專利名稱：用含有三鏈形成單體單元的引物進(jìn)行的靶擴(kuò)增和測(cè)序的制作方法
用含有三鏈形成單體單元的弓I物進(jìn)行的靶擴(kuò)增和測(cè)序
背景技術(shù)：
核酸的檢測(cè)、靶擴(kuò)增和測(cè)序是分子生物學(xué)、研究以及臨床診斷中的關(guān)鍵方法， 這些方法中的關(guān)鍵試劑為用作引物和/或探針的寡核苷酸。對(duì)于引物和探針最重要的是它們的序列特異性以及它們對(duì)互補(bǔ)核酸的親和性。 這些特性可通過核苷酸的內(nèi)在因素和核苷酸的外在因素進(jìn)行調(diào)整。內(nèi)在因素為例如寡核 苷酸的長(zhǎng)度和核酸序列組成。非天然核酸的使用或骨架修飾也為內(nèi)在因素。然而，可用 的非天然核苷酸和骨架單元的數(shù)量是有限的。因此，存在對(duì)可用于分子生物學(xué)方法的含 有新的修飾的寡核苷酸的需要。專利申請(qǐng)WO 2006/125447描述了式Z (下文所述)的三鏈形成單體單元，并證 明了包含三鏈形成單體單元的寡核苷酸在與雙鏈核酸形成三鏈方面的有利特性?；谒?述三鏈形成特性，前述專利申請(qǐng)的發(fā)明人建議將所述寡核苷酸用于檢測(cè)、診斷和治療。 這些應(yīng)用的細(xì)節(jié)或數(shù)據(jù)沒有提供。Filichev 等人(Filichev VV，2005)描述了與 WO 2006/125447 相同的三鏈形成單 體單元，并發(fā)現(xiàn)通過摻入所述三鏈形成單體單元可穩(wěn)定平行雙鏈和平行三鏈。此外，他 們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)三鏈形成單體單元插入到寡核苷酸中時(shí)，與天然寡核苷酸相比，Watson-Crick 型RNA/DNA和DNA/DNA雙鏈會(huì)失去穩(wěn)定性。


圖1 含有IH-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基團(tuán)的嵌入核酸單體的合成。圖2 含有藺頭(Sonogashira)型修飾的嵌入核酸單體的合成。(i) 8 與 3 或 9 與 2 的反應(yīng)都使用 Pd (PPh3) 4、CuI、DMF/Et3N 和 Ar。 (ii) 32 % 的NH4OH或50%的三(2-氨基乙基)胺的乙醇溶液，室溫2小時(shí)，然后55°C過夜。(iii) RP-HPLC ； 80% 的 AcOH 的水溶液，3M 的 AcONa 的水溶液，99% EtOH。圖3: 2-和4-乙炔基芘連接到(R)-I-O-苯基甲基甘油的對(duì)位和鄰位上的合成 以及它們?cè)诠押塑账嶂械膿饺?。合成的試劑和條件如下i)H2(160大氣壓)、10% Pd/ C、EtOAc> 60°C、24 小時(shí)；ii)Ac202、AlCl3> Ch2Cl2> 5°C ； iii) 2, 3-二氯-5，6-二氰 基-1，4-苯醌(DDQ)、甲苯、110°C、1 小時(shí)；iv)DMF、POCL3 ； v)KOH> 二噁烷、回 流、2小時(shí)。圖4: IH-菲并[9，ΙΟ-d]咪唑-2-基基團(tuán)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)三鏈形成單體單元(本文也稱為TINA單體)摻入到寡核苷酸中 意料不到地使所述寡核苷酸具有若干有利特性。此外，他們還已發(fā)現(xiàn)含有三鏈形成單體 的寡核苷酸可用作酶法操作例如引物延伸的底物。因此，本發(fā)明的第一方面是長(zhǎng)度在5到60nt(核苷酸)之間的寡核苷酸，其包含 至少一個(gè)式Z的TINA單體單元，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3'末端至少1個(gè)單體的位置上。所述寡核苷酸可用于多種分子生物學(xué)方法。因此，本發(fā)明的第二方面為一種方法，包括如下步驟a.提供模板核酸b.提供一種第一引物C.提供聚合酶d.提供核苷三磷酸e.混合步驟a_d的組分并提供使所述引物與所述模板退火的條件其中所述引物優(yōu)選本發(fā)明的寡核苷酸。所述步驟可為例如如下的分子生物學(xué)技術(shù)的一部分測(cè)序反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或核 酸靶擴(kuò)增方法(NAT)——例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。如果所述步驟 是NAT反應(yīng)的一部分，可簡(jiǎn)單地進(jìn)行NAT反應(yīng)以擴(kuò)增所述模板核酸的靶區(qū)域。或者， 可定量進(jìn)行NAT以測(cè)定所述模板核酸的靶區(qū)域的量。定量NAT (例如PCR)反應(yīng)可包括 可以是本發(fā)明寡核苷酸的檢測(cè)探針。本發(fā)明寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于其使得寡核苷酸的解鏈溫度可以改變，本發(fā)明寡 核苷酸具有更高的序列特異性，并且可通過與雙鏈核酸的Hoogsteen堿基配對(duì)或反向 Hoogsteen堿基配對(duì)形成三鏈。此外，本發(fā)明寡核苷酸的某些實(shí)施方案還具有有用的熒光 特性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的寡核苷酸本發(fā)明的第一方面提供長(zhǎng)度在5到60nt之間的寡核苷酸，其包含式Z的TINA單 體，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3’末端至少1個(gè)單體的位置上。更優(yōu)選的長(zhǎng)度在8到50nt之間，最優(yōu)選的長(zhǎng)度在10到40nt之間。三鏈形成單體單元，ZZ可描述為如下通用結(jié)構(gòu)X-L-I1-C-I2其中X為可摻入寡核苷酸或寡核苷酸類似物或者PNA或PNA類似物的骨 架中的骨架單體單元；L為接頭；I1為包含至少一個(gè)基本為平面共軛體系的第一嵌入 劑，所述體系能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊；C為任選的連接部分 (conjugator) ； I2為包含至少一個(gè)基本為平面共軛體系的第二嵌入劑，所述體系能夠與 DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊。柔性堿基堆疊單體(Z)包含由連接部分C連接的至少兩個(gè)嵌入體系IjPI2,所述 連接部分C提供了必需的結(jié)構(gòu)剛性和扭轉(zhuǎn)柔性。扭轉(zhuǎn)柔性被認(rèn)為對(duì)幫助嵌入劑將它們自 身調(diào)整到核酸螺旋內(nèi)的合適位置具有重要作用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述骨架X能夠摻入到如下分子的寡核苷酸 中DNA、RNA> HNA> MNA> ANA、LNA> CAN、ΙΝΑ、CeNA、TNA> (2' -NH) -TNA> (3' -NH) -TNA> α _L_ 核糖-LNA、α _L_ 木糖-LNA、β _D_ 核糖-LNA、3"0-木糖-1^八、[3.2.1]-LNA、雙環(huán) DNA、6-氨基雙環(huán) DNA、5_epi_ 雙環(huán) DNA、α-雙環(huán) DNA、三環(huán) DNA、雙環(huán)[4.3.0]_DNA、雙環(huán)[3.2.1]_DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰
DNA> β-D-B比喃核糖—ΝΑ、 α-L-B比喃木糖—ΝΑ、2' -R—RNA、2' —OR—RNA、 2' -AE-RNA、α -L-RNA> β-D-RNA以及它們的組合和變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述骨架單體單元X包含亞烷基二醇例如乙二醇或
I-0-亞甲基甘油，并任選地包含部分位于一個(gè)環(huán)系統(tǒng)例如糖基中的亞烷基二醇。例如， 所述骨架單體X可為最終含有選自氮、硫、磷和氧的雜原子的4、5或6元環(huán)的一部分。 優(yōu)選地，所述亞烷基二醇直接連接相鄰的寡核苷酸單體單元，應(yīng)理解在此實(shí)施方案中， 所述亞烷基二醇仍然可為一個(gè)環(huán)系統(tǒng)例如糖基的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述柔性堿基堆疊單體的接頭L含有0-60個(gè)原子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，L包含一條鏈或一個(gè)環(huán)或者它們的組合和/或它們的取代 物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，L包含一條烷基鏈或氧烷基鏈或氮烷基鏈或硫烷基鏈或者 一個(gè)氨甲酰基團(tuán)或硫代氨甲?；鶊F(tuán)或磺酰胺基團(tuán)或者它們的組合。X和L的結(jié)合提供了一個(gè)具有與核酸堿基堆疊的能力的體系，所述體系將
II-C-I2的嵌入體系置于核酸螺旋中心。所述柔性堿基堆疊單體的I1為包含至少一個(gè)基本為平面的共軛體系的第一嵌入 劑，所述系統(tǒng)能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊。在一個(gè)實(shí)施方案中，I1為任選地選自苯、萘、甘菊環(huán)烴、雙環(huán)雜芳環(huán)體系和它 們的取代物的單環(huán)或多環(huán)芳環(huán)體系。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，I1在所述單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系的1、2位上與L、C連接。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，I1在所述單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系的1、3位上與L、C 連接。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，I1在所述單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系的1、4位上與L、C 連接。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，I1為在鄰位或?qū)ξ痪哂蠰和C的苯環(huán)。所述柔性堿基堆疊單體的C為一個(gè)任選的連接部分。在一個(gè)C為非任選的優(yōu)選 實(shí)施方案中，C選自1-12個(gè)碳原子的烷基、2-12個(gè)碳原子的烯基、2-25個(gè)碳原子的炔基 或重氮基或者它們的長(zhǎng)度不超過25個(gè)碳原子和/或氮原子的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述柔性堿基堆疊單體不含有任何連接部分。因此，I1 和I2可直接連接，例如通過一個(gè)共軛體系直接連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C選自直鏈或支鏈烴基或單環(huán)芳環(huán)以及它們最終含有選 自氮、硫、磷和氧的雜原子的取代物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述C的烯基為乙炔基或重復(fù)的乙炔基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含磷原子的骨架單體單元X的單元長(zhǎng)度小于6個(gè)原 子，其中所述骨架單元長(zhǎng)度為從一個(gè)單體到下一個(gè)單體的最短距離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接部分L的長(zhǎng)度為至少2個(gè)原子并最終具有選 自氮、硫、磷和氧的雜原子。優(yōu)選地，所述連接部分L的長(zhǎng)度在2到10個(gè)原子之間，更優(yōu)選地在2到5個(gè)原子之間。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接部分的長(zhǎng)度為3個(gè) 原子，對(duì)應(yīng)于X和I1之間有5個(gè)鍵。所述柔性堿基堆疊單體的I2為包含至少一個(gè)基本為平面的共軛體系的第二嵌入 劑，所述體系能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，I2選自雙環(huán)芳環(huán)體系、三環(huán)芳環(huán)體系、四環(huán)芳環(huán)體 系、五環(huán)芳環(huán)體系，以及它們的雜芳環(huán)類似物和它們的取代物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，I2為IH-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基團(tuán)或芘(圖4)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述柔性堿基堆疊單體是寡核苷酸或寡核苷酸類似物 的一部分。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述柔性堿基堆疊單體被改造以適合摻入到寡核苷 酸中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述被改造以適合摻入到寡核苷酸的柔性堿基堆疊單 體選自亞磷酰胺(phosphoramidite)、亞磷酰二胺、磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸酯、H-膦 酸酯、亞磷酸酯、氯亞磷酸酯、氯亞磷酰胺、亞膦酰胺(phosphonamidite)、亞膦酰氯 (phosphonchloridite)、三磷酸酯、二磷酸酯。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述柔性堿基堆疊單體(Z)可描述為下式
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)度在5到60nt之間的寡核苷酸，其包含式Z的TINA單體，其中所述TINA 單體位于距離所述寡核苷酸的3’末端至少1個(gè)單體的位置上，并且其中Z表示為如下通 用結(jié)構(gòu)X-L-I1-C-I2其中X為可摻入寡核苷酸或寡核苷酸類似物或者PNA或PNA類似物的骨架中的骨架 單體單元；L為接頭；I1為包含至少一個(gè)基本為平面共軛體系的第一嵌入劑，所述體系能 夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊；C為任選的連接部分；I2為包含至少一 個(gè)基本為平面共軛體系的第二嵌入劑，所述體系能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊。
2.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中Z可表示為下式-其中R選自芳乙炔基基團(tuán)。
3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，包含選自2、3、4、5、6和7個(gè)的多個(gè)TINA單 體，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3’末端至少1個(gè)單體的位置上。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包括選自DNA單元、RNA單元、LNA單元 和2' -OH-修飾單元的修飾的核苷酸單體單元。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’末端包含一段3個(gè)脫氧 核苷酸的連續(xù)片段。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述TINA單體單元位于距離所述寡核苷酸 的5’末端不超過3個(gè)單體的位置上。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包含限制性酶切位點(diǎn)。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包含一種選自如下的熒光團(tuán)FAM 、 ΤΕΤ 、JOE 、VIC 、SYBR 綠；6FAM、HEX、ΤΕΤ、TAMRA、JOE、ROX、熒 光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、得克薩斯紅、若丹明、若丹明綠、若丹明紅、6-羧基若丹明 6G、俄勒岡綠488、Alexa Fluor、俄勒岡綠500或俄勒岡綠514。
9.權(quán)利要求8的寡核苷酸，還包含一種選自如下的淬滅染料TAMRA ;BlackHole Quencher 、DABCYL> BHQ-I、BHQ-2、DDQ I、DDQ II 和 Eclipse Dark Quencher。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其含有內(nèi)部間隔基例如C18間隔基、PEG間隔 基、C9間隔基、C7間隔基、C6間隔基、環(huán)己烷間隔基、環(huán)辛烷間隔基、環(huán)氧乙烷間隔 基或它們的任何組合，并且所述間隔基位于距離所述寡核苷酸的5’末端至少3個(gè)核苷酸 并距離所述寡核苷酸的3’末端至少3個(gè)核苷酸的位置上。
11.一種方法，包括如下步驟
12.權(quán)利要求11的方法，還包括f.在可使引物延伸的條件下，延伸與所述模板退火的第一引物。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述第一種引物為權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述引物或核苷三磷酸為熒光標(biāo)記的。
15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷三磷酸的一部分為雙脫氧核苷三磷酸。
16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，還包括如下步驟 &提供一種第二引物，其與步驟f的第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)h.使步驟f的產(chǎn)物變性i.在可使引物延伸的條件下，延伸與所述第一延伸產(chǎn)物退火的第二引物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第二引物為權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸。
18.權(quán)利要求17的方法，包括將變性、退火和延伸重復(fù)進(jìn)行至少10次。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。
20.權(quán)利要求11或13的方法，其中所述第一引物和第二引物包含能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的 擴(kuò)增的RNA啟動(dòng)子序列。
21.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括第三引物和第四引物以及一種 能實(shí)現(xiàn)等溫鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。
22.權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括一種檢測(cè)探針，其含 有與所述第一延伸產(chǎn)物或第二延伸產(chǎn)物的第一引物結(jié)合位點(diǎn)與第二引物結(jié)合位點(diǎn)之間的 一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的序列。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述探針能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括與所述第一延伸產(chǎn)物或第二延伸 產(chǎn)物的第一引物結(jié)合位點(diǎn)與第二引物結(jié)合位點(diǎn)之間的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的第二檢測(cè)探針，其 中所述第一探針和第二探針會(huì)與鄰近位點(diǎn)堿基配對(duì)，從而使一種探針的3’末端與另一種 探針的5’末端靠近。
25.權(quán)利要求11-24任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括雙鏈特異性報(bào)告染料 例如SYBR綠I、SYBR綠II和SYBR金。
26.權(quán)利要求11-25任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括可與所述雙鏈延伸產(chǎn) 物形成三鏈的三鏈形成探針。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述三鏈形成探針能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括第二種三鏈形成探針，其形成與 所述第一種三鏈探針形成的三鏈毗鄰的三鏈。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一種和第二種三鏈形成探針通過接頭連接。
30.權(quán)利要求26-29的方法，其中所述第一種和/或第二種三鏈形成探針為權(quán)利要求 1-10任一項(xiàng)所述的寡核苷酸。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種和/或第二種三鏈形成探針包含一段至少3 個(gè)嘧啶的連續(xù)片段。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述第一種和/或第二種三鏈形成探針包含一段至少3 個(gè)嘌呤的連續(xù)片段。
33.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)還包括三鏈形成寡核苷酸，所述三鏈 形成寡核苷酸可與所述與模板鏈堿基配對(duì)的第一引物或所述與模板鏈堿基配對(duì)的第二引 物形成三鏈，從而穩(wěn)定所述引物與所述模板鏈的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)三鏈形成單體單元摻入到寡核苷酸中意料不到地使所述寡核苷酸具有若干有利特性。所述寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于其使得寡核苷酸的解鏈溫度可以改變，本發(fā)明寡核苷酸具有更高的序列特異性并且可通過與雙鏈核酸的Hoogsteen堿基配對(duì)或反向Hoogsteen堿基配對(duì)形成三鏈。此外，某些本發(fā)明寡核苷酸還具有有用的熒光特性，并且所述包含三鏈形成單體的寡核苷酸可用作酶法操作例如引物延伸的底物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102016076SQ200980116715
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日
發(fā)明者G·里斯貝 申請(qǐng)人:昆特拜克股份公司