專利名稱：甲型H1N1流感病毒IgM和總抗體檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速 檢測甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙。
背景技術(shù)：
甲型Hmi流感病毒是一種新型的流感病毒，2009年在世界范圍內(nèi)大流行，嚴重 危害人類的健康。其“Ha”指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、“Na”指的是神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。Hmi是甲型流感病毒的一 種，也是危害最大的病毒之一。在歷史上曾造成數(shù)次大流行。目前對甲型Hmi流感檢測的主要方法是PCR基因擴增診斷方法，鼻咽試紙抗原診 斷方法等。在抗體檢測方面，有ELISA等檢測方法，但用膠體金類免疫層析技術(shù)對甲型Hmi IgM抗體進行檢測尚未有相關(guān)報道。對Hmi IgM和總抗體抗體檢測主要有已下作用1 對Hmi流感進行輔助診斷。 部分Hmi感染的病程較長，可達2周已上，而IgM在5-7天時即可檢測出來，并且IgM的存 在時間較短，是現(xiàn)癥感染的標志，對疾病的治療有重要的作用；若檢測只有IgG抗體而沒有 IgM抗體，則是既往感染，可排除現(xiàn)癥感染。對免疫接種的效果進行評價，從數(shù)據(jù)上看，目前 HlNl接種的有效率約為90%，尚有10%的人需要篩選出來重新接種或用其它方式進行該 病的預(yù)防。IgM的早期檢出和IgG長期存能從兩個方面評價疫苗的反應(yīng)性和有效性?？紤] 到感染和接種的人群巨大，運用一種快速、簡便、有效的抗體檢測方法是必要的。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，在抗體檢測方面已得到較為廣泛運用， 基本原理如下利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或 抗體，檢測時當樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結(jié) 合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測T線， 通過檢測線的有無實現(xiàn)對結(jié)果的判定。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合 現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，具有操 作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。本實用新型提供一種甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于塑料 支撐板8 —端連接上樣墊1，上樣墊1的一端緊密壓接含有標記Hmi特異性的血球凝集素 Ha或Hmi特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原的膠體金墊2，膠體金墊2 —端緊 密壓接硝酸纖維素NC膜3，硝酸纖維素NC膜3包被有相互分離的檢測線T15、檢測線T26 和質(zhì)控C線，檢測線T15為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測線T26為包被在NC膜上的 HlNl特異性的血球凝集素Ha或Hmi特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原，質(zhì)控 C線7為包被在NC膜上的抗Hmi抗體，硝酸纖維素NC膜3的另一端連接吸樣墊4形成試紙。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于所述的抗原為Hmi 特異性的血球凝集素(Ha)和神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，抗原可以從Hmi病毒中純化提取或利 用基因工程重組表達。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于所述的上樣墊1為 玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊4由吸水濾紙構(gòu)成。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于，所述的抗原的包 被方法為以0. OlM PH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成l_2mg/ml的溶液， 以0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人Hmi特異性的血球凝集素(Ha)和或神經(jīng)氨 酸酶(Na)抗原配制成0. 5-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)進行劃 線，包被T1、T2線，同時在NC膜上部包被抗Hmi抗體作為C線，劃線后將NC膜在干燥間溫 度20-25°C，濕度小于30%干燥2-5小時。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于，所述的混合抗原 標記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶 液，制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0. 2M K2CO3調(diào)至pH8. 0，按IOOml膠體金溶 液加入0. 5-2mg Hmi特異性的血球凝集素(Ha)和(或)神經(jīng)氨酸酶(Na)抗原，室溫攪拌 2小時，加入牛血清白蛋白BSA，0. 聚乙二醇PEG20000封閉20min，12000r/m離心30 分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按Iml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖 維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20-25°C，濕度小于30%干燥2-4小時，制成膠體金墊。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于所述的試紙的裝配 方法為在干燥室內(nèi)(溫度20-25°C，濕度小于30%)，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放 置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在 膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5)；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭 吸樣墊的1/10)；最后用裁剪機將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條。切好的試紙條可以 再裝入塑料卡內(nèi)，形成檢測卡。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于，檢測方法為將被 檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入50-100U1被檢樣品， 樣品溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在20分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并 判定檢測結(jié)果。本實用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)檢測甲型Hmi流 感病毒IgM和總抗體檢測試紙。采用膠體金標記甲型Hmi流感病毒抗原，包被抗人IgM和 甲型Hmi流感病毒抗原實現(xiàn)對血液中抗甲型Hmi流感病毒抗體的檢測。具有操作簡便、 反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。

附圖為甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖。附圖符號說明1 上樣墊；2 膠體金墊；3 :NC膜；4 吸樣墊5 檢測線Tl ；6 檢測線T2 ；7 質(zhì)控 (C)線；8 塑料支撐板
具體實施方式
實施例制備甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙1主要材料1. 1特異性甲型Hmi流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.產(chǎn)品，為重組抗 原，用于膠體金標記；鼠抗人IgM:軍事醫(yī)學科學院產(chǎn)品，抗Ha抗體，用Ha免疫山羊自制，用 于NC膜包被；氯金酸Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜Millipore公司產(chǎn)品；牛血清 白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純試 劑。1. 2臨床血清由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，其中在近期接種Hmi疫苗樣本80份，未接 種疫苗樣本120份。1. 3 甲型 HlNl 流感病毒 IgM 和 IgG ELISA 試劑盒，Sino Biological Inc.產(chǎn)品。2 方法2. 1甲型Hmi流感病毒Ha重組抗原的膠體金標記氯金酸-檸檬酸三鈉還原法 制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2CO3將溶液調(diào) 到pH7. 0、pH8. 0和pH9. 0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100ml溶液加入 0. 5mg、lmg、l. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時，再滴加入 到終濃度為0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA進行封閉20min,標記結(jié)束后以12000r/m離心， 棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液，PH8. 0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性劑中。然后將標記膠體金溶液按Iml溶液鋪22cm2的比例加樣于無紡 布上，在溫度20-25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時，制成膠體金墊。2. 2NC膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS將鼠抗人 IgM分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ ml，甲型Hmi流感病毒Ha重組抗原分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀 在NC膜下部按lul/cm進行分別劃線包彼，同時在NC膜上部包被抗Ha抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì) 控，包被完成后將NC膜在在溫度20-25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2_5小時。2.3甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體快速檢測試紙的組裝在干燥室內(nèi)(溫度 20-25°C，相對濕度< 30% )取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘 貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼 上樣墊(搭膠體金墊的1/5)；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10)；然后用裁 剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成 甲型Hmi流感病毒IgM抗體檢測試劑卡。2. 4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在 上樣墊上加入50-100U1被檢樣品，若樣品中含抗甲型Hmi流感病毒IgM或IgG抗體，則和 樣品墊上的標記甲型Hmi流感病毒抗原的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴散到NC膜上進一 步層析，當遇到包被在NC膜上Tl線處的鼠抗人IgM時，復(fù)合物則又和包被抗IgM抗體結(jié) 合，被捕獲在包被處；當遇到包被在NC膜上T2線處的Hmi抗原時，復(fù)合物則又和包被抗原 體結(jié)合，被捕獲在包被線T2處；當被捕獲的膠體金復(fù)合物達到一定數(shù)量時，則形成一條肉 眼可見的T或T2線；若血清中不含特異性抗體，則不能形成免疫復(fù)合物，亦不能形成T線， C線作為試劑的質(zhì)控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在5、10、15、20,30和45分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標記、包被的試劑進行組合配對，制備小樣，利 用質(zhì)控血清對試劑進行測試，發(fā)現(xiàn)最佳組合。2. 6臨床血清檢測用本試劑按檢測方法對所有臨床血清進行檢測，同時用Sino Biological Inc. IgM和IgG抗體檢測ELISA試劑進行對照檢測。3 結(jié)果3. 1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定了試紙的最佳標記pH值為8. 0 ；重組 混合抗原的最佳標記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為IOmM硼酸酸鹽緩 沖液，pH8. 0，含0. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM包被 濃度為lmg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時間為5-20分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品 時可能需要適當調(diào)整。3. 2臨床血清檢測以ELISA試劑為對照，80份近期接種甲型Hmi流感病毒疫苗人 員的樣本中，在對Hmi IgM抗體的檢測中，本試劑IgM檢測出陽性65份，ELISA檢測出IgM 陽性血清72份，靈敏度=65/72 = 90. 1% ；本試劑IgM對120份未接種Hmi疫苗人員樣 本中檢出陰性為112份，和ELISA試劑的檢測出率完全一致，相對特異性100%。P > 0. 05。 在對Hmi IgG抗體的檢測中，80份近期接種甲型Hmi流感病毒疫苗人員的樣本中，檢測出 陽性70份，ELISA檢測出陽性血清72份，靈敏度=70/72 = 97.2% ；本試劑對120份未接 種Hmi疫苗人員樣本中檢出陰性為110份，ELISA試劑的檢測陰性為112分，相對特異性 為 110/112 = 98. 2%o P > 0. 05。臨床檢測表明本試劑的性能和ELISA試劑相比無顯著性差異，適合臨床檢測需要。
權(quán)利要求一種甲型H1N1流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于塑料支撐板(8)一端連接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標記H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素NC膜(3)包被有相互分離的檢測線T1(5)、檢測線T2(6)和質(zhì)控C線，檢測線T1(5)為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測線T2(6)為包被在NC膜上的H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經(jīng)氨酸酶Na抗原，質(zhì)控C線(7)為包被在NC膜上的抗H1N1抗體，硝酸纖維素NC膜(3)的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型Hmi流感病毒IgM和總抗體檢測試紙，其特征在于所述 的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊(4)由吸水濾紙構(gòu)成。
專利摘要本實用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種甲型H1N1流感病毒H1N1IgM和總抗體聯(lián)合檢測試紙，采用膠體金標記甲型H1N1流感病毒抗原，包被抗人IgM和甲型H1N1流感病毒抗原實現(xiàn)對血液中抗甲型H1N1流感病毒抗體的檢測。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK201637745SQ201020142108
公開日2010年11月17日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者李洲, 楊發(fā)青 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司