專利名稱：有機酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用乳酸等的生產(chǎn)有機酸的酵母的有機酸的制造方法。
背景技術(shù)：
通常，使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸時，通過中和劑將pH控制為中性而進行發(fā)酵。 然而，以該方法生產(chǎn)的有機酸為鹽的狀態(tài)，需要用提純工序進行脫鹽，所以導(dǎo)致制造成本的 上升。因此，雖然可以考慮在酸性條件下進行有機酸發(fā)酵，但已知好酸菌的繁殖受乙酸、乳 酸、琥珀酸等有機酸的抑制(非專利文獻1 大島泰郎主編“極端微生物手冊(極限微生 物/、> KO ” )”第231項)，除了曲霉屬(Aspergillus spp.)的檸檬酸發(fā)酵情況，幾 乎不知道以高效率生產(chǎn)有機酸的菌。作為解決該問題的方法，已公開有對高效率生產(chǎn)有 機酸的菌株通過突變育種而賦予耐酸性的方法(非專利文獻2 :R. Patnaik et al.，Nat. Biotechnol. 20(2002)，pp. 707-712)，以耐酸性強但生產(chǎn)能力低的菌種為母株實施提高收 率為目的的代謝改變的方法(專利文獻1 特表2003-500062號公報)，但其效果并不充分。如上所述，雖然在進行通過利用突變育種法、基因工學(xué)的方法而改變微生物這樣 的方法來提高有機酸的生產(chǎn)率的嘗試，但這些改變微生物的方法較復(fù)雜，且不盡然能夠可 靠地得到所希望的特性。專利文獻1 日本特表2003-500062號公報非專利文獻1 大島泰郎主編“極限微生物^ > K ^夕”第231項非專利文獻 2 :R. Patnaik et al.，Nat. Biotechnol. 20 (2002)，pp. 707—71
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種在使用生產(chǎn)有機酸的酵母發(fā)酵該有機酸而進行 生產(chǎn)時，不實施突變育種、DNA重組育種等，而通過簡便的方法提高有機酸的發(fā)酵效率的方 法。為了達成上述目的，本發(fā)明人進行深刻研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)將生產(chǎn)有機酸的酵母在 調(diào)整為低PH的含有有機酸的培養(yǎng)基中處理而能大幅提高該酵母的有機酸生產(chǎn)效率，從而 完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的有機酸的制造方法具有如下步驟使具有生產(chǎn)有機酸能力的酵母以 調(diào)整為低PH的含有有機酸的培養(yǎng)基進行處理的步驟a，和在所述步驟a之后，通過使用所述 酵母的發(fā)酵而產(chǎn)生有機酸的步驟b。并且，本發(fā)明的有機酸的制造方法中，所述步驟a可以具有通過使用所述酵母的 發(fā)酵而產(chǎn)生有機酸的步驟c，通過所述步驟c中產(chǎn)生的有機酸而將所述含有有機酸的培養(yǎng) 基調(diào)整為低PH。即，將酵母通過在步驟c的發(fā)酵工序和步驟b的發(fā)酵工序之間用有機酸調(diào) 整為低PH的含有有機酸的培養(yǎng)基進行處理這樣的、例如在連續(xù)培養(yǎng)中可以應(yīng)用本發(fā)明。并且，本發(fā)明的有機酸的制造方法的上述步驟c中，還可以在利用上述酵母進行 發(fā)酵時將上述酵母生產(chǎn)的有機酸通過添加堿而中和，通過停止或減少添加堿，從而通過上述酵母生產(chǎn)的有機酸將含有有機酸的培養(yǎng)基調(diào)整為低PH。即，用于將培養(yǎng)基調(diào)整為低pH的 有機酸可以不是從培養(yǎng)系外部添加，而是利用上述酵母生產(chǎn)的有機酸。進而，在本發(fā)明的有機酸的制造方法中，上述含有有機酸的培養(yǎng)基可以是通過向 含有有機酸鹽的培養(yǎng)基添加無機酸而含有游離的有機酸的物質(zhì)。即，如上所述，在將酵母生 產(chǎn)的有機酸進行堿中和而以有機酸鹽的狀態(tài)含在培養(yǎng)基時，通過添加無機酸(例如強酸) 而能使有機酸游離。由此，能夠準(zhǔn)備用于處理酵母的含有有機酸的培養(yǎng)基。另一方面，本發(fā)明的有機酸的制造方法中，上述含有有機酸的培養(yǎng)基可以是從外 部添加有機酸而調(diào)整為低PH的培養(yǎng)基。其中，作為用于將上述培養(yǎng)基調(diào)整為低pH的有機酸，可以舉出選自乳酸、琥珀酸 以及丙酮酸中的至少1種的有機酸。本發(fā)明的有機酸的制造方法中，上述酵母是屬于酵母(Saccharomyces)屬的酵 母，特別是優(yōu)選使用屬于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種的酵母。本發(fā)明的有 機酸的制造方法中，優(yōu)選使用導(dǎo)入了乳酸脫氫酶基因的突變體作為上述酵母。即，本發(fā)明的 有機酸的制造方法中，優(yōu)選以乳酸作為生產(chǎn)對象有機酸。根據(jù)本發(fā)明，能夠非常簡單地提高生產(chǎn)有機酸的酵母的有機酸生產(chǎn)能力，能夠大 幅改善利用發(fā)酵法的有機酸生產(chǎn)率。


圖1為表示施加乳酸應(yīng)激與發(fā)酵試驗的PH之間的關(guān)系的特性圖。圖2為表示各種培養(yǎng)基中的因菌自身生產(chǎn)的有機酸而導(dǎo)致的PH變化的特性圖。圖3為表示利用菌自身生產(chǎn)的有機酸而施加pH應(yīng)激時的發(fā)酵試驗的結(jié)果的特性 圖。其中，縱軸所示的濃度(％ )是發(fā)酵18小時后的發(fā)酵液組成的濃度。
具體實施例方式本說明書包括作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國專利申請2008-1708M號的說明 書和/或附圖所記載的內(nèi)容。 下面，對本發(fā)明進行詳細的說明。 本發(fā)明中，將生產(chǎn)有機酸的酵母，在進行作為目標(biāo)物質(zhì)的有機酸的發(fā)酵生產(chǎn)之 前，用調(diào)整為低PH的含有有機酸的培養(yǎng)基進行處理。在此，作為生產(chǎn)有機酸的酵母，可 以是原本就具有有機酸生產(chǎn)能力的酵母，也可以是通過基因工學(xué)的方法等賦予了有機 酸生產(chǎn)能力的酵母。作為酵母的一例可以舉出屬于酵母(Saccharomyces)屬、釀酒裂 殖酵母(Shizosaccharomyces)屬、念珠菌(Candida)屬、畢赤酵母(Pichia)屬、漢遜 酵母(Hansenula)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、克魯維酵母 (Kluyveromyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、伊薩酵 母(Issatchenkia)屬的酵母。其中，優(yōu)選使用屬于釀酒酵母的菌種的酵母。而且，優(yōu)選使 用導(dǎo)入了 1拷貝或多拷貝乳酸脫氫酶基因(LDH基因)的釀酒酵母突變體且其被賦予了乳 酸生產(chǎn)能力。另外，作為酵母生產(chǎn)的有機酸優(yōu)選為乳酸，但并不局限于此，例如可以以丙酮 酸、琥珀酸、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸、乙酸、3-羥丙酸、丙二酸、丙酸、天門冬氨酸、谷氨酸、衣 康酸、乙酰丙酸、抗壞血酸、葡萄糖酸等的有機酸為生產(chǎn)對象。
4
另外，對于主要代謝產(chǎn)物為乙醇的野生型酵母，為了賦予有機酸的生產(chǎn)能力有必 要進行代謝改變。例如，對酵母賦予乳酸生成能力時，可以用轉(zhuǎn)化與乳酸生物合成相關(guān)基因 的方法進行應(yīng)對。作為與乳酸生物合成相關(guān)的基因，可以例示日本專利特開2003-259878號公 報所記載的乳酸脫氫酶基因、來源于乳酸菌的基因(J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 209-215、特表2005-518197號)、來源于巨大芽胞桿菌(Bacillus megatherium)的基因 (特表 2005-518197 號)、來源于真菌(根霉屬)的基因(J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30， 22-275)、來源于牛的基因(Appl. Environ. Microbiol. 67，5621-5625)等。除此之外作為可 以使用的基因還可以舉出來源于乳酸菌等的原核生物、真菌等的真核生物、植物、動物和昆 蟲等的高等真核生物的乳酸脫氫酶。特別是優(yōu)選將日本專利特開2003-259878號公報所記載的導(dǎo)入了乳酸脫氫酶基 因的酵母作為具有乳酸生成能力的酵母使用。該乳酸脫氫酶基因由于其在酵母中的表達已 被最適化，所以轉(zhuǎn)化到酵母時能夠高效率生產(chǎn)L-乳酸。其中，作為轉(zhuǎn)化微生物的例子可以 舉出重組酵母(Appl. Environ. Microbiol.，1999，65 (9) ；4211-4215)等。另外，所述對酵母的處理是指將調(diào)整為低pH的含有有機酸的培養(yǎng)基與酵母接觸 的處理。在此，低pH是指培養(yǎng)基呈酸性條件的意思，S卩，不足pH7. O的意思，優(yōu)選pH4. O以 下、更優(yōu)選PH3. 5以下的意思。其中，為釀酒酵母時，對于乙醇發(fā)酵，培養(yǎng)、發(fā)酵的最適pH為 5. O至6. 0，當(dāng)在pH4. 0以下進行培養(yǎng)、發(fā)酵時，顯著抑制菌的繁殖、乙醇的生產(chǎn)。而且，根據(jù) 處理對象的酵母，在強酸性條件下有死亡的可能性。因此，作為低pH優(yōu)選的是調(diào)整成處理 對象的酵母不死亡的范圍。例如，處理導(dǎo)入了 LDH基因的釀酒酵母突變體的培養(yǎng)基的pH下 限，優(yōu)選調(diào)整為PH2.0。在此，處理酵母的培養(yǎng)基含有有機酸，被調(diào)整為低pH。用于將培養(yǎng)基調(diào)整為低pH 的有機酸，可以舉出選自乳酸、琥珀酸以及丙酮酸中的至少1種的有機酸。然而，作為有機 酸并不局限于這些示例，例如可以舉出乙酸、甲酸、安息香酸、檸檬酸、D-葡萄糖醛酸、草酸、 富馬酸、蘋果酸、3-羥丙酸、丙二酸、丙酸、天門冬氨酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、抗壞血 酸、葡萄糖酸等。另外，含有有機酸的培養(yǎng)基可以通過對后述的培養(yǎng)基組成從外部添加上述的有機 酸而準(zhǔn)備，也可以是對含有有機酸鹽的組成添加硫酸等的強酸而使有機酸游離的培養(yǎng)基。 在此，從有機酸鹽游離有機酸時，只要是比對象有機酸強的酸則無特別限定。用于處理酵母的培養(yǎng)基中，對于培養(yǎng)基組成沒有特別的限定。例如，作為發(fā)酵培養(yǎng) 基的營養(yǎng)碳源可以使用任意的作為具有有機酸生成能力的酵母的營養(yǎng)碳源已知的物質(zhì)，在 酵母進行繁殖生成有機酸的范圍內(nèi)根據(jù)所使用的酵母的種類適當(dāng)選擇。例如使用葡萄糖、 麥芽糖、蔗糖、糖蜜、來自玉米漿以及纖維素系物質(zhì)的糖類等作為營養(yǎng)碳源。另外，作為發(fā)酵 培養(yǎng)基的氮源，例如可以使用酵母提取物、蛋白胨以及乳清等，但為了制成低價且對提純工 序沒有負擔(dān)的培養(yǎng)基，優(yōu)選不添加氮源，或者使用硫酸銨等銨鹽等的無機態(tài)氮、尿素。進而， 作為無機物營養(yǎng)源，例如可以使用磷酸鉀、硫酸鎂、Fe (鐵)、Mn (錳)化合物等，但不是必須 的成分。將上述酵母用調(diào)整為低pH的培養(yǎng)基進行處理時，例如，使用以乳酸調(diào)整為pH3. 0 的培養(yǎng)基時，優(yōu)選2小時以上。并且，培養(yǎng)基的pH越低，越可以縮短處理時間。另外，處理溫度雖然因酵母的種類而不同，但通常在約為20 40°C左右進行。其中，根據(jù)酵母的種類 也可以在超過40°C的高溫下進行處理。另外，也可以對調(diào)整為低pH的培養(yǎng)基進行攪拌或者 振蕩等而處理上述酵母。如上所述，通過將具有有機酸生產(chǎn)能力的酵母，以調(diào)整為低pH的培養(yǎng)基進行處 理，能夠提高該酵母的有機酸生產(chǎn)能力，進而能夠提高該酵母的耐酸性。有機酸生產(chǎn)能力可 以通過對使用未處理的酵母生產(chǎn)有機酸時的培養(yǎng)基所含的有機酸濃度和使用上述處理后 的酵母生產(chǎn)有機酸時的培養(yǎng)基所含的有機酸濃度進行對比而評價。另外，使用上述酵母的有機酸的制造可以用分批式培養(yǎng)進行，也可以用連續(xù)式培 養(yǎng)進行，還可以用半分批式培養(yǎng)進行。分批式培養(yǎng)是對于多次的培養(yǎng)每次準(zhǔn)備新培養(yǎng)基，向 其植入酵母，直至有機酸的生產(chǎn)結(jié)束不添加培養(yǎng)基的方法。連續(xù)式培養(yǎng)也稱為灌流培養(yǎng)，是 以一定的速度向培養(yǎng)系供給培養(yǎng)基，同時抽取同量的培養(yǎng)液的培養(yǎng)法。半分批式培養(yǎng)是在 培養(yǎng)過程中一邊將培養(yǎng)基自身、培養(yǎng)基中的特定的成分連續(xù)或間歇性添加一邊進行培養(yǎng)的 方法。另外，無論采用哪一個方式的情況下，均可以將上述的酵母以擔(dān)載于固體化載體的狀 態(tài)進行使用。在這些的任一方式中，均能通過在開始用上述酵母發(fā)酵生產(chǎn)有機酸之前使用上述 的調(diào)整為低PH的含有有機酸的培養(yǎng)基進行處理，而大幅提高利用發(fā)酵生產(chǎn)的有機酸的生 產(chǎn)效率。另外，任一方式中，為了防止因培養(yǎng)中產(chǎn)生的有機酸而PH向酸性側(cè)變化，也可以進 行氨、Ca (OH) 2、CaC03以及NaOH等中和劑的添加(添加堿)。并且，通過上述的調(diào)整為低pH 的培養(yǎng)基進行處理的酵母，由于其耐酸性得到了提高，因此即使沒有使用中和劑將PH維持 在中性區(qū)域，也能發(fā)酵生產(chǎn)有機酸。另外，在上述的任一方式中，均能通過在有機酸的發(fā)酵制造結(jié)束時將培養(yǎng)基通過 有機酸調(diào)整為低PH而在下次的有機酸發(fā)酵制造中提高酵母的有機酸生產(chǎn)能力。即，本發(fā)明 的有機酸的制造方法能夠應(yīng)用于經(jīng)過多次的有機酸的發(fā)酵制造而進行的制造方法，能夠通 過在各次的發(fā)酵制造結(jié)束時通過有機酸調(diào)整為低PH而提高酵母的有機酸生產(chǎn)能力。在進行有機酸的發(fā)酵制造時通過上述的添加堿而進行中和的情況下，可通過停止 添加堿或減少添加量而降低PH，從而能夠準(zhǔn)備調(diào)整為低pH的含有有機酸的培養(yǎng)基。另外， 通過添加堿而使培養(yǎng)基含有有機酸鹽的情況下，可通過添加硫酸等的強酸而使有機酸游離 于培養(yǎng)基中，從而能夠準(zhǔn)備調(diào)整為低pH的含有有機酸的培養(yǎng)基。在此，從有機酸鹽使有機 酸游離時，只要是比對象有機酸強的酸就沒有特別限定。并且，使用上述的酵母發(fā)酵制造有機酸時，對于溫度條件沒有特別的限定，約為 20 40°C左右。然而，根據(jù)使用的酵母，也可以在更高的溫度下進行。對于生成有機酸所 需的反應(yīng)時間也沒有特別的限定，可在能夠得到本發(fā)明效果的范圍內(nèi)以任意的生成反應(yīng)時 間實施。另外，由于生成有機酸所需的反應(yīng)時間與菌體的接種量成反比，所以探討接種量則 能夠調(diào)整反應(yīng)時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定這些條件的最適化。實施例下面，用實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不被以下的實施 例所限定。實施例1本實施例中，以日本特開2006-006271中制作的乳酸脫氫酶4拷貝導(dǎo)入菌株作為母株，制備進一步導(dǎo)入了 2拷貝乳酸脫氫酶基因的菌株(乳酸脫氫酶基因6拷貝導(dǎo)入菌 株)，作為乳酸生產(chǎn)酵母。(G418耐性標(biāo)記盒的構(gòu)建)以酵母NBRC2260株的基因組DNA為模板，對TDH3啟動子區(qū)域的DNA片段以PCR 進行了 擴增。PCR 引物使用了 TDH3P-U(5’ -ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AA-3，(序列號1)、TDH3啟動子序列上附加BamHI酶切位點)、TDH3P_D(5，-ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3，(序列號1)、TDH3啟動子序列上附加EcoRI酶切位 點)。將擴增了的TDH3啟動子序列用限制酶BamHI和EcoRI消化的片段稱為TDH3P片段。以大腸桿菌K-12株基因組的基因組DNA為模板，對G418耐性基因片段以PCR進 行了擴增。PCR 引物使用了 G4180RF-U(5’ -ATA TAT GAA TTC ATG CAT ATT CAA CGG GAA AC-3，(序列號3)、G418耐性基因序列上附加限制酶EcoRI酶切位點)和G4180RF-D (5，_ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA TTC-3，(序列號 4)、G418 耐性基因序列附加限制 酶AflII酶切位點)。將擴增了的G418耐性基因序列用限制酶EcoRI和AflII消化的片段 稱為G418片段。以酵母NBRC2260株的基因組DNA為模板，將CYCl終止子區(qū)域的DNA片段用PCR 進行了擴增。PCR 引物使用了 CYClT-U (5’ -ATA TAT CTT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3，(序列號5) ,CYCl終止子序列上附加AflII酶切位點)、CYClT-D (5’ ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3，(序列號6) ,CYCl終止子序列上附加SacII酶切位點)。將 擴增了的CYCl終止子序列用限制酶AflII和McII消化的片段稱為CYClT片段。將在上述操作中得到的TDH3P片段、G418片段和CYClT片段，以該順序排列的方式 依次連接于pBluescriptll SK+載體的多克隆位點，構(gòu)建了 G418耐性標(biāo)記盒。將得到的載 體用限制酶Mel和EcoRV消化，并進行末端修飾酶T4DNA polymerase處理，切取G418耐 性標(biāo)記盒，將末端平滑化的片段稱為G418耐性標(biāo)記盒片段。(染色體導(dǎo)入型載體pBG418-LDHKCB的構(gòu)建)如下制備了用于在7號染色體中的PDC6基因和CTTl基因之間導(dǎo)入LDH基因的染 色體導(dǎo)入型載體。以酵母NBRC2260株的基因組DNA為模板，將PDC6基因5，上游序列的DNA片段用 PCR 進行了 擴增。PCR 引物使用了 PDC6-U (5，-ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C-3，(序列號7)、PDC6的5，上游序列上附加SacI酶切位點)和PDC6_D(5，-ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C_3，(序列號 8)、PDC6 的 5，上游序列上附加 NotI 酶 切位點)。將擴增了的PDC6基因5’上游序列用限制酶McI和NotI消化的片段稱為PDC6 片段。以酵母NBRC2260株的基因組DNA為模板，將CTTl基因5，上游序列的DNA片段 用 PCR 進行了擴增。PCR 引物使用了 CTTl-U(5‘ -ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C-3，(序列號9) ,CTTl的5，上游序列上附加ApaI酶切位點)和CTTl-D (5，-ATA TAT GGT ACC GGG CAA GTA ACG ACA AGA TTG-3，(序列號 10) ,CTTl 的 5，上游序列上附加 KpnI酶切位點)。將擴增了的CTTl基因5’上游序列用限制酶ApaI和KpnI消化的片段稱 為CTTl片段。對在日本特開2003-259878 (特愿2002-65879)號公報中制備的質(zhì)粒
7pBTrp-PDCl-LDHKCB,通過BamHI和I3StI進行消化而切取的片段稱為LDHKCB表達盒片段 (PDC1啟動子、LDH基因、TDH3終止子以該順序連接的片段)。將在上述操作中得到的各 片段(PDC6片段、LDHKCB表達盒片段、G418耐性標(biāo)記盒片段和CTTl片段)，依次連接于 pBluescriptll SK+載體的多克隆位點，構(gòu)建了染色體導(dǎo)入型載體pBG418_LDHKCB。
(LDH6拷貝導(dǎo)入株的制備)以乙酸鋰法(Ito et al.，J. Bacteriol.，153，163-168(1983))，使用將 PG418-LDHKCB載體用限制酶&icl和KpnI消化的片段，將在日本特開2006-006271號公報 中制備的PDClp-LDH 4拷貝菌株轉(zhuǎn)化。以含10 μ g/ml G418的YPD培養(yǎng)基選拔后，用PCR 確認導(dǎo)入基因，得到了轉(zhuǎn)化體。將該株用胞子形成培養(yǎng)基(1%磷酸鉀、0. 酵母提取物、0.05%葡萄糖、2%瓊 脂)形成胞子，利用同宗配合性進行2倍化。取得作為2倍體的染色體的兩者均導(dǎo)入了目 標(biāo)基因的菌株，將其作為PDClp-LDH 6拷貝株。(賦予乳酸應(yīng)激和發(fā)酵試驗)對于上述PDClp-LDH6拷貝株，在含碳酸鈣0. 1 %的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物1 %、 蛋白胨2%、葡萄糖2% )上接菌，以150rpm/分鐘(振幅35mm)進行了 30°C、22小時的培 養(yǎng)，添加乳酸、琥珀酸或丙酮酸成為規(guī)定濃度，測定PH，進一步培養(yǎng)了 5小時。將發(fā)酵培養(yǎng)基(濃度糖12%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.04%、碳酸鈣 0.4% )20ml加入容量IOOml的燒瓶，將上述菌體以濃度成為4 %的方式進行接種，在 120rpm/分鐘(振幅35mm)、34°C的條件下進行發(fā)酵，研究乳酸的生產(chǎn)量。其中，由于在發(fā)酵 16小時的時間點上在全部處理區(qū)糖全被消費，或即使存在殘留糖的處理區(qū)乳酸濃度也開始 減少，而結(jié)束了發(fā)酵試驗。乳酸的測定使用了生物傳感器BF-4以及BF-5 (王子計測機器)。對乳酸進行測 定，將對酸處理后的培養(yǎng)基PH以及培養(yǎng)結(jié)束時的培養(yǎng)基PH進行測定的結(jié)果示于表1。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種有機酸的制造方法，其特征在于，具有如下步驟使具有生產(chǎn)有機酸能力的酵母以調(diào)整為低pH的含有有機酸的培養(yǎng)基進行處理的步驟a，和在所述步驟a之后，通過使用了所述酵母的發(fā)酵來產(chǎn)生有機酸的步驟b。
2.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述步驟a具有通過使用了所 述酵母的發(fā)酵來產(chǎn)生有機酸的步驟c，通過所述步驟c中產(chǎn)生的有機酸而將所述含有有機 酸的培養(yǎng)基調(diào)整為低PH。
3.如權(quán)利要求2所述的有機酸的制造方法，其特征在于，在所述步驟c中，在利用所述 酵母進行發(fā)酵時將所述酵母生產(chǎn)的有機酸通過添加堿而中和，通過停止或減少添加堿而由 所述酵母生產(chǎn)的有機酸將所述含有有機酸的培養(yǎng)基調(diào)整為低PH。
4.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述含有有機酸的培養(yǎng)基中 所含的有機酸是從外部添加的。
5.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述含有有機酸的培養(yǎng)基中 所含的有機酸是選自乳酸、琥珀酸和丙酮酸中的至少1種有機酸。
6.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述含有有機酸的培養(yǎng)基含 有通過向含有有機酸鹽的培養(yǎng)基添加無機酸而游離的有機酸。
7.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述酵母是屬于酵母屬的酵母。
8.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述酵母是屬于釀酒酵母菌 種的酵母。
9.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，所述酵母是導(dǎo)入有乳酸脫氫 酶基因的突變體。
10.如權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，其特征在于，酵母生產(chǎn)的有機酸是乳酸。
全文摘要
本發(fā)明使用生產(chǎn)有機酸的酵母發(fā)酵該有機酸而進行生產(chǎn)時，不實施突變育種、DNA重組育種等，通過簡單的方法提高有機酸的發(fā)酵效率。通過將生產(chǎn)有機酸的酵母在調(diào)整為低pH的含有有機酸的培養(yǎng)基中處理而大幅提高該酵母的有機酸生產(chǎn)效率。
文檔編號C12P7/40GK102076863SQ200980124268
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者多田宣紀(jì), 大西徹, 嶋村隆, 松下響, 石田亙廣 申請人:豐田自動車株式會社