人季節(jié)性流感病毒H1N1(HuH1N1)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人季節(jié)性流感病毒H1N1(HuH1N1)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。包括：捕獲探針、HuH1N1檢測(cè)引物T7引物和nT7引物、HuH1N1檢測(cè)探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7?RNA聚合酶等試劑。本發(fā)明試劑盒能夠檢測(cè)拭子中的HuH1N1?RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達(dá)100copies/反應(yīng))、污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(cè)(常規(guī)50分鐘完成檢測(cè))的特點(diǎn)，將在人季節(jié)性流感早期感染的臨床診斷中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】人季節(jié)性流感病毒H1N1 (HuHINI)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒的生物檢測(cè)技術(shù)，具體涉及將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中使用的引物、探針及相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因組由8條負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成，根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。
[0003]人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)屬正粘液病毒科甲型流感病毒屬，典型病毒呈球狀。季節(jié)性流感病毒在每年換季時(shí)節(jié)都會(huì)流行蔓延，成為流行性感冒的重要種類，而甲型流感傳染規(guī)律也帶有季節(jié)性的特點(diǎn)。在冬季天氣寒冷，人體抵抗力下降，室內(nèi)活動(dòng)增多情況下，季節(jié)性流感和甲型流感進(jìn)入高發(fā)期，并有雙重流行的風(fēng)險(xiǎn)。此外兩種流感的典型病例癥狀相似，在臨床上不易區(qū)分，只有通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病毒核酸才能確定。
[0004]目前常用的人季節(jié)性 流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢查方法包括:1)免疫學(xué)檢測(cè)方法，如快速流感抗原檢測(cè)、免疫熒光法(或裝配的IFA)，此法對(duì)操作者要求較高；2)細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法，常用有雞胚接種法和細(xì)胞培養(yǎng)法。此法對(duì)病毒分離法較敏感，但需要2-3周時(shí)間，無法實(shí)現(xiàn)早起快速診斷。3)分子生物學(xué)檢測(cè)方法。目前有逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcriptase-PCR,簡(jiǎn)稱RT-PCR)和實(shí)時(shí)突光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real TimeFluorescent Quantified PCR，簡(jiǎn)稱FQ PCR)，RT-PCR采用“基因擴(kuò)增+擴(kuò)增子檢測(cè)”的操作模式，易引起擴(kuò)增物的污染，常造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR雖在技術(shù)上解決了上述問題，其靈敏度和準(zhǔn)確度較高，但操作復(fù)雜，檢測(cè)成本相對(duì)昂貴，阻礙了其在發(fā)展中國(guó)家的大規(guī)模推廣使用。
[0005]實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SimultaneousAmplification and Testing,簡(jiǎn)稱SAT)是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，核酸擴(kuò)增和檢測(cè)使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶和優(yōu)化探針技術(shù)來同時(shí)實(shí)現(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)DNA拷貝，T7RNA聚合酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生突光，該突光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)突光PCR相比,不同之處，前者檢測(cè)體系多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟，核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行(42°C )，無需熱循環(huán)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相對(duì)于其它核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)抑制物更少，能有效減少假陰性結(jié)果。此SAT技術(shù)前期已由 申請(qǐng)人:申請(qǐng)專利并授權(quán)(ZL 200810111479.0)，結(jié)合利用磁珠-RNA富集技術(shù)提取純化靶標(biāo)RNA的方法(ZL200810111478.6)，發(fā)明人制備了人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種檢測(cè)周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定以及易于推廣應(yīng)用的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。
[0007]本發(fā)明所提供的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包含有一條捕獲探針，一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物T7和nT7，和一條用于與在Τ7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針。
[0008]所述捕獲探針可與如序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列特異結(jié)合，在有HuHlNl內(nèi)標(biāo)(HuHlNl IC RNA)時(shí)，其最好還可與該HuHlNl內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合,所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HuHlNl檢測(cè)引物由Τ7引物和ηΤ7引物組成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0009]進(jìn)一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl檢測(cè)探針存在于一 HuHlNl檢測(cè)液中。
[0010]再進(jìn)一步所述試劑盒還包含有HuHlNl內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；所述HuHlNl內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并與HuHlNl靶標(biāo)核苷酸(HuHlNl RNA)使用同一對(duì)弓丨物(Τ7和nT7)，HuHlNl內(nèi)標(biāo)由序列表中序列7所示的HuHlNl IC RNA ;所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)，且所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于HuHlNl檢測(cè)液中。
[0011]更進(jìn)一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)，其中:
[0012]裂解液:含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；
[0013]核酸提取液:含捕獲探針和磁珠；
[0014]洗滌液:含NaCl和SDS ;
[0015]HuHlNl 反應(yīng)液:含 dNTP 和 NTP ；
[0016]HuHlNl檢測(cè)液:含T7引物、nT7引物、HuHlNl檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；
[0017]SAT酶液:含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
[0018]HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl) HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0019]HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；
[0020]HuHlNl內(nèi)標(biāo):含HuHlNl內(nèi)標(biāo)RNA(序列如序列表中序列7所示)稀釋物。
[0021]具體的，所述試劑盒中一個(gè)反應(yīng)單位中上述各種試劑組成如下:·[0022](I)裂解液:HEPES 25_250mM，(NH4)2SO4 5-50mM ；
[0023](2)核酸提取液:HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕獲探針1-50 μ M (優(yōu)選為 5-25 μ Μ)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；
[0024](3)洗滌液:HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
[0025](4)HuHlNl 反應(yīng)液:Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0.l_10mM(優(yōu)選為
0.5-5mM), NTP l_20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
[0026](5) HuHlNl檢測(cè)液:將HuHlNl檢測(cè)引物和HuHlNl檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmMTris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5_15pmol/反應(yīng)均可；其中T7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，HuHlNl檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)；
[0027](6) SAT 酶液:M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))、T7RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應(yīng))、2_10mM HEPES pH7.5、10_100mMN-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4mM zinc acetate、IO-1OOmM trehalose>40-200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol ；
[0028](7) HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHINI)HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0029](8) HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病 毒的溶液；
[0030](9) HuHlNl內(nèi)標(biāo) :含IO2-1O5拷貝/mL HuHlNl IC RNA (序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。
[0031]另一種更具體形式，所述試劑盒由A盒即標(biāo)本處理單元和B盒即核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照及HuHlNl內(nèi)標(biāo)。
[0032]所述HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl RNA以下述方法制備:
[0033]I)用化學(xué)合成法合成HuHlNl HA基因中無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
[0034]2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；
[0035]3) HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，命名為pGEM? -T-HuHlNl菌株，貯存于_70°C ；
[0036]4)從pGEM?-T-HuHlNl菌株中提取pGEM?-T-HuHlNl質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0037]所述HuHlNl內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl IC RNA以下述方法制備:
[0038]I)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同HuHlNl靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；
[0039]2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；
[0040]3)HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?-T-HuHlNl IC菌株，貯存于_70°C ；
[0041]4)從 pGEM?-T-HuHlNl IC 菌株中提取 pGEM?-T-HuHlNl IC 質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。
[0042]所述人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的專用試劑，為以下表不的物質(zhì)之一:
[0043](I)可與序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0044](2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；
[0045](3)用于與在Τ7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針，所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)；
[0046](4)內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，內(nèi)標(biāo)為HuHlNl核苷酸序列(HuHlNl RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(Τ7和ηΤ7引物)，內(nèi)標(biāo)的核苷酸序列如序列表中序列7所示HuHlNl IC RNA，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0047]所述試劑盒的使用方法，用于人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下操作:
[0048]I)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)，得到含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)核酸的裂解液；
[0049]2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在HuHlNl內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入HuHlNl IC RNA，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得·到人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHlNlIC RNA ；
[0050]3)將步驟2)提取的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHlNlICRNA加入由HuHlNl反應(yīng)液和HuHlNl檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3: I ；
[0051]4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0052]本發(fā)明提供了一種人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，使用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，與現(xiàn)有的HuHlNl檢測(cè)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0053](I)高特異性、高純度、低污染:針對(duì)HuHlNl靶核酸設(shè)計(jì)的優(yōu)選捕獲探針，可高效、特異性捕獲HuHlNl的RNA。同時(shí)，由于采取封閉式的恒溫放大檢測(cè)系統(tǒng)，整個(gè)過程中無需打開反應(yīng)體系，因而避免了擴(kuò)增子的污染。
[0054](2)快速檢測(cè):將核酸的擴(kuò)增與檢測(cè)在同一封閉體系中同步進(jìn)行，而且整個(gè)過程中沒有溫度的升降及循環(huán)，因而所需時(shí)間大大縮短，擴(kuò)增檢測(cè)只需要50分鐘。
[0055](3)污染易控:與實(shí)時(shí)熒光PCR相比，本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。
[0056](4)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低:與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，本發(fā)明所用的儀器無需升降溫循環(huán)，因而設(shè)計(jì)和生產(chǎn)成本大幅降低。
[0057]綜上所述，本發(fā)明試劑盒能夠檢測(cè)拭子中的HuHlNl RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達(dá)lOOcopies/反應(yīng))、污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(cè)(50分鐘完成擴(kuò)增檢測(cè))的特點(diǎn)，將在人季節(jié)性流感早期感染的臨床診斷中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0058]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為靈敏度的熒光檢測(cè)結(jié)果
[0060]圖2特異性熒光檢測(cè)結(jié)果
[0061]圖3為臨床樣本鼻拭子的靶標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果
[0062]圖4為臨床樣本鼻拭子的內(nèi)標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果
[0063]圖5為采用凝膠電泳檢測(cè)鼻拭子樣本的檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0064]本發(fā)明人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)檢測(cè)技術(shù)，將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增(SAT)技術(shù)結(jié)合而形成。
[0065]本發(fā)明選取季節(jié)性流感HlNl HA基因保守區(qū)段，通過設(shè)計(jì)專用的捕獲探針，高效、特異性捕獲HuHlNl的RNA ;核 酸擴(kuò)增使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶來同時(shí)實(shí)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸RNA的一個(gè)DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化檢測(cè)探針和擴(kuò)增后產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。
[0066]本發(fā)明中的專用引物和探針包括:
[0067](I)捕獲探針:一條可與序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的革巴標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO, Target Capture Oligo),在有HuHlNl內(nèi)標(biāo)(HuHlNl IC RNA)時(shí)，其還可與該HuHlNl內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合；所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0068](2)HuHlNl檢測(cè)引物:一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物，所述HuHlNl檢測(cè)引物由T7引物和nT7引物組成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；
[0069](3) HuHlNl檢測(cè)探針:一條用于與在Τ7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針，所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM熒光標(biāo)記，3’端用DABCYL熒光
T 己 O
[0070]為便于進(jìn)行結(jié)果分析，還包括:(4) 一條內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針和HuHlNl內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為在使用HuHlNl內(nèi)標(biāo)時(shí)與該內(nèi)標(biāo)配合使用的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)；HuHlNl內(nèi)標(biāo)為HuHlNl核苷酸序列(HuHlNl RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，同時(shí)與所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(T7和nT7引物)。HuHlNl內(nèi)標(biāo)的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名為HuHlNlIC RNA (IC含義為內(nèi)標(biāo))。
[0071]基于以上設(shè)計(jì)，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。
[0072]該試劑盒，至少包含所述捕獲探針(序列2)，一對(duì)所述T7引物(序列3)和nT7引物(序列4)，以及一條所述HuHlNl檢測(cè)探針(序列5)。
[0073]進(jìn)一步，所述試劑盒還可包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl檢測(cè)探針存在于HuHlNl檢測(cè)液中。
[0074]再進(jìn)一步，所述試劑盒還可包含競(jìng)爭(zhēng)性HuHlNl內(nèi)標(biāo)(序列7)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針(序列6)，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于HuHlNl檢測(cè)液中。
[0075]更具體來講，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)，各組分說明如下:
[0076](I)裂解液:用于裂解和保存待測(cè)樣品中的甲型流感病毒(HuHlNl)，為含有去垢劑和HEPES緩沖液的溶液，去垢劑主要為硫酸銨((NH4)2SO4，優(yōu)選為5_50mM)；
[0077](2)核酸提取液:用于提取和純化HuHlNl病毒RNA，為含捕獲探針1_50 μ M (優(yōu)選為5-25 μ Μ)和磁珠50-500mg/L(優(yōu)選為50_250mg/L)的水溶液；
[0078](3)洗滌液:用于磁珠清洗，為含lwt% SDS的水溶液。
[0079](4)HuHlNl反應(yīng)液=SAT擴(kuò)增所需組分，含dNTP 0.l_10mM(優(yōu)選為0.5_5mM)和NTPl-20mM(優(yōu)選為1-1OmM)的`水溶液；
[0080](5) HuHlNl檢測(cè)液:含SAT擴(kuò)增所需引物和探針的水溶液，各引物或探針的濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可，其中T7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)’ HuHlNl檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為8pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為8pmol/反應(yīng)；
[0081](6) SAT酶液:SAT擴(kuò)增所需多酶反應(yīng)體系，主要含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))；
[0082](7) HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHINI)HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0083](8) HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；
[0084](9) HuHlNl 內(nèi)標(biāo):含 IO2-1O5 拷貝 /mL HuHlNl 內(nèi)標(biāo) RNA (序列 7)，是 HuHlNl 核苷酸序列(HuHlNl RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，為體外轉(zhuǎn)錄RNA(HuHlNl IC RNA)稀釋物。
[0085]以上所述試劑盒中各組成的進(jìn)一步說明如下:
[0086]裂解液的主要有效成分是去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分離法進(jìn)行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。捕獲探針一端與靶標(biāo)互補(bǔ)，一端與磁性顆?；パa(bǔ)連接，在核酸提取過程中，細(xì)菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結(jié)合，在不需要傳統(tǒng)的離心操作的情況下，通過洗滌液清洗磁性顆粒而獲得純凈的病毒靶標(biāo)核酸(RNA)。病毒RNA的提取通過特異性吸附原理來實(shí)現(xiàn)。
[0087]HuHlNl檢測(cè)液中HuHlNl檢測(cè)探針為分子信標(biāo)，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價(jià)標(biāo)記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)的環(huán)部分和靶標(biāo)互補(bǔ)，兩頭由于互補(bǔ)而成為莖，分子信標(biāo)探針與線性的TaqMan探針相比，因其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。
[0088]由于SAT擴(kuò)增易受多種因素影響而使擴(kuò)增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯(cuò)誤的結(jié)論，本發(fā)明的試劑盒中設(shè)置了 HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)。其中，HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)為體外轉(zhuǎn)錄的RNA，不具有生物學(xué)活性。
[0089]通過檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照，可證明試劑盒檢測(cè)方法及材料無誤，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以監(jiān)測(cè)每次檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性及試劑盒批次間的差異。此外，通過陽(yáng)性對(duì)照品可制備臨界弱陽(yáng)對(duì)照(以生理鹽水和裂解液按1:1混合成為稀釋液，稀釋陽(yáng)性對(duì)照1000倍作為臨界弱陽(yáng)對(duì)照)，可以提示處于臨界值狀態(tài)時(shí)的檢驗(yàn)操作情況，通過臨界弱陽(yáng)對(duì)照定期檢測(cè)SAT實(shí)驗(yàn)室，可進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，以防止檢測(cè)過程出現(xiàn)漏檢(假陰性)的情況。HuHlNl內(nèi)標(biāo)作為HuHlNl RNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，其最主要的作用就是控制假陰性結(jié)果的發(fā)生，通過檢測(cè)加入有內(nèi)標(biāo)的樣本，可了解整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系是否受抑制，更好的提示假陰性。陰性對(duì)照可排除假陽(yáng)性，在正確使用試劑盒檢測(cè)方法和材料情況下，可保證檢測(cè)的特異性。
[0090]利用以上試劑盒對(duì)人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下步驟:
[0091]I)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)，得到含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)核酸的裂解液；
[0092]2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在HuHlNl內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入HuHlNl IC RNA，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸， 得到人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHlNlIC RNA ；
[0093]3)將步驟2)提取的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHlNlICRNA加入由HuHlNl反應(yīng)液和HuHlNl檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3: I ；
[0094]4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0095]在上述檢測(cè)操作中，所述步驟I)中的待測(cè)樣品為咽拭子或鼻拭子。
[0096]所述步驟4)中的HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照為含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl) HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；HuHlNl陰性對(duì)照為不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；HuHlNl內(nèi)標(biāo)為含IO2-1O5拷貝/mL HuHlNl內(nèi)標(biāo)RNA (序列7)稀釋物。
[0097]實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0098]下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例中所用主要原料SAT酶液、陽(yáng)性對(duì)照及內(nèi)標(biāo)的體外轉(zhuǎn)錄RNA由美國(guó)RD Biosciences公司提供，7500型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，NTPs, dNTPs等試劑和其他儀器均為常規(guī)可商購(gòu)產(chǎn)品。[0099]實(shí)施例1、用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的專用引物和探針的設(shè)計(jì)
[0100]本發(fā)明選擇HuHlNl病毒HA基因中無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)原理，使用DNAATAR、DNAman軟件和人工設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的專用引物和探針序列，得到如下具體序列:
[0101](I) 一條可與如序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO, Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為 5’ -UAGGUUGACAGAGUGUGUCACUGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’ (序列表中序列2)；
[0102](2) 一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物，所述HuHlNl檢測(cè)引物由T7引物和nT7引物組成，Τ7引物序列為5’-aatttaatacgactcactatagggagaCGCTATTAGATTTCCATTTGC_3’ (序列表中序列 3), nT7 引物序列為5’ -GAAGGRAGAATYAACTACTAC-3’(Y代表簡(jiǎn)并堿基，代表C/T，R代表G/A，序列表中序列4)；
[0103](3) 一條用于與在Τ7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針，所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’ -ccucucugcuggaacccgagg-3’ (序列表中序列5) ,5’端用FAM突光標(biāo)記,3’端用DABCYL熒光標(biāo)記。
[0104](4)為便于進(jìn)行結(jié)果分析，還配合試劑盒中增加的競(jìng)爭(zhēng)性HuHlNl內(nèi)標(biāo)(序列7)，設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，HuHlNl內(nèi)標(biāo)與HuHlNl靶標(biāo)核苷酸(HuHlNl RNA)擁有相同的弓丨物結(jié)合區(qū)，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測(cè)探針結(jié)合，但能與內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合，所述HuHlNl內(nèi)標(biāo)可通·過HuHlNl祀標(biāo)模板定點(diǎn)突變構(gòu)建獲得,可與捕獲探針特異性結(jié)合，所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為與HuHlNl檢測(cè)探針序列、突光標(biāo)記不同,但堿基數(shù)一致的探針，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’ -ccaggguaauucggcacguccugg-3’(序列表中序列6)，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0105]實(shí)施例2、制備人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑
盒
[0106]利用實(shí)施例1所提供的專用引物和探針，得到本發(fā)明人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TCO，TargetCapture Oligo)、T7引物、ηΤ7引物、HuHlNl檢測(cè)探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶；試劑盒存在內(nèi)標(biāo)時(shí)，還包括內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針。
[0107]所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7弓丨物和HuHlNl檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于HuHlNl檢測(cè)液中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來講，所述試劑盒分為2-30°C儲(chǔ)存的A盒(標(biāo)本處理單元)和-15~-35°C儲(chǔ)存的B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照，如果存在內(nèi)標(biāo)，B盒還包括HuHlNl內(nèi)標(biāo),主要成分如下:
[0108]A盒(標(biāo)本處理單元)組成為:[0109]裂解液；含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；
[0110]核酸提取液:含捕獲探針1-50 μ M(優(yōu)選為5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L(優(yōu)選為50-250mg/L)；
[0111]洗滌液:主要含lwt% SDS。
[0112]B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)組成為:
[0113]HuHlNl 反應(yīng)液:含 dNTP 0.l_10mM(優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM(優(yōu)選為1-1OmM)；
[0114]HuHlNl檢測(cè)液:含引物和探針，各引物和探針的濃度在5_15pmol/反應(yīng)均可，其中T7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，HuHlNl檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)；
[0115]SAT 酶液:含 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))，Τ7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng));
[0116]HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl) HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0117]HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；
[0118]HuHlNl內(nèi)標(biāo):含IO2-1O5拷貝/mL HuHlNl IC RNA稀釋物(序列表中序列7)。
[0119]試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規(guī)方法制備取得或商業(yè)購(gòu)買得到。
[0120]具體來講，每一反應(yīng)單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下:
[0121](I)裂解液:為裂解和保存人咽拭子和鼻拭子中的人季節(jié)性流感病毒(HuHlNl)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含HEPES25-250mM，(NH4)2SO4 5-50mM ；
[0122](2)核酸提取液:為提取人季節(jié)性流感病毒(HuHINI)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特異結(jié)合靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針 1-50 μ M(優(yōu)選為 5-25 μ Μ)，磁珠50-500mg/L (優(yōu)選為 50_250mg/L)；
[0123](3)洗滌液:為含 SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS 1-lOmM, EDTA 1-1OmM ；
[0124](4) HuHlNl反應(yīng)液:為含dNTPs和NTPs擴(kuò)增所需組份，具體包含Tris 10_50mM，MgCl2 10-40mM, dNTP 0.l-10mM(優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTP l-20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP401-10%, KCl 5-40mM ；
[0125](5)HuHlNl檢測(cè)液:將恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的HuHlNl檢測(cè)引物和HuHlNl檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5_15pmol/反應(yīng)均可，其中T7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，HuHlNl檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為Spmol/反應(yīng)；
[0126](6) SAT酶液:為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))、2_10mM HEPES ρΗ7.5、IO-1OOmM N-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4mM zinc acetate、IO-1OOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCU0.01-0.5mM EDTA,
0.1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；[0127](7)HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHINI)HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0128](8) HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水；
[0129](9)如果存在內(nèi)標(biāo),HuHlNl內(nèi)標(biāo):含IO2-1O5拷貝/mL HuHlNl內(nèi)標(biāo)RNA(序列表中序列7)。
[0130]HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
[0131]I)用化學(xué)合成法合成HuHlNl HA基因中無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
[0132]2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；
[0133]3) HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，命名為pGEM? -T-HuHlNl菌株，貯存于_70°C ；
[0134]4)從pGEM?-T-HuHlNl菌株中提取pGEM?-T-HuHlNl質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
[0135]HuHlNl內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl IC RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下:
[0136]I)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同HuHlNl靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如·序列表中序列9所示)；
[0137]2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；
[0138]3)HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?-T-HuHlNl IC菌株，貯存于_70°C ；
[0139]4)從 pGEM?-T-HuHlNl IC 菌株中提取 pGEM?-T-HuHlNl IC 質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。
[0140]實(shí)施例3、人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)靈敏度
[0141]用本發(fā)明試劑盒(組成見實(shí)施例2，試劑盒內(nèi)不存在HuHlNl內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)液中也不存在內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針)測(cè)定濃度為I X IO4Copies/反應(yīng)、I X IO3Copies/反應(yīng)、I X IO2Copies/反應(yīng)、lOcopies/反應(yīng)的人季節(jié)性流感病毒陽(yáng)性對(duì)照RNA，確定靈敏度下限。具體步驟如下:
[0142](I)稀釋
[0143]將IXlO4c0Pies/反應(yīng)的人季節(jié)性流感病毒陽(yáng)性參考品RNA，10倍梯度稀釋至I X IO3Copies/ 反應(yīng)、I X IO2Copies/ 反應(yīng)、IOcopies/ 反應(yīng)。
[0144](2)核酸提取
[0145]2.1在每個(gè)樣品處理管(1.5mL離心管)中加入200 μ I裂解液(含HEPES 35mM,(NH4)2SO4 20mM), 200 μ I流感病毒陽(yáng)性參考品稀釋液，用裂解液裂解人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)(模擬樣本處理)，得到含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)核酸的裂解液。
[0146]2.2在樣品處理管(1.5mL離心管)中加入100 μ I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕獲探針20 μ Μ，磁珠200mg/L)混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。
[0147]2.3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDSjEDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復(fù)2次。
[0148]2.4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復(fù)合物，備用(此步應(yīng)清晰可見磁珠)。
[0149](3) SAT核酸擴(kuò)增檢測(cè)
[0150]3.1向樣品處理管中加入40μ I反應(yīng)檢測(cè)液(40μ I HuHlNl反應(yīng)液+2.5 μ IHuHlNl檢測(cè)液)洗滌磁珠。HuHlNl反應(yīng)液具體包含Tris 30mM, MgCl220mM, dNTP 5mM,NTP 8mM, PVP40 5%, KCl 25mM ；HuHlNl檢測(cè)液中T7引物濃度為IOpmol，ηΤ7引物濃度為IOpmol，HuHlNl檢測(cè)探針濃度為8pmol，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度為8pmol。
[0151]3.2取振蕩混勻的上述反應(yīng)檢測(cè)液30 μ I加至潔凈微量反應(yīng)管，用7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應(yīng)管中加入10 μ I已預(yù)熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻。SAT酶液中含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1200U，T7RNA 聚合酶 800U/ 反應(yīng)，IOmM HEPES pH7.5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.25mM zinc acetate (乙酸鋒)、30mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl ρΗ8.0,200mM KCl，0.ImM EDTA,0.8% (v/v) Triton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三醇)；
[0152]3.3將微量反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器，42 0C反應(yīng)50分鐘，設(shè)定每I分鐘檢測(cè)一次熒光，共檢測(cè)50次。
[0153](4)結(jié)果判定
[0154]根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的曲線，設(shè)定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。
[0155]閾值設(shè)定:以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的ct值類似)
[0156]①陽(yáng)性結(jié)果判定:
[0157]FAX通道:dt < 45的樣本為陽(yáng)性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果:dt < 50的樣本為陽(yáng)性。
[0158]②陰性結(jié)果判定:
[0159]陰性結(jié)果判定:FAX通道:dt無數(shù)值或?yàn)?0，則為陰性。
[0160](5)結(jié)果
[0161]圖1顯示靈敏度的檢測(cè)圖，為保證檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，每個(gè)陽(yáng)性參考品都重復(fù)檢測(cè)2次，結(jié)果顯示:當(dāng)陽(yáng)性參考品的濃度在lOcopies/反應(yīng)時(shí)，不可同時(shí)檢出。而濃度在lOOcopies/反應(yīng)以上是，均可重復(fù)檢出。人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的靈敏度可達(dá)lOOcopies/反應(yīng)。
[0162]實(shí)施例4、人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)特異性
[0163]本檢測(cè)模式為本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用:試劑盒組成同實(shí)施例2，選取HuHlNl樣本和3例陰性樣本:柯薩奇16型病毒(CA16)、大腸桿菌0157(0157)、淋病奈瑟菌(NG)，另設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各一個(gè)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法及具體步驟同實(shí)施例3。
[0164]檢測(cè)結(jié)果如圖2，陽(yáng)性對(duì)照和HuHlNl樣本分別在dt值12.5，19時(shí)，有擴(kuò)增曲線，可判定為陽(yáng)性；而3個(gè)陰性樣本和陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直且與基線無交叉，可明確判定為陰性；3個(gè)陰性樣本為柯薩奇16型病毒(CA16)、大腸桿菌0157(0157)、淋病奈瑟菌(NG)。
[0165]實(shí)施例5、臨床樣本鼻拭子的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)[0166]本檢測(cè)模式為本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用:試劑盒組成同實(shí)施例2 (試劑盒含有IXlO5拷貝/mL HuHlNl內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)液內(nèi)含有8pmol/反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)探針)，對(duì)編號(hào)1_4的人季節(jié)性流感病毒鼻拭子標(biāo)本，以及各設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，具體包括以下檢測(cè)步驟:
[0167](I)樣本采集
[0168]由臨床醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集，檢測(cè)標(biāo)本為鼻拭子，采集方法為:將帶有聚丙烯纖維頭的拭子分別插入鼻道內(nèi)鼻腭處，將拭子侵入3-5mL生理鹽水中，密封送檢。樣本采集后48小時(shí)內(nèi)4°C保存送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室(或者_(dá)70°C保存待測(cè)，一周內(nèi)送達(dá))。
[0169](2)核酸提取
[0170]試劑盒內(nèi)包含HuHlNl內(nèi)標(biāo)，故在核酸處理中，在每個(gè)樣品處理管中加入100 μ I核酸提取液，需同時(shí)加入10μ I內(nèi)標(biāo)溶液，再混勻。其他具體操作步驟同實(shí)施例2。
[0171](3) SAT擴(kuò)增檢測(cè)
[0172]同實(shí)施例3。
[0173](4)結(jié)果判定:
[0174]根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的曲線，設(shè)定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。
[0175]閾值設(shè)定:以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的ct值類似)
[0176]①陽(yáng)性結(jié)果判定:
[0177]Fl通道(FAX通道):dt≤45的樣本為陽(yáng)性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測(cè)，
[0178]檢測(cè)結(jié)果Fl通道:dt < 50的樣本為陽(yáng)性。
[0179]②陰性結(jié)果判定:F1通道dt無數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道(VIC通道，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長(zhǎng)相近):dt ( 45，則為陰性。
[0180]質(zhì)量控制:每次檢測(cè)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，且結(jié)果應(yīng)同時(shí)滿足陽(yáng)性對(duì)照Fl通道:dt ≤ 45 ;陰性對(duì)照Fl通道:dt無數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道:dt ≤45，否則此次檢測(cè)結(jié)果視為無效。
[0181]使用本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果如圖3(F1熒光通道)和圖4(F2熒光通道)所示，熒光素通道Fl為FAM，F(xiàn)2為VIC。根據(jù)Fl通道和F2通道的dt值情況，判定樣本1，2，4為陽(yáng)性，樣本3為陰性(F2通道內(nèi)，樣本1-4及陰陽(yáng)性對(duì)照的內(nèi)標(biāo)均可檢出，反應(yīng)體系沒有受環(huán)境影響，排除假陰性)，其結(jié)果與凝膠電泳檢測(cè)完全結(jié)果一致(圖5，+代表陽(yáng)性對(duì)照，-代表陰性對(duì)照，M代表mark)，表明本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)臨床樣本咽拭子中的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)準(zhǔn)確性高，且擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間僅需50分鐘，具有周期短、高靈敏度、高特異性、低污染和反應(yīng)穩(wěn)定的特點(diǎn)。
[0182]根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無須過多實(shí)驗(yàn)即可對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)施，并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不足構(gòu)成對(duì)本發(fā)明限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學(xué)上或生物上結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的制劑替代在此描述的制劑，或?qū)Ρ景l(fā)明相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動(dòng)，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包含有一條序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的捕獲探針，一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物T7和nT7，和一條用于與在Τ7 RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于:所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HuHlNl檢測(cè)引物由Τ7引物和ηΤ7引物組成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl檢測(cè)探針存在于一 HuHlNl檢測(cè)液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含有HuHlNl內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；所述HuHlNl內(nèi)標(biāo)為HuHlNl核苷酸序列(HuHlNl RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo),可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物07和ηΤ7引物)，由序列表中序列7所示的HuHlNlIC RNA ;所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)，且所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于HuHlNl檢測(cè)液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)，其中: 裂解液:含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液:含捕獲探針和磁珠； 洗滌液:含NaCl和SDS ； HuHlNl反應(yīng)液:含dNTP和NTP ； HuHlNl檢測(cè)液:含T7引物、nT7引物、HuHlNl檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針； SAT酶液:含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Τ7 RNA聚合酶； HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl) HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物； HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理鹽水； HuHlNl內(nèi)標(biāo)=HuHlNl IC RNA(序·列如序列表中序列7所示)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中一個(gè)反應(yīng)單位中各種試劑組成如下:
(1)裂解液:HEPES25-250mM，(NH4)2S045-50mM ； (2)核酸提取液:HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 μ M (優(yōu)選為 5-25 μ Μ)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；
(3)洗滌液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
(4)HuHlNl 反應(yīng)液:Tris 10_50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM(優(yōu)選為 0.5_5mM)，NTPl-20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；(5)HuHlNl檢測(cè)液:將HuHlNl檢測(cè)引物和HuHlNl檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可；其中T7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為IOpmol/反應(yīng)，HuHlNl檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為8pmol/反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為8pmol/反應(yīng)； (6)SAT 酶液=M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))、T7 RNA聚合酶 200-2000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應(yīng))、2_10mM HEPES ρΗ7.5、IO-1OOmMN-acetyl_L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、IO-1OOmM trehalose、40_200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol ； (7)HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照；含IO2-1O5拷貝/mL人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl) HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物； (8)HuHlNl陰性對(duì)照:不含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液； (9)HuHlNl內(nèi)標(biāo):含IO2-1O5拷貝/mLHuHlNl IC RNA(序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:由A盒即標(biāo)本處理單元和B盒即核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元組 成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述HuHlNl反應(yīng)液、HuHlNl檢測(cè)液、SAT酶液、HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照及HuHlNl內(nèi)標(biāo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于:所述HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl RNA以下述方法制備: 1)用化學(xué)合成法合成HuHlNlHA基因中無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)； 2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒； 3)HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，命名為pGEM? -T-HuHlNl菌株，貯存于_70°C ； 4)純化去除DNA，并定量、鑒定RNA； 存在HuHlNl內(nèi)標(biāo)時(shí)，體外轉(zhuǎn)錄的HuHlNl IC RNA以下述方法制備: (1)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同HuHlNl靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)； (2)將片段克隆到pGEM?-T載體中，構(gòu)建HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒； (3)HuHlNl內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM?-T-HuHlNlIC菌株，貯存于_70°C ； (4)純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。
9.權(quán)利要求1-8任一所述人季節(jié)性流感病毒HlNl(HuHlNl)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質(zhì)之一: (I)可與序列表中序列I所示的人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TC0,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；(2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNlRNA)的DNA拷貝的HuHlNl檢測(cè)引物T7和ηΤ7，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于與在Τ7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述HuHlNl靶標(biāo)核酸(HuHlNl RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HuHlNl檢測(cè)探針，所述HuHlNl檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)； (4)內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，內(nèi)標(biāo)為HuHlNl核苷酸序列(HuHlNlRNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與(I)所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(Τ7和ηΤ7引物)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
10.一種權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒的使用方法，用于人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下操作: 1)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的人季節(jié)性流感病毒HlNl(HuHlNl)，得到含有人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)核酸的裂解液； 2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在HuHlNl內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入HuHlNl內(nèi)標(biāo)，使捕獲探針與靶標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到人季節(jié)性流感病毒HlNl (HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHlNl IC RNA: 3)將步驟2)提取的人季節(jié)性流感病毒HlNl(HuHlNl)的核酸(RNA)和HuHINIIC RNA加入由HuHlNl反應(yīng)液和HuHlNl檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3: I ；· 4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照HuHlNl陽(yáng)性對(duì)照、HuHlNl陰性對(duì)照和HuHlNl內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103525946SQ201210225255
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】方亮, 馮金夢(mèng), 于明輝, 居金良 申請(qǐng)人:上海仁度生物科技有限公司