專利名稱：微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上油菜籽產(chǎn)量最大的國(guó)家，年產(chǎn)量已近1200萬(wàn)噸，菜籽粕是菜籽油加工的主 要副產(chǎn)物，占菜籽總量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白氨基酸組成合理，賴氨酸、 胱氨酸和蛋氨酸的含量較高，與WHO/FAO推薦的氨基酸組成模式相近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等于或優(yōu)于 動(dòng)物蛋白，是一種優(yōu)良的植物蛋白。但由于菜籽粕存在一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如硫代葡萄糖甙、 植酸、多酚類物質(zhì)等，加工過(guò)程中難以脫除，使菜籽粕只能應(yīng)用于飼料或肥料工業(yè)，利用效 能低，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。因此，開發(fā)利用菜籽蛋白質(zhì)資源己成為大勢(shì)所趨，由于菜籽蛋白水解 成多肽后，具有更好的生物活性和加工特性，因此加強(qiáng)對(duì)菜籽肽的研究與開發(fā)，并使之工業(yè) 化，對(duì)有效利用我國(guó)的植物蛋白資源，提高我國(guó)人民的營(yíng)養(yǎng)水平，具有重大的社會(huì)意義和良 好的經(jīng)濟(jì)效益。
目前我國(guó)對(duì)菜籽肽的研究生產(chǎn)剛剛起步，其方法主要為酶法，即是以菜籽分離蛋白為原 料，利用商業(yè)蛋白酶制劑水解菜籽蛋白制備菜籽肽。該方法以菜籽分離蛋白為原料，生產(chǎn)所 用酶制劑用量大且價(jià)格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，并且由于菜籽粕或菜籽分離蛋白中抗?fàn)I養(yǎng) 因子不能完全脫除，影響了蛋白酶的活性，水解程度不高，難以形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
CN200810243461. 6、 CN200810106919. 3公開了生物發(fā)酵方法對(duì)菜籽粕改性的方法，雖然 脫除了大部分菜籽蛋白中的硫代葡萄糖甙(以下簡(jiǎn)稱硫甙)等有害物質(zhì)，得到菜籽肽或含有 菜籽肽的產(chǎn)品，但是產(chǎn)品的可溶性氮含量和生物活性仍有待進(jìn)一步提高，且仍有一定量的硫 代葡萄糖甙殘留于產(chǎn)品內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，可以有效提高產(chǎn)品的可溶性氮含量和生物活性。 所述微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，包括以下步驟
(1) 將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
(2) 將地衣芽孢桿菌接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；
(3) 發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；
(4) 粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。
步驟(1)中，菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:5 1:40 g/mL配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中 營(yíng)養(yǎng)液的pH為8. 0 10. 0，營(yíng)養(yǎng)液中包括葡萄糖O. 1% 2%， MnS04 0. 1% 2. 0%，上述百分比 為質(zhì)量體積百分比(質(zhì)量體積百分比指100ml溶液中含某種物質(zhì)多少克，即P/Flg/100ml)。 所述固液比優(yōu)選為l: 15 1: 20 g/mL，營(yíng)養(yǎng)液的pH為9.0 10。菜籽粕粉的粒徑不大于200 y m。
步驟(2)中，將地衣芽孢桿菌接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，使菌體濃度為l(^ l(/個(gè)/mL，發(fā) 酵溫度25 4(TC，發(fā)酵時(shí)間1 5天。優(yōu)選的方案是，地衣芽孢桿菌分別經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)得 到菌體濃度為107 108個(gè)/1^的種子液，接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。種子液的接種量?jī)?yōu)選為2% 8%，更優(yōu)選為3%-5%，以種子液相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的百分比計(jì)。
所述地衣芽孢桿菌活化、擴(kuò)大培養(yǎng)均采用常規(guī)方法， 一般得到種子液的方法如下將地 衣芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后挑取地衣芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大 培養(yǎng)，其中斜面培養(yǎng)基配方為牛肉膏3 g，蛋白胨IO g， NaCl 5g，瓊脂20 g，水1000mL， pH 7.2-7.4，種子培養(yǎng)基配方為牛肉膏3 g，蛋白胨10g， NaCl 5 g，水1000mL， pH 7.0。
步驟(3)可以公知的方法進(jìn)行固液分離，如可以采用真空過(guò)濾器或壓力過(guò)濾器去除殘 渣，也可以采用離心法，相對(duì)離心力為2500g 10000g。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和干燥。優(yōu)選的 方案是，將粗提液采用活性炭脫色，離子交換樹脂或反滲透脫鹽，采用減壓濃縮、熱風(fēng)干燥 、冷凍干燥或噴霧干燥方式干燥，得到菜籽肽粉。
作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析
和凝膠過(guò)濾，收集具有抗氧化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。當(dāng)然也可以采用其余的分離純化方法，如超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，經(jīng)脫 鹽柱脫鹽，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾，收集具有生物活性專一的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到菜籽肽。當(dāng)超 濾膜截留分子量較小時(shí)，則可直接經(jīng)凝膠過(guò)濾，得到菜籽肽，如所述超濾膜為截留分子量為 3kDa的超濾膜，分子量《3kDa的組分經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾，色譜條件條件為填料為反相層析凝膠 ，流速lmL/min，溫度25'C，流動(dòng)相為pH值7.0的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，直接以菜籽粕為原料微生物液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物活性專一的菜 籽肽，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，不需要對(duì)其進(jìn)行酸、堿的處理，更不需要分離出菜籽蛋白 ，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，而且變廢為寶，有利于環(huán)境保護(hù)，以微生物發(fā)酵取代純酶制劑水 解菜籽蛋白制備多肽，可以節(jié)省大量昂貴的生物酶制劑。選用地衣芽孢桿菌，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵 ，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物和酶類，充分發(fā)揮其水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，能有效降解菜籽 粕種的有毒物質(zhì)，水解蛋白質(zhì)，達(dá)到人和動(dòng)物的食用標(biāo)準(zhǔn)，提高產(chǎn)品的可溶性氮含量、生物 活性和菜籽肽得率，還含有多種對(duì)人體有益的功能因子?？傊?，本發(fā)明對(duì)環(huán)境友好，反應(yīng)條 件溫和，能充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，是一種低成本、適合工業(yè)化 大批量制備菜籽肽的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
(1) 制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)液成分葡萄糖2.0 g， MnS041.0 g，自來(lái)水IOOO mL， pH為9. 5。將雙低菜籽粕粉 碎至粒徑為100ym左右，用營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:15 g/mL的比例與菜籽粕混合均勻，在121。C下 滅菌30min后得到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐內(nèi)。
(2) 液態(tài)發(fā)酵 ①種子液的制備
斜面培養(yǎng)基配方牛肉膏3 g，蛋白胨IO g， NaCl 5，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL， pH 7. 2-7. 4。
種子培養(yǎng)基配方牛肉膏3 g，蛋白胨IO， NaCl 5 g，自來(lái)水1000mL， pH 7.0。 從活化后的菌種培養(yǎng)斜面中，挑取兩環(huán)地衣芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口， 35°C， 120r/min，搖床培養(yǎng)24h，得到菌體濃度達(dá)到l()8個(gè)/mL的種子液。
②取種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，使菌體濃度為106個(gè)/mL，調(diào)發(fā)酵溫度為31 °C，轉(zhuǎn)速180r/min震蕩培養(yǎng)，定時(shí)通風(fēng)，發(fā)酵1 2天。
(3) 固液分離，得到菜籽肽的粗提液
取出發(fā)酵培養(yǎng)基，先用2500g相對(duì)離心力低速離心分離去除粕渣，再用10000g相對(duì)離心 力高速離心去雜，得菜籽肽粗提液，將該菜籽肽粗提液噴霧干燥后測(cè)得菜籽肽得率為30 32%。
(4) 提純
上述粗提液分別通過(guò)截留分子量為1 OkDa的超濾膜進(jìn)行超濾，將分子量小于1 OkDa的組分 經(jīng)過(guò)離子交換柱(HiTrap 離子交換柱Q XL;流速lmL/min; Tris-HCL緩沖液pH8. 0，溫 度25°C)，疏水層析(HiTrapTM疏水層析柱PhenyL FF;流速lmL/min;溫度25°C)和 凝膠過(guò)濾(Superdex P印tide HR 10/30;流速0. 2mL/min;溫度25°C)，收集具有抗氧 化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到抗氧化性專一的菜籽肽。
所得菜籽肽的抗氧化生物活性指標(biāo)如下 菜籽肽還原能力產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，A70(^為0.951;
自由基清除率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，DPPH*自由基清除率為85%; 金屬螯合力產(chǎn)品濃度5mg/mL時(shí)，金屬螯合力為45%; 脂質(zhì)氧化抑制率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，脂質(zhì)氧化抑制率為50%。 實(shí)施例2
與實(shí)施例l不同之處在于，按下述方法進(jìn)行(4)提純
將上述粗提液分別通過(guò)截留分子量為3kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，分子量《3kDa的組分經(jīng)過(guò) 凝膠過(guò)濾(柱SOURCE 5RPC，流速lmL/min，溫度25。C;磷酸鹽緩沖液pH7.0)，收集具 有降血壓生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到生物活性專一的菜籽肽。該生物活性專一的菜 籽肽降血壓生物活性指標(biāo)為抑制50。/。的ACE (血管收縮素轉(zhuǎn)移酶)活性所需抑制劑的濃度( IC50)為O. 15 mg/mL。實(shí)施例3
與實(shí)施例l不同之處在于，按下述方法進(jìn)行(4)提純
調(diào)節(jié)菜籽肽粗提液pH至6. 5 7. 5，加入10g/L的活性炭，于5(TC脫色、脫苦l(xiāng)h，然后高 速離心(相對(duì)離心力為12000g)去雜，經(jīng)脫鹽柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脫鹽 后，再經(jīng)噴霧干燥獲得菜籽肽，其蛋白質(zhì)含量(干基，NX6.25) 82.5%，可溶性氮含量90% ，分子量在500Da 5000 Da的肽含量60。/。，硫甙未檢出。本發(fā)明所得菜籽肽可溶性氮含量和 分子量在1000Da 5000Da的肽含量都很高，因此產(chǎn)品的溶解性較好，有利于腸道吸收和生物 活性功能的發(fā)揮，硫甙未檢出，產(chǎn)品安全性更好。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)將地衣芽孢桿菌接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；(3)發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。
2 如權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步驟(1)中，菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:5 1:40 g/mL配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中營(yíng)養(yǎng)液 的pH為8. 0 10. 0，營(yíng)養(yǎng)液中包括葡萄糖O. 1% 2%， MnS040. 1% 2. 0%，上述百分比為質(zhì)量體 積百分比。
3 如權(quán)利要求2所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步 驟(1)中，所述固液比為l: 15 1: 20 g/mL，營(yíng)養(yǎng)液的pH為9. 0 10。
4 如權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步 驟(1)中，菜籽粕粉的粒徑不大于200ym。
5 105 107個(gè)/mL ，發(fā)酵溫度25 40。C，發(fā)酵時(shí)間1 5天。
6 如權(quán)利要求5所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步 驟(2)中，地衣芽孢桿菌分別經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)得到菌體濃度為107 108個(gè)/mL的種子液， 接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
7 如權(quán)利要求6所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步 驟(2)中，種子液的接種量為2% 8%。
8 如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其 特征在于步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和干燥。
9 如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析和凝膠過(guò)濾，收集具有抗氧 化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。
10 如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法， 其特征在于步驟(4)中，所述提純方法包括通過(guò)超濾膜進(jìn)行超濾，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾，收集生 物活性專一的組分。
11 如權(quán)利要求10所述的微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 步驟(4)中，所述超濾膜為截留分子量為3kDa的超濾膜，分子量《3kDa的組分經(jīng)過(guò)凝膠過(guò) 濾，色譜條件條件為填料為反相層析凝膠，流速lmL/min，溫度25'C，流動(dòng)相為pH值7.0的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，可以有效提高產(chǎn)品的可溶性氮含量和生物活性。所述微生物發(fā)酵制備菜籽肽的方法，包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)將地衣芽孢桿菌接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；(3)發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，選用地衣芽孢桿菌，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物和酶類，充分發(fā)揮其水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，能有效降解菜籽粕種的有毒物質(zhì)，水解蛋白質(zhì)，提高產(chǎn)品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率。
文檔編號(hào)C12P21/06GK101654693SQ20091030594
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者榮 何, 朱均旺, 王立峰, 建 袁, 晶 金, 鞠興榮, 高瑀瓏 申請(qǐng)人:南京財(cái)經(jīng)大學(xué)