專利名稱：混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上油菜籽產(chǎn)量最大的國(guó)家，年產(chǎn)量已近1200萬(wàn)噸，菜籽粕是菜籽油加工的主 要副產(chǎn)物，占菜籽總量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白氨基酸組成合理，賴氨酸、 胱氨酸和蛋氨酸的含量較高，與WHO/FAO推薦的氨基酸組成模式相近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等于或優(yōu)于 動(dòng)物蛋白，是一種優(yōu)良的植物蛋白。但由于菜籽粕存在一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如硫代葡萄糖甙、 植酸、多酚類物質(zhì)等，加工過程中難以脫除，使菜籽粕只能應(yīng)用于飼料或肥料工業(yè)，利用效 能低，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。因此，開發(fā)利用菜籽蛋白質(zhì)資源己成為大勢(shì)所趨，由于菜籽蛋白水解 成多肽后，具有更好的生物活性和加工特性，因此加強(qiáng)對(duì)菜籽肽的研究與開發(fā)，并使之工業(yè) 化，對(duì)有效利用我國(guó)的植物蛋白資源，提高我國(guó)人民的營(yíng)養(yǎng)水平，具有重大的社會(huì)意義和良 好的經(jīng)濟(jì)效益。
目前我國(guó)對(duì)菜籽肽的研究生產(chǎn)剛剛起步，其方法主要為酶法，即是以菜籽分離蛋白為原 料，利用商業(yè)蛋白酶制劑水解菜籽蛋白制備菜籽肽。該方法以菜籽分離蛋白為原料，生產(chǎn)所 用酶制劑用量大且價(jià)格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，并且由于菜籽粕或菜籽分離蛋白中抗?fàn)I養(yǎng) 因子不能完全脫除，影響了蛋白酶的活性，水解程度不高，難以形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
CN200810243461. 6、 CN200810106919. 3公開了生物發(fā)酵方法對(duì)菜籽粕改性的方法，雖然 脫除了菜籽蛋白中的硫代葡萄糖甙等有害物質(zhì)，得到菜籽肽或含有菜籽肽的產(chǎn)品，但是產(chǎn)品 的可溶性氮含量和生物活性仍有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，可以有效提高產(chǎn)品的可溶性氮含量和生物活性。 所述混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，包括以下步驟
(1) 將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
(2) 將雅致放射毛霉與宇佐美曲霉接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；
(3) 發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；
(4) 粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。
步驟(1)中，菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:5 1:40 g/mL配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中 營(yíng)養(yǎng)液的pH為4. 0 10. 0，營(yíng)養(yǎng)液中包括葡萄糖O. 1% 5%， KH2P04 0. 1% 2. 0%，上述百分比 為質(zhì)量百分比(質(zhì)量體積百分比指100ml溶液中含某種物質(zhì)多少克，即P/Flg/100ml)。優(yōu)選所 述固液比為l: 15 1: 20 g/mL，營(yíng)養(yǎng)液的pH為5. 5 6. 5。菜籽粕粉的粒徑不大于200 y m。
步驟(2)中，將雅致放射毛霉與宇佐美曲霉接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，使菌體濃度(即接 入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的兩種菌種的總菌體濃度)為l()S l(/個(gè)/mL，發(fā)酵溫度20 4(TC，優(yōu)選 28 32°C，發(fā)酵時(shí)間1 5天。三種菌種的混合比例可以任意，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可以經(jīng) 實(shí)驗(yàn)確定較優(yōu)的比例或比例范圍。優(yōu)選的方案是，雅致放射毛霉與宇佐美曲霉分別經(jīng)活化、 擴(kuò)大培養(yǎng)得到菌體濃度為107 108的種子液，再將兩種種子液按l: 1 2: l的體積比混合， 得到發(fā)酵種子液，接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵種子液的接種量?jī)?yōu)選為2% 8%，更優(yōu)選為 3%-5%，以種子液相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的百分比計(jì)。
所述雅致放射毛霉或宇佐美曲霉活化、擴(kuò)大培養(yǎng)均采用常規(guī)方法， 一般得到種子液的方 法如下將雅致放射毛霉或宇佐美曲霉接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后接種于平板培養(yǎng)基上 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，過濾， 得到種子液。
所述斜面培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000mL;平板擴(kuò) 大培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000mL。
步驟(3)可以公知的方法進(jìn)行固液分離，如可以采用真空過濾器或壓力過濾器去除殘 渣，也可以采用離心法，相對(duì)離心力為1000g 15000g。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和干燥。優(yōu)選的方案是，將粗提液采用活性炭脫色，離子交換樹脂或反滲透脫鹽，采用減壓濃縮、熱風(fēng)干燥 、冷凍干燥或噴霧干燥方式干燥，得到菜籽肽粉。
作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析
和凝膠過濾，收集具有抗氧化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。當(dāng) 然也可以采用其余的分離純化方法，如超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，經(jīng)脫 鹽柱脫鹽，經(jīng)過凝膠過濾，收集具有生物活性專一的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到菜籽肽。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，直接以菜籽粕為原料混菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物活性專一的菜籽 肽，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，不需要對(duì)其進(jìn)行酸、堿的處理，更不需要分離出菜籽蛋白， 生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，而且變廢為寶，有利于環(huán)境保護(hù)，以微生物發(fā)酵取代純酶制劑水解 菜籽蛋白制備多肽，可以節(jié)省大量昂貴的生物酶制劑。同時(shí)不同微生物混合發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生多種 代謝產(chǎn)物和酶類，酶切位點(diǎn)不同，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，能有 效降解菜籽粕種的有毒物質(zhì)，水解蛋白質(zhì)，達(dá)到人和動(dòng)物的食用標(biāo)準(zhǔn)，提高產(chǎn)品的可溶性氮 含量、生物活性和菜籽肽得率，還含有多種對(duì)人體有益的功能因子?？傊景l(fā)明對(duì)環(huán)境友 好，反應(yīng)條件溫和，能充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，是一種低成本、 適合工業(yè)化大批量制備菜籽肽的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
(1) 制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)液成分葡萄糖5g， KH2P04 2 g， 1000mL， pH為6. 5。將普通菜籽粕粉碎至粒徑為 100ym左右，用營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:30 g/mL的比例與菜籽粕混合均勻，在12rC下滅菌30min 后得到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐內(nèi)。
(2) 液態(tài)發(fā)酵 ①雅致放射毛霉種子液的制備
斜面培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 平板擴(kuò)大培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 將雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28'C恒溫培養(yǎng)4天，然后接種于平板于28'C進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，4天后用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，用4層無(wú)菌 鏡頭紙過濾孢子懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)菌體濃度為lXl()8個(gè)/mL。
② 宇佐美曲霉種子液的制備
斜面培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 平板擴(kuò)大培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 將宇佐美曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28'C恒溫培養(yǎng)4天，然后接種于平板于28'C進(jìn)行擴(kuò)
大培養(yǎng)，4天后用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，用4層無(wú)菌鏡
頭紙過濾孢子懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)菌體濃度為lXl()8個(gè)/mL。
③ 混菌發(fā)酵種子液的制備將雅致放射毛霉發(fā)酵種子液與宇佐美曲霉發(fā)酵種子液按 1:1 (v/v)混合即得混菌發(fā)酵種子液。
@按3%的接種量取發(fā)酵種子液接入裝有液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，使菌體濃度為106 個(gè)/mL，調(diào)發(fā)酵溫度為3(TC，轉(zhuǎn)速180r/min，震蕩培養(yǎng)，定時(shí)通風(fēng)，發(fā)酵3-4天。
(3) 固液分離，得到菜籽肽的粗提液
取出液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)壓力過濾裝置過濾去除粕渣，即得菜籽肽粗提液，將該菜籽肽 粗提液噴霧干燥后測(cè)得菜籽肽得率為31. 5%。
(4) 提純
將上述粗提液經(jīng)過離子交換(HiTrap 離子交換柱SP XL;流速lmL/min，磷酸鹽緩 沖液pH 6.5，溫度25°C)，疏水層析(HiTrapTM疏水層析柱PhenyL FF;流速lmL/min; 溫度25°C)和凝膠過濾(Superdex P印tide HR 10/30;流速0. 2mL/min;溫度25°C) ，收集具有抗氧化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到抗氧化性專一的菜籽肽。
所得菜籽肽的抗氧化生物活性指標(biāo)如下
菜籽肽還原能力產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，A7oonm為1.065; 自由基清除率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，DPPH*自由基清除率為88%; 金屬螯合力產(chǎn)品濃度10mg/mL時(shí)，金屬螯合力為53%; 脂質(zhì)氧化抑制率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，脂質(zhì)氧化抑制率為80%。實(shí)施例2
與實(shí)施例l不同之處在于，按下述方法進(jìn)行(4)提純
調(diào)節(jié)菜籽肽粗提液pH至7.0，加入10g/L的活性炭，于5(TC脫色、脫苦1.5h，然后高速離 心(相對(duì)離心力為10000g)去雜，上清液經(jīng)脫鹽柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脫 鹽后，噴霧干燥菜籽肽粗提液得菜籽肽，其蛋白質(zhì)含量(干基，NX6.25)為88%，可溶性氮 含量為94%，分子量在1000Da 5000Da的肽含量為65。/。，硫甙含量8ymoL/g。
實(shí)施例3
(1) 制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)液成分葡萄糖5g， KH2P04 2 g， 1000mL， pH為6.0。將普通菜籽粕粉碎至粒徑為 100ym左右，用營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:15 g/mL的比例與菜籽粕混合均勻，在12rC下滅菌30min 后得到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐內(nèi)。
(2) 液態(tài)發(fā)酵
① 雅致放射毛霉種子液的制備
斜面培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 平板擴(kuò)大培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 將雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28'C恒溫培養(yǎng)4天，然后接種于平板于28'C進(jìn)行
擴(kuò)大培養(yǎng)，4天后用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，用4層無(wú)菌
鏡頭紙過濾孢子懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)菌體濃度為lXl()8個(gè)/mL。
② 宇佐美曲霉種子液的制備
斜面培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 平板擴(kuò)大培養(yǎng)基馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1000mL。 將宇佐美曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28'C恒溫培養(yǎng)4天，然后接種于平板于28'C進(jìn)行擴(kuò)
大培養(yǎng)，4天后用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，用4層無(wú)菌鏡
頭紙過濾孢子懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)菌體濃度為lXl()8個(gè)/mL。
③ 混菌發(fā)酵種子液的制備將雅致放射毛霉發(fā)酵種子液與宇佐美曲霉發(fā)酵種子液按2: 1(v/v)混合即得混菌發(fā)酵種子液。
@按5%的接種量將發(fā)酵種子液接入裝有液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，使菌體濃度為106 個(gè)/mL，調(diào)發(fā)酵溫度為32'C，轉(zhuǎn)速180r/min，震蕩培養(yǎng)，定時(shí)通風(fēng)，發(fā)酵2天。
(3) 固液分離，得到菜籽肽的粗提液
取出液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)壓力過濾裝置過濾去除粕渣，即得菜籽肽粗提液，將該菜籽肽 粗提液噴霧干燥后測(cè)得菜籽肽得率為35. 5%。
(4) 提純
將上述粗提液經(jīng)過離子交換(HiTrap 離子交換柱SP XL;流速lmL/min，磷酸鹽緩 沖液pH 6.5，溫度25°C)，疏水層析(HiTrapTM疏水層析柱PhenyL FF;流速lmL/min; 溫度25°C)和凝膠過濾(Superdex P印tide HR 10/30;流速0. 2mL/min;溫度25°C) ，收集具有抗氧化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到抗氧化性專一的菜籽肽。
所得菜籽肽的抗氧化生物活性指標(biāo)如下
菜籽肽還原能力產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，A7oonm為1. 165; 自由基清除率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，DPPH*自由基清除率為89%; 金屬螯合力產(chǎn)品濃度10mg/mL時(shí)，金屬螯合力為65%; 脂質(zhì)氧化抑制率產(chǎn)品濃度lmg/mL時(shí)，脂質(zhì)氧化抑制率為85%。 實(shí)施例4
與實(shí)施例3不同之處在于，按下述方法進(jìn)行(4)提純
調(diào)節(jié)菜籽肽粗提液pH至7.0，加入10g/L的活性炭，于5(TC脫色、脫苦1.5h，然后高速離 心(相對(duì)離心力為10000g)去雜、上清液經(jīng)脫鹽柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脫 鹽后，噴霧干燥菜籽肽粗提液得菜籽肽，其蛋白質(zhì)含量(干基，NX6.25)為92%，可溶性氮 含量為94.5%，分子量在1000Da 5000Da的肽含量為70。/。，硫甙含量4ymoL/g。
由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明所得菜籽肽可溶性氮含量和分子量在1000Da 5000Da的 肽含量都很高，因此產(chǎn)品的溶解性較好，有利于腸道吸收和生物活性功能的發(fā)揮。
權(quán)利要求
1.一種混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)將雅致放射毛霉與宇佐美曲霉接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；(3)發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。
2.如權(quán)利要求l所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于步驟(1)中，菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液按固液比1:5 1:40 g/mL配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中營(yíng)養(yǎng) 液的pH為4. 0 10. 0，營(yíng)養(yǎng)液中包括葡萄糖O. 1% 2%， KH2P04 0. 1% 2. 0%，上述百分比為質(zhì) 量體積百分比。
3.如權(quán)利要求2所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 步驟(1)中，所述固液比為l: 15 1: 20 g/mL，營(yíng)養(yǎng)液的pH為5. 5 6. 5。
4.如權(quán)利要求l所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 步驟(1)中，菜籽粕粉的粒徑不大于200ym。
5.如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法， 其特征在于步驟(2)中，將雅致放射毛霉與宇佐美曲霉接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，使菌體濃度 為105 107個(gè)/mL，發(fā)酵溫度20 40。C，發(fā)酵時(shí)間1 5天。
6.如權(quán)利要求5所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 步驟(2)中，雅致放射毛霉與宇佐美曲霉分別經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)得到菌體濃度為107 108 個(gè)/mL的種子液，再將兩種種子液按l: 1 2: l的體積比混合，得到發(fā)酵種子液，接入液態(tài) 發(fā)酵培養(yǎng)基。
7. 如權(quán)利要求6所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 所述雅致放射毛霉或宇佐美曲霉液體培養(yǎng)得到種子液的方法如下將雅致放射毛霉或宇佐美曲霉接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后接種于平板培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后用無(wú)菌水洗下 孢子，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散孢子，過濾，得到種子液。
8. 如權(quán)利要求6所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，其特征在于 步驟(2)中，發(fā)酵種子液的接種量為2% 8%。
9. 如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法， 其特征在于步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和干燥。
10. 如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法 ，其特征在于步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析和凝膠過濾，收集具有 抗氧化生物活性的組分，經(jīng)冷凍干燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)作用和降解硫甙作用，可以有效提高產(chǎn)品的可溶性氮含量和生物活性。所述混菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營(yíng)養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)將雅致放射毛霉與宇佐美曲霉接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵；(3)發(fā)酵后的液態(tài)培養(yǎng)基經(jīng)固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經(jīng)提純得到菜籽肽。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，同時(shí)不同微生物混合發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物和酶類，酶切位點(diǎn)不同，充分發(fā)揮微生物的水解蛋白質(zhì)和降解硫甙作用，有效降解菜籽粕種的有毒物質(zhì)，水解蛋白質(zhì)，提高產(chǎn)品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率。
文檔編號(hào)C12P39/00GK101643768SQ20091030595
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者榮 何, 王立峰, 建 袁, 晶 金, 鞠興榮 申請(qǐng)人:南京財(cái)經(jīng)大學(xué)