平(JT601N，精 天)，數(shù)顯PH計(jì)(PSH-37，上海天達(dá)儀器有限公司)，核酸電泳儀(HE-120，Tanon)，潔凈工 作臺(SDJ-DS，上海淀山湖潔凈設(shè)備廠)，分光光度計(jì)(98090Α，Agilent) ；taq DNA聚合 酶、M-MLVRM逆轉(zhuǎn)錄酶等常用酶均購自Takara及Invitrogen公司；Trizol試劑盒購自 Invitrogen公司；其他常用生化試劑皆為分析純，購自上海人類基因組研究中心倉庫。1.3引物序列表 1 注實(shí)驗(yàn)中引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2等比例混合，作為Hl分型反應(yīng)上游 引物，引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6等比例混合，作為H3分型反應(yīng)下游引物。2.方法2. 1毒株總RNA的cDNA的獲取和采集采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒，處理來自疾病預(yù)防控制中心保存的各流 感亞型毒株培養(yǎng)物上清，抽提并純化總RNA，整個(gè)操作步驟按照廠家的說明書進(jìn)行。在
瓊脂糖電泳上鑒定上述純化總RNA的質(zhì)量后，按照生產(chǎn)商說明書用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn) 錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得總RNA的cDNA。2. 2引物合成由上海超世生物科技有限公司完成(合成方法參考現(xiàn)代分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)盧圣棟主編)2. 3進(jìn)行引物特異性分析利用合成好的Hl和H3亞型分型引物，檢驗(yàn)引物的特異性。以上述含有HA不同亞 型的cDNA或者質(zhì)粒為模板，分別選取Hl分型上游引物(SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2混合 引物)和下游引物SEQ ID NO :3，以及H3分型引物上游引物SEQ ID NO :4和下游引物(SEQ IDNO 5和SEQ ID NO 6混合引物)以上述所有cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
以上體系的PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ；然后按以下條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反 應(yīng)，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ；最后72°C延伸5m ；瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物。電泳 圖如圖3。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示A圖為Hl分型引物對應(yīng)的PCR產(chǎn)物；B圖為H3分型引物對 應(yīng)的PCR產(chǎn)物；1泳道100bp DNA Ladder ；2_8泳道為不同模板的PCR產(chǎn)物，2為去離子水， 3為人Hl亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA，4為人Hl亞型病毒株cDNA，5為豬Hmi亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA，6為 豬Hmi亞型HA基因克隆質(zhì)粒，7為人H3亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA，8為豬H3N2亞型HA基因克隆質(zhì) 粒。結(jié)果表明，Hl分型引物和H3分型引物均能很好的特異性擴(kuò)增各自對應(yīng)的Hl和H3亞 型毒株的cDNA ；而Hl分型引物以H3亞型毒株的cDNA為模板，不能得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物，H3 引物也不能以Hl亞型毒株的cDNA為模板進(jìn)行有效片斷的擴(kuò)增。這說明，Hl和H3分型引 物相互沒有交叉擴(kuò)增反應(yīng)，具有亞型的專一性。2.4PCR 產(chǎn)物測序PCR產(chǎn)物中加入3 μ 1 Exo SAP-IT，進(jìn)行消化反應(yīng):37°C 20分鐘，80°C 15分鐘。消 化后產(chǎn)物與Sequencing Mix混合后，進(jìn)行測序反應(yīng)。Hl分型反應(yīng)用H1R1062作為測序引 物，H3分型反應(yīng)用H3F731作為測序引物。軟件分析對于PCR的兩段產(chǎn)物測序后，用Fasta包里面的ssearch對二者進(jìn)行比對和拼接。 拼接后的序列和基準(zhǔn)序列混在一起，利用并行化的CluStalW(BiOinfOrmatiCS，2003，19， 1585-1586)，對這些序列進(jìn)行多重序列聯(lián)配(multiplesequence alignment)，根據(jù)繪制的 聚類樹(圖2)判斷所測序列屬于何種流感病毒。通過序列相似性聚類，可以把測試用的病毒株準(zhǔn)確無誤的歸類到預(yù)想的分枝中。 圖5是甲型流感病毒Hl和H3多變區(qū)域測序后的分型情況。A，B子圖是圖2中分類樹的Hl 和H3分枝。本實(shí)驗(yàn)中的3 8 (3為人Hl亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA、4為人Hl亞型病毒株cDNA、5為 豬Hmi亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA、6為豬Hmi亞型HA基因克隆質(zhì)粒、7為人H3亞型標(biāo)準(zhǔn)株cDNA、8 為豬H3N2亞型HA基因克隆質(zhì)粒)病毒株序列與300條基準(zhǔn)HA序列進(jìn)行聚類分析可以看 出，3 8病毒株可以準(zhǔn)確地歸類到預(yù)想的聚類樹位置上。因此，應(yīng)用該系列引物不僅可以 對此次流行的新型甲型Hmi流感病毒進(jìn)行確診，而且有可能對其他人易感的季節(jié)性甲型 流感病毒HA亞型(如H3型)進(jìn)行確診。此外，這種方法還應(yīng)該可以發(fā)現(xiàn)在甲型流感病毒 HA亞型中的新變異株，通過生物信息學(xué)分析此類“新”變異的進(jìn)化規(guī)律，對于認(rèn)識和預(yù)測病毒的變異和流行趨勢具有潛在的應(yīng)用價(jià)值；長期積累數(shù)據(jù)和研究，可能為國家制定有效防 控措施提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)施例2弓丨物靈敏度檢測1.材料和儀器同實(shí)施例1，2.引物合成由上海超世生物科技有限公司完成將人源Hl和H3亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行倍比稀釋，分別為10_2、10_3、10_4、 10_5、10_6，并且分別取2ul作為模板，分別選取Hl分型上游引物(SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2混合引物)和下游引物SEQ ID NO :3，以及H3分型引物上游引物SEQ ID NO 4和下游引 物(SEQ ID NO 5 和 HSEQ ID NO 6 混合引物)。PCR反應(yīng)體系 以上體系的PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ；然后按以下條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反 應(yīng)，94°C 30s，58°C 30s, 72°C 30s ；最后72°C延伸5m ；瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物。電泳 圖如圖4。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在10_5稀釋度，仍可見清晰目標(biāo)條帶，并可以獲得清晰的測 序結(jié)果，提示該組引物具有較高的靈敏度。
權(quán)利要求
一種檢測人甲型流感病毒H1和/或H3亞型的引物，其特征在于，包含由SEQ ID NO1至SEQ ID NO6所示的任一核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物，其特征在于， 所述引物選自下述兩組引物中的至少一組(1)用于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl靶核酸序列的引物對包括由SEQID NO :1所示核苷酸 序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的至少15個(gè)連 續(xù)核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引 物；(2)用于擴(kuò)增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物對包括由SEQID NO :4所示核苷酸 序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的至少15個(gè)連 續(xù)核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸引 物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的引物，其特征在于， 所述引物選自下述兩組引物中的至少一組(1)用于擴(kuò)增甲型流感病毒Hl靶核酸序列的引物對包括由SEQID NO :1所示核苷酸 序列的核酸引物、由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO 3所示核苷 酸序列的核酸引物；(2)用于擴(kuò)增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物對包括由SEQID NO :4所示核苷酸 序列的核酸引物、由SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO 6所示核苷 酸序列的核酸引物。
4.一種檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)提取核酸樣本；(2)以步驟(1)提取的核酸為模板，用權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的引物序列，PCR 擴(kuò)增病原體的靶核酸序列；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并分析結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測人甲型流感病毒Hl和/或H3亞型的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為cDNA 100倍稀釋液2μ1 IOXTaq buffer :2μ 1 dNTP (25mM) :2μ 1 上游引物(10 μ Μ) :0. 6μ 1 下游引物(10 μ Μ) :0. 6μ 1 Taq 聚合酶(5υ/μ 1) :0· 3 μ 1 Η20 :12· 5μ 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測人甲型流感病毒Hl和/或Η3亞型的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C 30秒、58 °C 30秒、72 °C 30秒重 復(fù)反應(yīng)35 40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測人甲型流感病毒H1和/或H3亞型的引物及檢測方法，本發(fā)明的檢測人甲型流感病毒的引物，包含由SEQ ID NO1至SEQ ID NO6所示的任一核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案，不僅可以對此次流行的新型甲型H1N1流感病毒進(jìn)行確診，且可通過生物信息學(xué)對其重要變異進(jìn)行分析，進(jìn)而為國家制定有效防控措施提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號C12N15/11GK101899531SQ20091030311
公開日2010年12月1日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者丁國徽, 嚴(yán)安, 吳凡, 李亦學(xué), 熊慧, 童光志, 董輝, 趙國屏, 車小燕, 金維榮 申請人:上海人類基因組研究中心