專(zhuān)利名稱(chēng)：糞便處理方法及糞便處理容器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從糞便中有效地回收核酸的糞便處理方法及糞便處理容器。本申請(qǐng)要求2008年5月12日在日本申請(qǐng)的日本特愿2008-125143號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 并將其內(nèi)容援引于此。
背景技術(shù)：
如今，與歐美同樣，日本結(jié)腸癌的患者數(shù)也在逐年急劇增加，結(jié)腸癌已占居癌 癥死亡率的前幾位。其原因認(rèn)為是日本人的飲食生活轉(zhuǎn)變成歐美型的以肉食為中心。具 體而言，每年約6萬(wàn)人左右罹患結(jié)腸癌。在按照臟器分類(lèi)的死亡數(shù)方面 ，結(jié)腸癌排在第 三位，僅次于胃癌、肺癌，預(yù)測(cè)今后也會(huì)進(jìn)一步增加。另一方面，結(jié)腸癌與其他癌不 同，通過(guò)在發(fā)病初期進(jìn)行治療，近100%能夠治愈。因此，將結(jié)腸癌作為早期癌診察的對(duì) 象是非常有意義的，用于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的檢查方法的研究和開(kāi)發(fā)正在盛行。作為用于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的檢查方法，進(jìn)行的有例如灌腸檢查、結(jié)腸鏡 (colonoscopic)檢查等。灌腸檢查是如下檢查向大腸中注入鋇使其附著于大腸的粘膜 面，照射X射線拍攝該表面的凹凸，觀察大腸的表面。另一方面，結(jié)腸鏡檢查是通過(guò)內(nèi) 窺鏡直接觀察大腸內(nèi)部的檢查。特別是結(jié)腸鏡檢查的靈敏度和特異性高，還具有能夠同 時(shí)切除息肉和早期癌的優(yōu)點(diǎn)。然而，這些檢查方法存在成本高、給受試者帶來(lái)的負(fù)擔(dān)大、伴隨并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn) 的問(wèn)題。例如，灌腸檢查中存在X射線暴露和腸梗阻的危險(xiǎn)性。另外，結(jié)腸鏡檢查由于 將內(nèi)窺鏡直接插入大腸內(nèi)因此對(duì)受試者具有侵入性。進(jìn)而，需要內(nèi)窺鏡操作熟練，能夠 檢查的設(shè)施有限。因此，這些檢查方法不適于定期體檢等以無(wú)癥狀的普通人為對(duì)象的結(jié) 腸癌檢查。近年來(lái)，作為結(jié)腸癌的一次篩查方法，正廣泛實(shí)施一種非侵入性且低成本的糞 便潛血檢查。糞便潛血檢查是調(diào)查糞便中所含的紅細(xì)胞來(lái)源的血紅蛋白的有無(wú)的檢查， 是間接預(yù)測(cè)結(jié)腸癌的存在的方法。作為糞便潛血檢查被廣泛利用的主要原因，可列舉 出可在常溫下進(jìn)行糞便的采集和保存，不需要冷藏和冷凍等特殊的保存條件；以及， 可以在普通家庭簡(jiǎn)單地進(jìn)行；操作非常簡(jiǎn)便。但是，在糞便潛血檢查中，存在靈敏度低 至25%左右、漏檢結(jié)腸癌的概率高的問(wèn)題。進(jìn)而，陽(yáng)性命中率也低，糞便潛血檢查為陽(yáng) 性的受試者中實(shí)際為結(jié)腸癌患者的比例為10%以下，包括很多假陽(yáng)性。因此，強(qiáng)烈期望 開(kāi)發(fā)可靠性更高的新型檢查方法。作為適于定期體檢等的、非侵入性、簡(jiǎn)便、且可靠性高的新型檢查方法，調(diào)查 糞便中有無(wú)癌細(xì)胞或有無(wú)癌細(xì)胞來(lái)源的基因的檢查受到矚目。這些檢查方法由于直接調(diào) 查有無(wú)癌細(xì)胞或癌細(xì)胞來(lái)源的基因，因此通常認(rèn)為，與調(diào)查有無(wú)產(chǎn)生伴隨結(jié)腸癌的患病 間接產(chǎn)生的消化道出血的糞便潛血檢查法相比，該檢查方法可靠性更高。為了以高精度檢測(cè)糞便中的癌細(xì)胞等，有效地回收糞便中的癌細(xì)胞來(lái)源的核酸 很重要。特別是，由于糞便中的癌細(xì)胞來(lái)源的核酸為微量，且糞便中含有大量消化殘留物和細(xì)菌，因此核酸非常容易被分解。因此，為了有效地從糞便試樣回收核酸、特別是 人等哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的核酸，重要的是調(diào)制糞便試樣以防止糞便中核酸的分解并且能 夠穩(wěn)定地保存至檢查操作時(shí)為止。作為這種糞便試樣的糞便處理方法，例如有從采集的 糞便中分離從大腸等消化道脫落的癌細(xì)胞的方法。通過(guò)從糞便中分離癌細(xì)胞，可以抑制 細(xì)菌等來(lái)源的蛋白酶、DNase、RNase等分解酶造成的影響。作為從糞便中分離癌細(xì)胞 的方法，例如公開(kāi)了一種從糞便中分離細(xì)胞的方法，其將糞便冷卻至低于其凝膠凝固點(diǎn) (gel freezing point)的溫度，維持糞便溫度低于凝膠凝固點(diǎn)以使得糞便實(shí)質(zhì)上保持完好的 狀態(tài)的同時(shí)采集細(xì)胞(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，公開(kāi)了以下方法在通常周?chē)鷾?度下將糞便分散到含有蛋白酶抑制物質(zhì)、粘液溶解劑和殺菌劑的運(yùn)輸培養(yǎng)基中，然后分 離從大腸脫落的細(xì)胞(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另一方面，在組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)上觀察細(xì)胞的形態(tài)的情況下，為了使采集的細(xì)胞 形態(tài)維持到觀察時(shí)為止，以往一直實(shí)行福爾馬林固定、醇固定等多種固定方法。作為應(yīng) 用這些固定方法的方法，公開(kāi)了使用以下的特殊細(xì)胞溶液保存劑作為能夠進(jìn)行哺乳動(dòng)物 細(xì)胞試樣的長(zhǎng)期保存及保存后的細(xì)胞觀察的保存溶液的試樣處理方法(例如，參照專(zhuān)利 文獻(xiàn)3)。該細(xì)胞溶液保存劑含有足以固定哺乳動(dòng)物細(xì)胞的量的水；能夠混合的醇；足 以防止溶液中哺乳動(dòng)物細(xì)胞凝集的量的抗凝劑；保存細(xì)胞的期間將溶液的pH保持在4 7的范圍的緩沖劑。 另外，例如可列舉出使用以下的保存溶液的試樣處理方法，所述保存溶液不僅 能夠進(jìn)行細(xì)胞的組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)觀察、還能夠?qū)Ρ４婧蟮募?xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸等進(jìn)行 分子學(xué)分析。專(zhuān)利文獻(xiàn)4中公開(kāi)了一種使用普通采集培養(yǎng)基的試樣處理方法，所述普通 采集培養(yǎng)基含有緩沖成分、至少1種醇成分、固定劑成分、以及抑制由RNA、DNA及蛋 白質(zhì)組成的組中的至少1種物質(zhì)分解的藥劑，專(zhuān)利文獻(xiàn)5中公開(kāi)了一種使用含有5 20% 聚乙二醇及80 95%甲醇的非水溶液的試樣處理法。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)6中公開(kāi)了一種試樣處理液，其含有含有用于使陰道拭子中 的細(xì)菌和病毒的核酸穩(wěn)定化的醇或酮、并且使蛋白質(zhì)沉淀或變性的物質(zhì)；以及促進(jìn)融合 到細(xì)胞中的促進(jìn)物質(zhì)。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)7中公開(kāi)了一種糞便處理容器，其為了進(jìn)行糞便潛血檢查，而 將采集的0.03g左右的極少量的糞便混合到含有保存液等的懸浮液中并進(jìn)行懸浮?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特表平11-511982號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特表2004-519202號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2003-153688號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本特表2004-500897號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5 日本特表2005-532824號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)6 日本特開(kāi)2001-128662號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本專(zhuān)利第2668815號(hào)說(shuō)明書(shū)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題然而，在上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1那樣的通過(guò)維持低溫來(lái)處理糞便的糞便處理方法中， 需要在采集糞便后立即進(jìn)行糞便的冷卻。因此，在如診察等那樣在家庭中進(jìn)行糞便采集 的情況下，采集后迅速將糞便冷卻是非常困難的。另外，為了防止糞便的變質(zhì)而考慮到 將糞便冷凍，但在檢查前必須使冷凍的糞便融解。為了盡可能防止糞便試樣中核酸的分 解等，融解操作優(yōu)選在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，通常在融解前將冷凍的糞便粉碎后使用。然而，冷凍的糞便由于硬度高而難以粉碎，處理困難。另外，由于粉碎時(shí)冷凍 片飛散，因此有污染和感染的危險(xiǎn)。另外，在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中公開(kāi)的添加殺菌劑等的糞便 處理方法中，不需要冷卻操作，能夠在室溫下調(diào)制和保存糞便試樣，但從糞便中分離從 大腸脫落的細(xì)胞的操作繁雜。進(jìn)而，殺菌劑等破壞的細(xì)菌所產(chǎn)生的核酸分解酶、蛋白水 解酶會(huì)導(dǎo)致從大腸脫落的細(xì)胞及從大腸脫落的細(xì)胞來(lái)源的核酸等分解。其結(jié)果是，結(jié)腸 癌檢測(cè)的精度可能降低。此外，由于在細(xì)胞存活的狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行保存，因此還存在如 下問(wèn)題從大腸脫落的細(xì)胞中的基因表達(dá)等分子譜(molecular profiling)受到培養(yǎng)基中的 抗生素等成分的影響、糞便中的細(xì)胞由于經(jīng)時(shí)的劣化和分解等發(fā)生變化。另外，上述專(zhuān)利文獻(xiàn)3 5中公開(kāi)的使用各保存溶液的試樣處理方法雖然能夠在 室溫下穩(wěn)定地保存細(xì)胞，但該保存溶液是對(duì)于組織、細(xì)胞那樣的不含雜質(zhì)的分離后的細(xì) 胞而使用的，難以直接用于糞便那樣的含有多種物質(zhì)的生物試樣。將上述保存溶液用于 從糞便分離的從大腸脫落的細(xì)胞時(shí)，由于糞便中的從大腸脫落的細(xì)胞為微量，因此從所 分離的細(xì)胞中提取足以用于分析的量的核酸很困難。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)6中公開(kāi)的試樣處 理液主要用于穩(wěn)定地保存陰道拭子試樣中的、主要來(lái)源于細(xì)菌的核酸。糞便處于大量的 細(xì)菌、大量的消化殘留物和極少量的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的核酸混合存在的狀態(tài)。專(zhuān)利文 獻(xiàn)6中，關(guān)于也能夠 穩(wěn)定地保存遠(yuǎn)比細(xì)菌微量的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的核酸的試樣處理液 未作任何記載。進(jìn)而，專(zhuān)利文獻(xiàn)7中公開(kāi)的進(jìn)行糞便潛血檢查的糞便處理容器中，能夠處理的 糞便量為0.03g左右，很微量，并且容器中收納的糞便處理液實(shí)質(zhì)上為1種。因此，使用 保存液從糞便中回收核酸時(shí)，需要向懸浮液中添加保存液，懸浮液中的保存液的作用導(dǎo) 致懸浮效率降低，核酸的回收效率也降低，無(wú)法以高精度回收核酸。本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題而進(jìn)行的，目的在于提供一種能夠以高精度回收核酸的 糞便處理方法及糞便處理容器。用于解決問(wèn)題的方案為了解決上述問(wèn)題、達(dá)到目的，本發(fā)明采用以下手段。即，(1)本發(fā)明為一種對(duì)用于由采集的糞便回收核酸的糞便試樣進(jìn)行調(diào)制處理的糞便 處理方法，其包括懸浮步驟，生成由采集的糞便和懸浮液懸浮而成的糞便懸浮液；試 樣調(diào)制步驟，將前述糞便懸浮液與使前述核酸穩(wěn)定化的糞便處理液混合而調(diào)制前述糞便 試樣。(2)上述(1)所述的糞便處理方法中使用的前述懸浮液優(yōu)選為水、生理鹽水或緩 沖劑。
(3)上述(1)或(2)所述的糞便處理方法中使用的前述糞便處理液優(yōu)選為水溶性 有機(jī)溶劑。(4)上述(3)所述的糞便處理方法中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選為水溶性醇
和/或酮類(lèi)。(5)上述(3)或(4)所述的糞便處理方法中使用的前述糞便試樣優(yōu)選含有30%以 上的前述水溶性有機(jī)溶劑。(6)上述(4)所述的糞便處理方法中使用的前述水溶性醇優(yōu)選為選自由乙醇、丙 醇及甲醇組成的組中的1種以上。(7)上述(4)所述的糞便處理方法中使用的前述酮類(lèi)優(yōu)選為丙酮和/或甲乙酮。(8)上述(3)所述的糞便處理方法中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選為醛類(lèi)。(9)上述(3)或(8)所述的糞便處理方法中使用的前述糞便試樣優(yōu)選含有0.01 30 %的前述水溶性有機(jī)溶劑。

(10)上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法中使用的前述懸浮液和/或糞 便處理液優(yōu)選含有表面活性劑。(11)上述⑴ (10)中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法中使用的前述懸浮液和/或 糞便處理液優(yōu)選含有著色劑。(12)上述(3) (9)中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑 優(yōu)選含有有機(jī)酸。(13)上述(3) (9)中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑 優(yōu)選含有螯合劑、和/或聚陽(yáng)離子。(14)本發(fā)明為上述的發(fā)明中對(duì)用于由采集的糞便回收核酸的糞便試樣進(jìn)行調(diào)制 處理的糞便處理容器，其具備懸浮液保持部，其用于保持使前述糞便懸浮的懸浮液； 導(dǎo)入機(jī)構(gòu)，其用于向前述懸浮液保持部中導(dǎo)入前述糞便；處理液保持部，其用于保持使 前述核酸穩(wěn)定化的糞便處理液；開(kāi)放機(jī)構(gòu)，其用于使前述懸浮液保持部與前述處理液保 持部互相開(kāi)放。(15)上述(14)所述的糞便處理容器所具備的前述開(kāi)放機(jī)構(gòu)優(yōu)選具備將前述懸 浮液保持部與前述處理液保持部連通的連通孔，和設(shè)置在前述連通孔內(nèi)用于阻斷連通的 阻斷部；前述處理液保持部是伸縮自由的容器，通過(guò)壓縮該處理液保持容器而使處理液 的壓力增大，從而解除阻斷部的阻斷，使前述糞便處理液流入到前述懸浮液側(cè)。(16)上述(14)或(15)所述的糞便處理容器所具備的前述處理液保持部?jī)?yōu)選在軸 線方向上伸縮自由，使全部糞便處理液流入到前述懸浮液保持部側(cè)。(17)上述(14)所述的糞便處理容器所具備的前述開(kāi)放機(jī)構(gòu)優(yōu)選具備用于將前 述懸浮液保持部與前述處理液保持部之間阻斷的阻斷部；用于穿透阻斷部而使前述懸浮 液保持部與前述處理液保持部互相開(kāi)放的突起部。(18)上述(14)所述的糞便處理容器所具備的前述開(kāi)放機(jī)構(gòu)優(yōu)選具備用于將前 述懸浮液保持部與前述處理液保持部之間阻斷的阻斷部；用于按壓阻斷部而使前述懸浮 液保持部與前述處理液保持部互相開(kāi)放的突起部。(19)上述(14)所述的糞便處理容器所具備的前述處理液保持部?jī)?yōu)選形成于前述 懸浮液保持部?jī)?nèi)部，并且該懸浮液保持部及該處理液保持部由彈性材料形成，通過(guò)來(lái)自前述懸浮液保持部及前述處理液保持部的外部的按壓使前述處理液保持部斷裂，使前述 糞便處理液流入到前述懸浮液側(cè)。(20)上述(14)所述的糞便處理容器所具備的前述處理液保持部?jī)?yōu)選形成于前述 懸浮液保持部?jī)?nèi)部，并且該懸浮液保持部及該處理液保持部由彈性材料形成，進(jìn)而，前 述處理液保持部的部分的抗拉強(qiáng)度相對(duì)于前述懸浮液保持部的抗拉強(qiáng)度較低，通過(guò)從前 述懸浮液保持部及前述處理液保持部的外部彎折該懸浮液保持部及該處理液保持部，使 該處理液保持部的抗拉強(qiáng)度低的部分?jǐn)嗔?，使前述糞便處理液流入到前述懸浮液側(cè)。
(21)上述(14)所述的糞便處理容器中，優(yōu)選至少前述懸浮液保持部和前述處理 液保持部為彼此獨(dú)立的部件，該懸浮液保持部和該處理液保持部能夠互相安裝。(22)上述(14)所述的糞便處理容器中使用的前述懸浮液優(yōu)選為水、生理鹽水或 緩沖劑。(23)上述(14)或(22)所述的糞便處理容器中使用的前述糞便處理液優(yōu)選為水溶 性有機(jī)溶劑。(24)上述(23)所述的糞便處理容器中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選為水溶性
醇和/或酮類(lèi)。(25)上述(23)或(24)所述的糞便處理容器中使用的前述糞便試樣優(yōu)選含有 30%以上的前述水溶性有機(jī)溶劑。(26)上述(24)所述的糞便處理容器中使用的前述水溶性醇優(yōu)選為選自由乙醇、 丙醇及甲醇組成的組中的1種以上。(27)上述(24)所述的糞便處理容器中使用的前述酮類(lèi)優(yōu)選為丙酮和/或甲乙酮。(28)上述(23)所述的糞便處理容器中使用的前述水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選為醛類(lèi)。(29)上述(23)或(28)所述的糞便處理容器中使用的前述糞便試樣優(yōu)選含有 0.01 30%的前述水溶性有機(jī)溶劑。(30)上述(14)或(22) (29)中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器中使用的前述懸浮 液和/或糞便處理液優(yōu)選含有表面活性劑。(31)上述(14)或(22) (30)中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器中使用的前述懸浮 液和/或糞便處理液優(yōu)選含有著色劑。(32)上述(23) (29)中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器中使用的前述水溶性有機(jī)溶 劑優(yōu)選含有有機(jī)酸。(33)上述(23) (29)中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器中使用的前述水溶性有機(jī)溶 劑優(yōu)選含有螯合劑和/或聚陽(yáng)離子。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，由于使糞便與懸浮液混合而使其懸浮后，再與糞便處理液混合， 因此可發(fā)揮通過(guò)懸浮效率的提高而使核酸的回收效率和回收精度提高的效果。


圖1是表示實(shí)施方式1所述的糞便處理容器1的示意圖。圖2是表示實(shí)施方式1所述的糞便處理容器1的示意圖。圖3是通過(guò)電泳法確認(rèn)使用懸浮液回收的RNA(A)和不使用懸浮液回收的RNA(B)的圖。 圖4是表示實(shí)施方式2所述的糞便處理容器2的示意圖。圖5是表示實(shí)施方式2所述的糞便處理容器2的變形例1即糞便處理容器3的示 意圖。圖6是表示實(shí)施方式2所述的糞便處理容器2的變形例2即糞便處理容器4的示 意圖。圖7是表示實(shí)施方式3所述的糞便處理容器5的示意圖。圖8是表示實(shí)施方式3所述的糞便處理容器5的示意圖。圖9是表示實(shí)施方式3所述的糞便處理容器5的變形例即糞便處理容器6的示意 圖。圖10是表示實(shí)施方式3所述的糞便處理容器5的變形例即糞便處理容器6的示 意圖。圖11是表示實(shí)施方式4所述的糞便處理容器7的示意圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明1 7 糞便處理容器100、200、300、400、500、600、700 糞便采集夾具101、201、301、401、501、601、701 蓋102、203、403、502、602 糞便采集棒110、210、310、410、510、610、700 懸浮液保持部111、211、311、411、511、611、701 懸浮液保持容器112、414、512、612 滑塊120、220、320、420、720 處理液保持部121、221、321、421、521、621、721 處理液保持容器122、322 阻斷物支撐部131、331、431 阻斷物202、302、402 活塞212、312、412、711 突起部213、313、413、713 連通孔222、722 阻斷膜415 樣品裁斷部710 連結(jié)部712 接合部E糞便樣品P 糞便處理液S 懸浮液
具體實(shí)施例方式以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的糞便處理方法及糞便處理容器進(jìn)行說(shuō) 明。另外，本發(fā)明并不限定于各實(shí)施方式。另外，附圖的記載中，同一部分帶有相同的附圖標(biāo)記。(實(shí)施方式1) 圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施方式1所述的糞便處理容器1的概要結(jié)構(gòu)示意圖。該 糞便處理容器1具備糞便采集夾具100、懸浮液保持部110和處理液保持部120。這些部 件分別以密閉的狀態(tài)存在于糞便處理容器1中，并能夠分別裝卸。另外，構(gòu)成糞便試樣 調(diào)制用溶液的懸浮液S和糞便處理液P分別收納在懸浮液保持容器111和處理液保持容器 121 中。在圖1所示的糞便處理容器1中，收納在懸浮液保持容器111中的懸浮液S的液 面的高度優(yōu)選高于由糞便采集棒102采集的糞便樣品E的高度。另外，可以設(shè)置配合液 面的高度的用于防止漏液的閥等。另外，懸浮液保持容器111中設(shè)置有滑塊112，將蓋 101與懸浮液保持容器111接合時(shí)，通過(guò)滑塊112將糞便采集棒102上附著的多余的糞便 擦掉從而使糞便樣品E的量為一定量。另外，本實(shí)施方式中，用于將糞便樣品E導(dǎo)入到 懸浮液保持容器111中的蓋101及糞便采集棒102稱(chēng)為導(dǎo)入機(jī)構(gòu)。通過(guò)糞便采集棒102 采集糞便樣品E后，使蓋101與懸浮液保持容器111接合，將調(diào)整至一定量的糞便樣品E 與懸浮液S混合而使其懸浮，從而生成糞便懸浮液。接著，將懸浮液保持容器111內(nèi)的懸浮狀態(tài)的糞便懸浮液與糞便處理液P混合。 如圖2所示，通過(guò)按壓處理液保持容器121的下部，從而使處理液保持容器121內(nèi)部的體 積減少，同時(shí)處理液保持容器121的內(nèi)部壓力上升。此時(shí)，阻斷物131從阻斷物支撐部 122被放出到懸浮液保持容器111內(nèi)，將糞便懸浮液和糞便處理液P混合。另外，本實(shí) 施方式中，以阻斷物131和阻斷物支撐部122作為開(kāi)放機(jī)構(gòu)。該混合液成為用于從糞便 回收核酸的糞便試樣。另外，處理液保持容器121優(yōu)選由鋁箔等金屬箔、橡膠或塑料材 質(zhì)形成。另外，處理液保持容器121下部能夠伸縮至處理液保持容器121上部為止，能 夠使全部糞便處理液流入到懸浮液保持容器111內(nèi)。進(jìn)而，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行處理液保持容 器121的伸縮，能夠有效地進(jìn)行糞便懸浮液與糞便處理液P的混合。本發(fā)明的糞便處理方法中使用的懸浮液S沒(méi)有特別限定，可列舉出生理鹽 水、水、2-嗎啉代乙烷磺酸(MES)緩沖劑、雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷 (Bis-Tris)緩沖劑、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖劑、N-(2-乙酰胺)亞氨基二醋酸 (ADA)緩沖劑、哌嗪-N，N，-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)緩沖劑、2-[N_(2_乙酰胺) 氨基]乙烷磺酸(ACES)緩沖劑、3-嗎啉代-2-羥基丙烷磺酸(MOPSO)緩沖劑、2_[N， N-雙(2-羥乙基)氨基]乙烷磺酸(BES)緩沖劑、3-嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)緩沖劑、 2-{N_[三(羥甲基)甲基]氨基}乙烷磺酸(TES)緩沖劑、N-(2-羥乙基)-N，_(2_磺 乙基)哌嗪(HEPES)緩沖劑、3-[N，N-雙(2-羥乙基)氨基]_2_羥基丙烷磺酸(DIPSO) 緩沖劑、2-羥基-3-丨[N-三(羥甲基)甲基]氨基丨丙烷磺酸(TAPSO)緩沖劑、哌嗪-N， N，-雙(2-羥基丙烷-3-磺酸)(POPSO)緩沖劑、N-(2-羥乙基)-N，_(2_羥基-3-磺 丙基)哌嗪(HEPPSO)緩沖劑、N-(2-羥乙基)-N’ _(3_磺丙基)哌嗪(EPPS)緩沖劑、 Tricine[N-三(羥甲基)甲基甘氨酸]緩沖劑、Bicine[N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸]緩 沖劑、3-[N_三(羥甲基)甲基]氨基丙烷磺酸(TAPS)緩沖劑、2-(N_環(huán)己基氨基)乙烷 磺酸(CHES)緩沖劑、3-(N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙烷磺酸(CAPSO)緩沖劑、3_(N_環(huán) 己基氨基)丙烷磺酸(CAPS)緩沖劑等。
另外，糞便處理液P含有具有使核酸穩(wěn)定的作用的水溶性有機(jī)溶劑。糞便處 理液P中所含的水溶性有機(jī)溶劑只要是能夠發(fā)揮核酸穩(wěn)定化效果的化合物，則沒(méi)有特別 限定，但需要注意的是不要與糞便懸浮液反應(yīng)而損害核酸穩(wěn)定效果。作為水溶性有機(jī)溶 齊IJ，例如有醇、酮類(lèi)、醛類(lèi)等。作為酮類(lèi)，有丙酮、甲乙酮等，作為醛類(lèi)，可列舉出乙 醛(acetyl aldehyde)、甲醛(福爾馬林)、戊二醛、低聚甲醛、乙二醛(glyoxal)等。作 為本發(fā)明中使用的水溶性有機(jī)溶劑，優(yōu)選為水溶性醇、丙酮、甲乙酮，更優(yōu)選為水溶性 醇。另外，從獲得容易性、處理性、安全性等方面出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選為乙醇、丙醇或甲 醇。丙醇可以是正丙醇，也可以是2-丙醇。特別是乙醇由于安全性最高，在家庭內(nèi)也 容易處理，因此在定期體檢等篩查中特別有用。另外，在筆者們的研究中，發(fā)現(xiàn)下述方法能夠有效地回收糞便中的從大腸脫落 的細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的核酸等。該糞便處理方法是如下方法使采集的糞便混合 到以水溶性有機(jī)溶劑作為有效成分的糞便試樣調(diào)制用溶液中，從糞便與糞便試樣調(diào)制用 溶液混合而成的糞便試樣中同時(shí)回收常居(indigenous)腸細(xì)菌來(lái)源的核酸和常居腸細(xì)菌以 外的生物來(lái)源的核酸。 由于糞便處理液P中的水溶性有機(jī)溶劑濃度期望是與糞便懸浮液混合后有效的 水溶性有機(jī)溶劑的濃度，因此需要任意地設(shè)定容量、濃度，以達(dá)到最適的最終濃度。糞 便懸浮液與糞便處理液P混合后的混合液中的水溶性有機(jī)溶劑的最終濃度只要是能夠發(fā) 揮核酸穩(wěn)定化效果的濃度，則沒(méi)有特別限定，可以考慮水溶性有機(jī)溶劑的種類(lèi)等而適當(dāng) 決定。例如，使用水溶性醇、酮類(lèi)作為有效成分時(shí)，糞便懸浮液與糞便處理液P混合后 的混合液中的水溶性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為30%以上。隨著水溶性有機(jī)溶劑的濃度變?yōu)?高濃度，糞便懸浮液與糞便處理液P混合時(shí)，水溶性有機(jī)溶劑的成分迅速地滲透到糞便 中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞等和常居腸細(xì)菌中，能夠迅速發(fā)揮穩(wěn)定核酸的作用。特別是，使用水溶性醇作為有效成分時(shí)，糞便懸浮液與糞便處理液P混合而成 的糞便試樣的水溶性醇的濃度優(yōu)選為30%以上，更優(yōu)選為50%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為50 80%,特別優(yōu)選為60 70%。水溶性有機(jī)溶劑濃度越高，對(duì)于水分含量多的糞便，也能 夠通過(guò)使用少量的糞便試樣調(diào)制用溶液，獲得將核酸穩(wěn)定的充分的效果。另外，使用丙酮、甲乙酮作為有效成分時(shí)，糞便試樣的丙酮、甲乙酮的濃度優(yōu) 選為30%以上，更優(yōu)選為60%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為80%以上。此外，使用乙醛、甲 醛、戊二醛、低聚甲醛、乙二醛作為有效成分時(shí)，糞便試樣中這些有效成分的濃度優(yōu)選 為0.01 30%的范圍，更優(yōu)選為0.03 10%的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為3 5%的范圍。另外，糞便處理液P中使用的水溶性有機(jī)溶劑可以僅含有1種水溶性有機(jī)溶劑， 也可以是2種以上的水溶性有機(jī)溶劑的混合溶液。例如，可以是2種以上醇的混合溶 液，也可以是醇與其他種類(lèi)的水溶性有機(jī)溶劑的混合溶液。為了進(jìn)一步改善核酸的回收 效率，優(yōu)選醇與丙酮的混合溶液。另外，供于本發(fā)明的糞便處理方法的糞便只要是動(dòng)物的糞便，則沒(méi)有特別限 定，優(yōu)選哺乳動(dòng)物來(lái)源的糞便，更優(yōu)選人來(lái)源的糞便。例如，優(yōu)選為了定期體檢、診斷 等而采集的人的糞便，但也可以是家畜、野生動(dòng)物等的糞便。另外，可以是采集后保存 了一定時(shí)間的糞便，但優(yōu)選剛采集后的糞便。進(jìn)而，采集的糞便優(yōu)選剛排泄后的糞便， 但也可以是排泄后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的糞便。
另外，糞便樣品量沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為0.05 Ig的范圍。進(jìn)而，為了提高核 酸回收的效果，糞便樣品量特別優(yōu)選在0.1 Ig的范圍。如果糞便樣品量過(guò)多的話，則 采集操作費(fèi)事，糞便采集容器也變大，因此處理性等可能降低。相反，糞便樣品量過(guò)于 少量時(shí)，糞便中所含的從大腸脫落的細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量過(guò)少，因此無(wú)法回收所需 的核酸量，目標(biāo)核酸分析的精度可能降低。另外，由于糞便是不均質(zhì)的，即各種各樣的 成分不均勻地存在，因此為了避免哺乳動(dòng)物細(xì)胞的局部的影響，優(yōu)選在采集糞便時(shí)從糞 便的不同部位采集。另外，懸浮液S、糞便處理液P可以含有表面活性劑。作為糞便試樣調(diào)制用溶 液中所含的表面活性劑，優(yōu)選為非離子性表面活性劑。作為該非離子性表面活性劑，例 如有吐溫80、CHAPS (3-[3_膽酰胺丙基二甲氨基]-1_丙磺酸內(nèi)鹽)、Triton X-100、吐 溫20等。離液序列高的(chaotropic)鹽、表面活性劑的種類(lèi)、濃度只要是能夠獲得穩(wěn)定 核酸的效果的濃度，則沒(méi)有特別限定，可以考慮糞便量、之后的核酸回收和分析方法等 而適當(dāng)決定。此外，懸浮液S、糞便處理液P中也可以添加適當(dāng)著色劑。通過(guò)將懸浮液S、糞 便處理液P著色，能夠獲得防止誤吞、減輕糞便顏色等效果。作為該著色劑，優(yōu)選用作 食品添加劑的著色料，優(yōu)選為藍(lán)色、綠色等。例如，可列舉出堅(jiān)牢綠FCF(GreenNo.3)、 亮藍(lán)FCF(BlueNal)、靛藍(lán)胭脂紅(BlueNo.2)等。另外，可以混合添加多種著色劑，也 可以單獨(dú)添加。另外，懸浮液S、糞便處理液P也可以含有有機(jī)酸。通過(guò)添加有機(jī)酸，能夠?qū)?糞便中所含的核酸因分解等導(dǎo)致的損失抑制到最小限度，能夠提高該水溶性有機(jī)溶劑中 核酸的穩(wěn)定性。作為有機(jī)酸，可列舉出直鏈脂肪酸、二羧酸、氨基酸、羥基酸、及芳香 族或雜環(huán)的多元羧酸、醋酸、己二酸、檸檬酸、乳酸等。尤其優(yōu)選直鏈脂肪酸、二羧酸、羥基酸等，更優(yōu)選醋酸、己二酸、檸檬酸、乳 酸。通過(guò)使用己二酸、檸檬酸，能夠獲得特別優(yōu)異的核酸高保存效果。此外，醋酸不僅 能夠獲得充分的核酸高保存效果，而且已被廣泛使用且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因而優(yōu)選。另外，懸浮液S、糞便處理液P可以僅含有1種有機(jī)酸，也可以含有2種以上的 有機(jī)酸。另外，添加到本發(fā)明的糞便試樣調(diào)制用溶液中的有機(jī)酸的量只要是能夠維持該 糞便試樣調(diào)制用溶液為酸性的量，則沒(méi)有特別限定，可以考慮所添加的有機(jī)酸的種類(lèi)、 該糞便試樣調(diào)制用溶液中的水溶性有機(jī)溶劑的種類(lèi)、濃度等而適當(dāng)決定。另外，懸浮液S、糞便處理液P也可以含有螯合劑和/或聚陽(yáng)離子。通過(guò)添加 螯合劑和/或聚陽(yáng)離子，能夠除去糞便中所含的干擾核酸分析的物質(zhì)，以高純度從糞便 中回收核酸。螯合劑是指形成螯合物的配體及鹽。例如，可列舉出乙二胺四醋酸(EDTA)、 甘氨酸(Bicine)、乙二醇四醋酸(EGTA)等。另外，本發(fā)明的糞便試樣調(diào)制用溶液可以 僅含有1種螯合劑，也可以含有2種以上的螯合劑。所添加的螯合劑的濃度只要是足以除去糞便試樣中的干擾物質(zhì)的濃度，則沒(méi)有 特別限定，可以考慮螯合劑的種類(lèi)等而適當(dāng)決定。優(yōu)選添加各螯合劑，使其在本發(fā)明的 糞便試樣調(diào)制用溶液中的最終濃度達(dá)到O.lmM IM的范圍。另外，聚陽(yáng)離子是指含有陽(yáng)離子性官能團(tuán)并具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的高分子化合物及其鹽。作為陽(yáng)離子，例如有氨基等。具體而言，優(yōu)選為聚賴氨酸或聚丙烯酰胺，更優(yōu)選 為聚賴氨酸。進(jìn)而可列舉出下述式(1)所示的聚賴氨酸等側(cè)鏈具有陽(yáng)離子性官能團(tuán)的多 肽、聚丙烯酰胺等側(cè)鏈含有陽(yáng)離子性官能團(tuán)的單體聚合而獲得的聚合物等。另外，這些 多肽、聚合物只要分子整體為電陽(yáng)性即可，無(wú)需全部重復(fù)單元(氨基酸、單體)的側(cè)鏈都 具有陽(yáng)離子性官能團(tuán)，但優(yōu)選全部重復(fù)單元的側(cè)鏈具有陽(yáng)離子性官能團(tuán)。另外，本發(fā)明 的試樣調(diào)制用溶液可以僅含有1種聚陽(yáng)離子，也可以含有2種以上的聚陽(yáng)離子。
權(quán)利要求
1.一種糞便處理方法，該糞便處理方法對(duì)用于由采集的糞便回收核酸的糞便試樣進(jìn) 行調(diào)制處理，其包括以下步驟懸浮步驟，生成由采集的糞便和懸浮液懸浮而成的糞便懸浮液；試樣調(diào)制步驟，將所述糞便懸浮液與使所述核酸穩(wěn)定的糞便處理液混合而調(diào)制所述 糞便試樣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糞便處理方法，所述懸浮液為水、生理鹽水或緩沖劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的糞便處理方法，所述糞便處理液為水溶性有機(jī)溶劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的糞便處理方法，所述水溶性有機(jī)溶劑為水溶性醇和/或酮類(lèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的糞便處理方法，所述糞便試樣含有30%以上的所述水溶 性有機(jī)溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的糞便處理方法，所述水溶性醇為選自由乙醇、丙醇及甲醇組 成的組中的1種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的糞便處理方法，所述酮類(lèi)為丙酮和/或甲乙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的糞便處理方法，所述水溶性有機(jī)溶劑為醛類(lèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或8所述的糞便處理方法，所述糞便試樣含有0.01 30%的所述 水溶性有機(jī)溶劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法，所述懸浮液和/或糞便處理 液含有表面活性劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法，所述懸浮液和/或糞便處理 液含有著色劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求3 9中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法，所述水溶性有機(jī)溶劑含有有 機(jī)酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求3 9中任一項(xiàng)所述的糞便處理方法，所述水溶性有機(jī)溶劑含有螯 合劑和/或聚陽(yáng)離子。
14.一種糞便處理容器，該糞便處理容器對(duì)用于由采集的糞便回收核酸的糞便試樣進(jìn) 行調(diào)制處理，其具備懸浮液保持部，其用于保持使所述糞便懸浮的懸浮液；導(dǎo)入機(jī)構(gòu)，其用于向所述懸浮液保持部中導(dǎo)入所述糞便；處理液保持部，其用于保持使所述核酸穩(wěn)定的糞便處理液；開(kāi)放機(jī)構(gòu)，其用于使所述懸浮液保持部與所述處理液保持部互相開(kāi)放。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述開(kāi)放機(jī)構(gòu)具備將所述懸浮液保持 部與所述處理液保持部連通的連通孔，和設(shè)置在所述連通孔內(nèi)用于阻斷連通的阻斷部；所述處理液保持部是伸縮自由的容器，通過(guò)壓縮該處理液保持容器而使處理液的壓 力增大，從而解除阻斷部的阻斷，使所述糞便處理液流入到所述懸浮液側(cè)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的糞便處理容器，所述處理液保持部在軸線方向上伸 縮自由，使全部糞便處理液流入到所述懸浮液保持部側(cè)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述開(kāi)放機(jī)構(gòu)具備用于使所述懸浮液 保持部與所述處理液保持部之間阻斷的阻斷部，和用于穿透所述阻斷部而使所述懸浮液保持部與所述處理液保持部互相開(kāi)放的突起部。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述開(kāi)放機(jī)構(gòu)具備用于將所述懸浮液 保持部與所述處理液保持部之間阻斷的阻斷部，和用于按壓所述阻斷部而使所述懸浮液保持部與所述處理液保持部互相開(kāi)放的突起部。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述處理液保持部形成于所述懸浮液保持 部?jī)?nèi)部，并且該懸浮液保持部及該處理液保持部由彈性材料形成，通過(guò)來(lái)自所述懸浮液保持部及所述處理液保持部的外部的按壓而使所述處理液保持 部斷裂，使所述糞便處理液流入到所述懸浮液側(cè)。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述處理液保持部形成于所述懸浮液保持 部的內(nèi)部，并且該懸浮液保持部及該處理液保持部由彈性材料形成，進(jìn)而，所述處理液 保持部的部分的抗拉強(qiáng)度相對(duì)于所述懸浮液保持部的抗拉強(qiáng)度較低，通過(guò)從所述懸浮液 保持部及所述處理液保持部的外部彎折該懸浮液保持部及該處理液保持部，使該處理液 保持部的抗拉強(qiáng)度低的部分?jǐn)嗔?，使所述糞便處理液流入到所述懸浮液側(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，至少所述懸浮液保持部和所述處理液保持 部為彼此獨(dú)立的部件，該懸浮液保持部和該處理液保持部能夠互相安裝。
22.根據(jù)權(quán)利要求14所述的糞便處理容器，所述懸浮液為水、生理鹽水或緩沖劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求14或22所述的糞便處理容器，所述糞便處理液為水溶性有機(jī)溶劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的糞便處理容器，所述水溶性有機(jī)溶劑為水溶性醇和/或酮類(lèi)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的糞便處理容器，所述糞便試樣含有30%以上的所述 水溶性有機(jī)溶劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的糞便處理容器，所述水溶性醇為選自由乙醇、丙醇及甲醇 組成的組中的1種以上。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的糞便處理容器，所述酮類(lèi)為丙酮和/或甲乙酮。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的糞便處理容器，所述水溶性有機(jī)溶劑為醛類(lèi)。
29.根據(jù)權(quán)利要求25或28所述的糞便處理容器，所述糞便試樣含有0.01 30%的所 述水溶性有機(jī)溶劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求14或22 29中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器，所述懸浮液和/或糞 便處理液含有表面活性劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求14或22 30中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器，所述懸浮液和/或糞 便處理液含有著色劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求21 29中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器，所述水溶性有機(jī)溶劑含有 有機(jī)酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求21 29中任一項(xiàng)所述的糞便處理容器，所述水溶性有機(jī)溶劑含有 螯合劑和/或聚陽(yáng)離子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠以高精度由糞便試樣回收核酸的糞便處理方法及處理容器，一種糞便處理容器(1)，其具備糞便采集夾具(100)、懸浮液保持部(110)和處理液保持部(120)，并且由懸浮液(S)和糞便處理液(P)構(gòu)成的糞便試樣調(diào)制用溶液分別收納在懸浮液保持容器(111)和處理液保持容器(121)中，首先，將糞便樣品(E)與懸浮液(S)混合而使其懸浮后，通過(guò)按壓處理液保持容器(121)下部而將阻斷物(131)放出到懸浮液保持容器(111)內(nèi)，將懸浮狀態(tài)的糞便懸浮液與糞便處理液(P)混合。通過(guò)進(jìn)行懸浮后再進(jìn)行核酸的穩(wěn)定化處理，能夠以高精度得到未分解的核酸。
文檔編號(hào)C12M1/26GK102027132SQ20098011680
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月12日
發(fā)明者中島一惠, 芝崎尊己, 谷上恭央 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社