專利名稱：液體乳鏈菌肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及液體乳鏈菌肽組合物，用于制備該組合物的方法，該組合物作為防腐 劑的用于以及利用該組合物使食物防腐的方法。
背景技術(shù)：
對改進(jìn)的食物防腐方法的需求是巨大的。據(jù)估計(jì)世界食物供應(yīng)的很大一部分由 于微生物酸敗造成損失，并且食物帶有的微生物感染代表了對人類健康的持久且嚴(yán)重的威 脅?？晌廴臼称泛妥魑锊⒃谄渲猩L的若干細(xì)菌物種是致病性的，或者生產(chǎn)毒素并引 起多種食物中毒疾病。盡管技術(shù)和衛(wèi)生方面取得了長足進(jìn)展，但是在食物加工環(huán)境中食品 仍可能暴露于酸敗和致病細(xì)菌中，并且在大部分國家中食物中毒的數(shù)量仍然在增長。食物 防腐技術(shù)(例如熱加工、冷凍、超聲、輻照和高壓處理)顯著地減少了微生物負(fù)荷，但是特別 值得關(guān)注的是經(jīng)加工的食物在加工之后和包裝之前被微生物污染。在食品工業(yè)中越來越關(guān) 注的是與多種食物如乳制品和肉制品、新鮮和冷凍的食物和海鮮相關(guān)的微生物問題。已知pH范圍4. 5到7. 0的食品尤其容易受到微生物(包括病原體和形成孢子的 細(xì)菌)造成的微生物酸敗影響。在較低的PH水平下，霉菌和耐酸細(xì)菌最為相關(guān)?；旧辖?jīng) 加工的食物不會(huì)在加工后被直接消耗，因此造成在生產(chǎn)過程中存活或通過之后的污染引入 的細(xì)菌生長。因?yàn)槭澄锵目赡茉谖磳⒔?jīng)加工的食物在足夠溫度下加熱足夠時(shí)間的情況下 發(fā)生，所以存在食物中毒或食物酸敗的風(fēng)險(xiǎn)。另外，近期保持生鮮食物固有的營養(yǎng)和感官品質(zhì)的微加工食物(minimally processed food)的流行增大了安全性風(fēng)險(xiǎn)。更溫和的防腐處理如高靜水壓(high hydrostatic pressure)和脈沖電場技術(shù)已被證明是成功的，但是通常依賴于有效的屏障 (hurdles)，即冷鏈和天然抗微生物劑的添加。食品安全領(lǐng)域中已進(jìn)行了詳盡的研究，以開發(fā)有效的抗微生物產(chǎn)品設(shè)計(jì)，這得到 了組合物、加工和保存條件的組合。乳鏈菌月太(nisin)是由Lactococcus lactis subsp. Iactis生產(chǎn)的一種月太樣抗菌 物質(zhì)。其包含34個(gè)氨基酸，并且主要針對革蘭氏陽性細(xì)菌是活性的。乳鏈菌肽是無毒的并 且無副作用。乳鏈菌肽是一種公認(rèn)為安全的物質(zhì)，并且在多種食物中廣泛使用。此類制品 的例子是經(jīng)加工的奶酪、奶、凝結(jié)奶油(clotted cream)、乳制品甜點(diǎn)(dairy dessert)、冰 激凌混合物、液體蛋(liquid egg)、熱烘焙的面粉制品(hot-baked flour product)、調(diào)味 汁(dressing)和啤酒。乳鏈菌肽是熱穩(wěn)定的，并且以最小的活性損失在巴氏消毒溫度下存 活。通常通過發(fā)酵Lactococcus Iactis物種獲得乳鏈菌肽，并進(jìn)一步配制成干粉， 所述干粉可以被原樣地或者在首先溶于合適溶劑中之后用作防腐劑。Delvoplusi 和 Nisaplin 是每克含有1百萬IU的乳鏈菌肽粉末的商標(biāo)名稱。它們分別由DSM和Danisco 發(fā)行。這些粉末狀乳鏈菌肽制品具有若干缺點(diǎn)加工時(shí)產(chǎn)生粉塵，并且將小量粉末計(jì)量和混 合進(jìn)制品中是困難的。因此，不具有上述缺點(diǎn)的液體乳鏈菌肽組合物在商業(yè)上是優(yōu)選的。
此類液體乳鏈菌肽組合物是本領(lǐng)域已知的。盡管據(jù)報(bào)道液體乳鏈菌肽組合物 具有針對革蘭氏陽性細(xì)菌(見 Mota-Meira et al. (2000), Montville et al. (1999)， US 5，584，199和US 4, 597, 972)和甚至針對革蘭氏陰性細(xì)菌(見EP O 453 860，US 5，沈0，271和US 5，559，096)的活性，但是仍然需要具有經(jīng)改進(jìn)的(特別是針對食品工業(yè)中 存在的革蘭氏陽性細(xì)菌的)抗微生物活性的液體乳鏈菌肽組合物。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，出人意料地發(fā)現(xiàn)了具有非常高的針對革蘭氏陽性細(xì)菌的活性的乳鏈菌肽組 合物。由于它們的高抗微生物活性，僅需要小量組合物來實(shí)現(xiàn)針對細(xì)菌(例如革蘭氏陽性 細(xì)菌)的有效作用。組合物具有良好的微生物學(xué)穩(wěn)定性，與其良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性組 合在一起，使得組合物適合長期儲存，因此賦予它們長的保存期。另外，本發(fā)明的組合物能 夠具有低濁度，使得它們適用于需要添加低濁度添加劑的食物應(yīng)用?？紤]到上述特征，本發(fā) 明的組合物可有利地被用作食物防腐劑。發(fā)明詳述根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了制備液體乳鏈菌肽組合物、優(yōu)選地制備水性液體乳 鏈菌肽組合物的方法。所述方法包括步驟a)制備含乳鏈菌肽的第一液體組合物，所述第 一液體組合物具有約1. 5到約12、優(yōu)選地約3到約10、優(yōu)選地約3. 5到約9. 5、更優(yōu)選地約 4到約9、還更優(yōu)選地約4. 5到約8. 5、進(jìn)一步更優(yōu)選地進(jìn)一步更優(yōu)選地約5到約8、最優(yōu)選 地約5. 5到約7. 5、特別是約5. 5到低于7的pH，b)從所制備的含乳鏈菌肽的第一液體組 合物中分離固體組分，c)將經(jīng)分離的固體組合物與pH約0到約5、優(yōu)選地約0. 5到約4. 5、 更優(yōu)選地約1到約4、進(jìn)一步更優(yōu)選地約1. 5到約3. 5、最優(yōu)選地約1. 5到約3、特別是約2 到約3的溶液接觸，以制備第二液體乳鏈菌肽組合物，和d)從第二液體乳鏈菌肽組合物中 去除固體組合物。步驟d是任選的，但是在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中在本發(fā)明的方法中進(jìn)行 步驟d。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括步驟e)將第二液體乳鏈菌肽組合物的 PH調(diào)節(jié)至想要的pH-值如2和6之間的pH，例如2和3之間的pH或5和6之間的pH。任選地，可以在本發(fā)明方法的至少一個(gè)步驟之前、期間或之后添加至少一種下文 提到的額外的功能性化合物。例如，可以在步驟c期間添加冷動(dòng)保護(hù)劑例如甘油，使得第 二液體乳鏈菌肽組合物包含35%到60% w/w的冷凍保護(hù)劑。在另一個(gè)例子中，可以在步 驟b之前添加降低或消除泡沫形成的化合物和/或額外的抗微生物化合物，例如有機(jī)酸或 其鹽。然而在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟d之后和步驟e之前，或者在步驟e期間或之 后，添加至少一種額外的功能性化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a包括將乳鏈菌肽與水性溶液混合以制備含乳鏈菌肽的 第一液體組合物，所述第一液體組合物具有1. 5M或低于1. 5M、優(yōu)選地0. 05M到1. 5M和更優(yōu) 選地0. IM到1. 5M的最終無機(jī)鹽(例如NaCl)濃度。含有乳鏈菌肽的第一液體組合物具有 約1. 5到約12、優(yōu)選地約3到約10、優(yōu)選地約3. 5到約9. 5、更優(yōu)選地約4到約9、進(jìn)一步更 優(yōu)選地約4. 5到約8. 5、還進(jìn)一步優(yōu)選地約5到約8和最優(yōu)選地約5. 5到約7. 5和特別是約 5. 5到低于7的pH?？梢詫⑷魏稳闂U菌肽源懸浮和/或溶解于水性溶液中。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，乳桿菌肽是粉末，優(yōu)選地是干粉。例如，可以使用可商業(yè)獲得的乳桿菌肽粉末組合物如Delvoplus⑧和Nisaplin⑧。所述乳桿菌肽源可包含乳桿菌肽A、乳桿菌肽Z或 其組合。水性溶液可以是緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖液如NaH2P04/Na2HP04。當(dāng)然也可以使用 其他合適的緩沖液。這些包括但不限于乙酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、甘 氨酸/HCl緩沖液及其任何組合?？梢酝ㄟ^公知的分離技術(shù)將固體化合物從含有乳鏈菌肽的第一液體組合物中分 開/分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b通過離心、過濾或其任何組合方式進(jìn)行。隨后，可以通過例如將經(jīng)分離的固體組合物與pH約0到約5、優(yōu)選地約0. 5到約 4. 5、更優(yōu)選地約1到約4、進(jìn)一步更優(yōu)選地約1. 5到約3. 5、最優(yōu)選地約1. 5到約3和特別 是約2到約3的溶液(優(yōu)選地水性溶液)接觸(例如溶解或混合或懸浮于所述溶液中)，來 制備第二液體乳鏈菌肽組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該步驟中添加下文提到的額外的功 能性化合物。接著，可以通過去除例如剩余的碎片和/或非乳鏈菌肽蛋白質(zhì)或其部分，來純化 第二液體乳鏈菌肽組合物。所述純化步驟可以通過公知的分離技術(shù)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，通過離心、過濾或其任何組合方式進(jìn)行步驟d。上述方法得到下述液體乳鏈菌肽組合物，其與現(xiàn)有技術(shù)中描述的液體乳鏈菌肽組 合物相比具有高得多的針對微生物(特別是革蘭氏陽性細(xì)菌)的活性。換句話說，本發(fā)明 的方法得到下述液體乳鏈菌肽組合物，其與現(xiàn)有技術(shù)中描述的液體乳鏈菌肽組合物相比具 有低得多的針對微生物(特別是革蘭氏陽性細(xì)菌)的最小抑制濃度(MIC)。因此，能夠通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乳鏈菌肽組合物是本發(fā)明的另一部分。 乳鏈菌肽組合物可以是固體，但是優(yōu)選地是液體組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物具有1.0yg/ml或更低的針對至 少一種革蘭氏陽性細(xì)菌的MIC。MIC是指抑制所測試的生物生長所需的化合物或組合物 的最小濃度。優(yōu)選地，MIC是至少三次獨(dú)立重復(fù)的平均。在本文所述測定中針對至少一種 革蘭氏陽性細(xì)菌的生長抑制進(jìn)行測試時(shí)，本發(fā)明的組合物具有1.0yg/ml或更低的MIC。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物針對至少一種革蘭氏陽性細(xì)菌具有0.5yg/ml或更 低的MIC，優(yōu)選地0. lyg/ml或更低的MIC，更優(yōu)選地0. 05 μ g/ml或更低的MIC，進(jìn)一步 更優(yōu)選地0. 01 μ g/ml或更低的MIC，還進(jìn)一步更優(yōu)選地0. 005 μ g/ml或更低的MIC，特別 地0. 001 μ g/ml或更低的MIC,更特別地0. 0005 μ g/ml或更低的MIC,和最特別地針對 至少一種革蘭氏陽性細(xì)菌0.0001 μ g/ml或更低的MIC。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于， Micrococcus sp. , Listeria sp. , Bacillus sp. , Staphylococcus sp. , Clostridium sp., Streptococcus sp. , Lactobacillus sp.禾口 Lactococcus sp。在一個(gè)實(shí)施方案中，革蘭氏 陽性細(xì)菌選自由 Bacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria 禾口 Micrococcus 組 成的組° Bacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria 禾口 Micrococcus 屬內(nèi)合適 的物種分別包括但不限于 B. subtilis, L. Iactis, S. aureus, L. innocua 和 M. Iuteus0 給 出的物種內(nèi)合適的菌株分別包括但不限于Bacillus subtilis ATCC 31578，Lactococcus lactis ATCC 19257, Staphylocoocus aureus ATCC 27661, Listeria innocua LMD 92. 20 和Micrococcus luteus B212。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物針對Μ. Iuteus 的至少一種菌株(優(yōu)選地Μ. luteus B212)具有0. 5 μ g/ml或更低的MIC，優(yōu)選地0. 1 μ g/ ml或更低的MIC，更優(yōu)選地0. 05 μ g/ml或更低的MIC，進(jìn)一步更優(yōu)選地0. 01 μ g/ml或更低的MIC，還進(jìn)一步更優(yōu)選地0. 005 μ g/ml或更低的MIC，特別是0. 001 μ g/ml或更低的MIC 和更特別地0. 0005 μ g/ml或更低的MIC?？梢允褂眉夹g(shù)人員公知的以下生物測定法測量乳鏈菌肽活性(見 Pongtharangkul and Demirci，2004)，包括在低pH下預(yù)處理乳鏈菌肽組合物。簡言之，使用 新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)物制備含有M. Iuteus B212的瓊脂平板(Iso-sensitest瓊脂)。干燥后，使 用真空泵在瓊脂上產(chǎn)生小洞。將樣品及其稀釋液(10μ 1)轉(zhuǎn)移進(jìn)洞中，允許其在5°C下向瓊 脂內(nèi)擴(kuò)散18小時(shí)。隨后將瓊脂平板在30°C下孵育M小時(shí)，并測量含有樣品的洞周圍的抑制 區(qū)。還包括具有已知量乳鏈菌肽(0-1600IU/ml)的與樣品平行的對照。它們的抑制區(qū)被用 于制備測定樣品乳鏈菌肽水平所需的校準(zhǔn)曲線。所有步驟無菌進(jìn)行。乳鏈菌肽的IU已如下 文定義。The World Health Organization Committee on Biological Standardization, Twenty second report. World Health Organization Technical Report Series，1970 年No. 444已確立了乳鏈菌肽的國際參照制劑，并且國際單位(下文稱為IU)被定義為 0. OOlmg該制劑。DSM和Danisco分別提供了 Delvoplus .和Nisaplin⑧，它們是每克含 有1百萬IU的乳鏈菌肽粉末制劑的商標(biāo)名。借助于上述測定法，可以測定樣品中的乳鏈菌 肽濃度?？梢越柚韵碌腗IC測定法測量乳鏈菌肽組合物的MIC。使用技術(shù)人員公知的標(biāo) 準(zhǔn)微稀釋發(fā)酵液測定法(standard microdilution broth assay)測量乳鏈菌肽活性。簡 言之，使用新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)物制備含有Micrococcus luteus B212的Iso-sensitest發(fā)酵 液。使用計(jì)數(shù)腔測定每ml的細(xì)胞數(shù)。優(yōu)選地使用IO3的細(xì)胞計(jì)數(shù)。向96孔微量滴定板的 每個(gè)孔中添加100 μ 1接種物。向第一個(gè)孔(Al)中添加100 μ 1乳鏈菌肽組合物，并通過向 上和向下移液三次使其充分混合。通過將loo μ ι第一孔轉(zhuǎn)移至下一個(gè)孔m并適當(dāng)稀釋 來制造系列稀釋液。重復(fù)這一步驟，直至每種組分在36個(gè)孔中被系列稀釋。接著將平板在 30°C下孵育7天，每天針對細(xì)菌生長進(jìn)行讀數(shù)。MIC濃度是完全抑制生長的最低濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物具有約0到約5、優(yōu)選地約0. 5到約4. 5、更優(yōu) 選地約1到約4、進(jìn)一步更優(yōu)選地約1. 5到約3. 5、最優(yōu)選地約1. 5到約3和特別是約2到 約3的pH。在這樣的pH條件下，本發(fā)明組合物的微生物穩(wěn)定性良好，并且組合物的MIC低 且儲存期間穩(wěn)定。在又一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含0. 01到5%、優(yōu)選地0. 05到 2. 5%、更優(yōu)選地0. 1到1.0%、最優(yōu)選地0. 15到0. 5%和特別是0. 2到0. 3% (w/w)的乳鏈 菌肽。本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物可包含少量鹽如無機(jī)鹽，例如NaCl。應(yīng)當(dāng)理解，下文提 到的額外的功能性化合物(例如抗微生物化合物如有機(jī)酸或其鹽)不包括在“鹽”的定義 之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含的鹽(例如無機(jī)鹽)與乳鏈菌肽的比例為 100 1到1 100，優(yōu)選地50 1到1 100，更優(yōu)選地25 1到1 100，特別是10 1 到1 100。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物基本上不含鹽(優(yōu)選地?zé)o機(jī)鹽 如NaCl)。無機(jī)鹽可以是任何合適的、食品級別的無機(jī)鹽。無機(jī)鹽的例子是NaCl、Na2SO4, (Ca)3(PO4)2、KNO3、KCl和MgC03。組合物中這些鹽的濃度是100mg/ml或更少，優(yōu)選地50mg/ ml或更少，更優(yōu)選地25mg/ml或更少，特別是15mg/ml或更少?？梢酝ㄟ^單獨(dú)的陽離子分 析、通過原子吸收陰離子分析、通過HPLC或優(yōu)選地通過燃燒(550+/-25°C )測定灰分含量，來測量鹽濃度。具有低無機(jī)鹽濃度的乳鏈菌肽組合物是非常吸引人的，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)干擾 食物基質(zhì)以致給出不想要的反應(yīng)和改變口味和/或結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物可包含少量除乳鏈菌肽和鹽之外的組分。這些組分可以 是蛋白質(zhì)或其部分。應(yīng)當(dāng)理解下文提到的額外的功能性化合物(例如抗微生物化合物、消 泡劑、表面活性劑等等)不包括在“除乳鏈菌肽和鹽之外的組分”的定義內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明的組合物包含的非乳鏈菌肽組分與乳鏈菌肽的比例為100 1到1 100，優(yōu) 選地10 1到1 100，更優(yōu)選地2 1到1 100。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的乳鏈菌 肽組合物基本不含這些組分。所述組分可源自使用Lact0c0ccus Iactis的乳鏈菌肽發(fā)酵 工藝期間生產(chǎn)的生物質(zhì)。乳鏈菌肽濃度可首先通過上文所述測定法來測量。隨后，可以使 用技術(shù)人員已知的經(jīng)典測定法評價(jià)總蛋白質(zhì)濃度。可以通過從總蛋白質(zhì)濃度中減去乳鏈菌 肽濃度來評價(jià)非乳鏈菌肽蛋白質(zhì)濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是澄清的液體組合物。澄清的液體乳鏈菌 肽組合物可在任何類型的制品上和/或制品中使用?？紤]到其透明度，它們可有利地被用 于其中透明度是重要的制品如基于果凍的制品(例如果凍甜品)、果汁、飲料和食品上的表 面應(yīng)用。本文中使用的透明液體組合物是濁度0到100FNU、優(yōu)選地0到50FNU、更優(yōu)選地0 到25FNU和特別是0到10FNU的液體組合物。渾濁的液體組合物是濁度大于100FNU的液 體組合物。以FNUO^ormazine濁度單位)表示的濁度可以用光散射方法測定，并且可以使 用測量方法DIN EN 27027/IS0 7027，使用N印hla濁度光度計(jì)測量?？梢酝ㄟ^根據(jù)本發(fā)明 的方法制備澄清以及渾濁的液體乳鏈菌肽組合物。如果在本發(fā)明方法的步驟a中制備了具 有約5或更高pH、優(yōu)選地約5到約9的pH的含乳鏈菌肽的液體組合物，則制備了澄清的液 體組合物。如果在本發(fā)明方法的步驟a中制備了具有低于約5的pH、優(yōu)選地約1. 5到低于 約5的pH，或大于約9的pH、優(yōu)選地大于約9到約12的pH，則制備了渾濁的液體組合物。 澄清和渾濁的液體乳鏈菌肽組合物都具有上述針對微生物(特別是革蘭氏陽性細(xì)菌)的高 活性。與其中含乳鏈菌肽的第一液體組合物的最終無機(jī)鹽濃度為1. 5M或更低的方法相 比，其中含乳鏈菌肽的第一液體組合物(即在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a中制備的液體乳 鏈菌肽組合物，見上文)的最終無機(jī)鹽(例如NaCl)濃度高于1. 5M的方法具有若干缺點(diǎn)。 首先，與最低無機(jī)鹽濃度為1. 5M或更低的液體乳鏈菌肽組合物相比，最終無機(jī)鹽濃度高于 1. 5M的第一液體乳鏈菌肽組合物顯示降低的離心分離性能(即具有更低的沉降速率)。其 次，通過進(jìn)行其中含乳鏈菌肽的第一液體組合物具有高于1. 5M的最終無機(jī)鹽濃度的、根據(jù) 本發(fā)明的方法(即步驟a到c和任選地步驟d到e，見上文)制備的得到的最終液體乳鏈菌 肽組合物具有若干缺點(diǎn)-所述組合物是渾濁的；-與通過其中含有乳鏈菌肽的第一液體組合物含有1.5M或更低的最終無機(jī)鹽濃 度的本發(fā)明方法制造的最終液體乳鏈菌肽組合物相比，所述組合物具有更低的純度；-與通過其中含有乳鏈菌肽的第一液體組合物含有1.5M或更低的最終無機(jī)鹽濃 度的本發(fā)明方法制造的最終液體乳鏈菌肽組合物相比，所述組合物具有更低的抗微生物活 性；和-與通過其中含有乳鏈菌肽的第一液體組合物含有1.5M或更低的最終無機(jī)鹽濃度的本發(fā)明方法制造的最終液體乳鏈菌肽組合物相比，所述組合物具有更高的沉淀風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的液體乳鏈菌肽組合物與現(xiàn)有技術(shù)中已知的液體乳鏈菌肽制劑相比具有 至少一種下文所列的優(yōu)點(diǎn)-與現(xiàn)有技術(shù)的液體乳鏈菌肽組合物相比，本發(fā)明的組合物具有更好的抗微生物 效力；和/或-本發(fā)明的組合物基本不含鹽如無機(jī)鹽，例如NaCl，并且基本不含其他非乳鏈菌 肽組分。因此，在食品應(yīng)用中，本發(fā)明組合物的使用不影響食物基質(zhì)從而導(dǎo)致不想要的反 應(yīng)，并且避免了 口味和/或結(jié)構(gòu)的改變，和/或-本發(fā)明的組合物可以是澄清的，即具有低濁度(0和100FNU之間)。此類組合物 不影響應(yīng)用它們的制品的顏色和/或透明度。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物還包含至少一種額外的功能性化合物，包括 但不限于額外的抗微生物化合物如酸，例如抗壞血酸、丙酸、苯甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、肉 桂酸、或任何這些酸的鹽，葡萄糖氧化酶，那他霉素，溶菌酶，多聚-L-賴氨酸，制霉菌素，魯 斯霉素，兩性霉素B，非律平(filipin)，片球菌素(pediocin)；表面活性劑例如SDS，吐溫， 脂肪酸；PH調(diào)節(jié)劑如HCl或NaOH或緩沖劑例如磷酸鹽或乙酸鹽；冷凍保護(hù)劑如甘油或丙 二醇；增稠劑例如黃原膠，瓜爾膠，阿拉伯膠，黃蓍膠(tragacanth gum)，結(jié)冷膠(gellan gum)，束[11 ! (locust bean(carrageenan gum), Mi^MWBl (rhamxan gum)，藻酸鹽，淀粉，羧甲基纖維素，羧乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丙基纖維素，甲基 纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇，聚丙二醇。另外，本發(fā)明的組合物可包含降低或消除泡沫形成 的試劑。這些額外的化合物可以固體或液體形式添加到本發(fā)明的組合物中，并且提前或在 使用之前立即充分混合。預(yù)期在本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物中使用至少一種額外的抗微生物 化合物/防腐劑會(huì)使其在微生物學(xué)上進(jìn)一步穩(wěn)定，因此可有益于其保質(zhì)期。可以通過去除雜質(zhì)，大幅提高水性液體組合物中存在的乳鏈菌肽的活性。另外，通 過去除雜質(zhì)如例如無機(jī)鹽來提高水性組合物中乳鏈菌肽的溶解速率。乳鏈菌肽可與雜質(zhì)部 分結(jié)合，導(dǎo)致就其防腐活性而言不可利用的乳鏈菌肽。換句話說，乳鏈菌肽在存在雜質(zhì)時(shí)具 有有限的生物利用度(bioavailability)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“生物利用度”是指液體、 半固體或固體配制物中乳鏈菌肽的利用度、量(例如濃度)或活性。雜質(zhì)如非乳鏈菌肽蛋 白質(zhì)或其他非乳鏈菌肽組分、細(xì)胞壁碎片和鹽可對乳鏈菌肽的溶解速率具有負(fù)面影響。發(fā) 現(xiàn)在存在這些雜質(zhì)時(shí)，大約少于50%的存在于此類液體配制物中的乳鏈菌肽可以作為防腐 劑被利用。已發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)存在于可商業(yè)獲得的乳鏈菌肽制品中?？缮虡I(yè)獲得的乳鏈菌肽通常 含有5-25%的非乳鏈菌肽蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片。這些雜質(zhì)源自乳鏈菌肽的生產(chǎn)過程。在發(fā)酵 之后的回收、純化或再配制中通常使用鹽，所述鹽會(huì)仍然存在于最終的乳鏈菌肽配制物中。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含增稠劑的乳鏈菌肽水性懸浮液。當(dāng)然，也可以使 用兩種或更多種不同的增稠劑。本發(fā)明的懸浮液包含0. 01到5%、優(yōu)選地0. 05到2. 5%, 更優(yōu)選地0. 1到1%、最優(yōu)選地0. 15到0. 5%、特別是0. 2到0. 3% (w/w)的乳鏈菌肽。本 發(fā)明的懸浮液包含0. 01到5%、優(yōu)選地0. 05到5%、更優(yōu)選地0. 1到5%、最優(yōu)選地0. 2到 5%、特別是0.5到5% (w/w)的增稠劑。增稠劑選自由黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、結(jié) 冷膠、刺槐豆膠、角叉菜膠、鼠李聚糖膠、藻酸鹽、淀粉、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、羥丙 基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚丙二醇組成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，增稠劑是膠質(zhì)如黃原膠。根據(jù)本發(fā)明的懸浮液的PH為約2到約12， 優(yōu)選地約2到約11，更優(yōu)選地約2到約10，進(jìn)一步更優(yōu)選地約2到約9，還進(jìn)一步更優(yōu)選地 約2到約8，最優(yōu)選地約2到約7，特別是約2到約6。本發(fā)明的懸浮液是穩(wěn)定的。在本文中 使用時(shí)，“穩(wěn)定的懸浮液”表示物理上穩(wěn)定的懸浮液，即在室溫下于PH 5儲存9天后，顯示 50%或更少、優(yōu)選地40%或更少、更優(yōu)選地30%或更少、進(jìn)一步更優(yōu)選地20%或更少、最優(yōu) 選地10%或更少、特別是0%的沉降的懸浮液?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法如本文所示的 沉降測定法來測量懸浮液的物理穩(wěn)定性(見實(shí)施例9)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的懸浮液還包含至少一種選自下組的額外的功能 性化合物，所述組由額外的抗微生物化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑和冷凍保護(hù)劑組成。合 適的額外的抗微生物化合物的例子是酸，如抗壞血酸、丙酸、苯甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、肉 桂酸、或任何這些酸的鹽，葡萄糖氧化酶，那他霉素，溶菌酶，多聚-L-賴氨酸，制霉菌素，魯 斯霉素，兩性霉素B，非律平，片球菌素。合適的表面活性劑是SDS，吐溫，脂肪酸，這里僅舉 出幾例。合適的PH調(diào)節(jié)劑的例子是HCl或NaOH或緩沖劑例如磷酸鹽或乙酸鹽等等。合適 的冷凍保護(hù)劑的例子是甘油和丙二醇。另外，本發(fā)明的懸浮液可包含降低或消除泡沫形成 的試劑。這些額外的化合物可以固體或液體形式對添加到本發(fā)明的懸浮液中，并且提前或 在使用之前立即充分混合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備根據(jù)本發(fā)明的懸浮液的方法，所述方法包 括步驟a)將乳鏈菌肽和增稠劑單獨(dú)地或以粉末組合物的形式添加到水性溶液(例如水) 中，和b)混合以獲得懸浮液。需要時(shí)可以將懸浮液的pH調(diào)節(jié)至約2到約12，優(yōu)選地約2到 約11，更優(yōu)選地約2到約10，進(jìn)一步更優(yōu)選地約2到約9，還進(jìn)一步更優(yōu)選地約2到約8，最 優(yōu)選地約2到約7，特別是約2到約6的pH。乳鏈菌肽和增稠劑可以單獨(dú)地被添加至水性溶液。它們可以是粉末形式或液體形 式?；蛘?，乳鏈菌肽和增稠劑可以存在于一種粉末組合物中，并且所述粉末組合物可以被添 加至水性溶液。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含乳鏈菌肽和增稠劑的粉末組合 物。乳鏈菌肽和/或增稠劑可以與上述額外的功能性化合物一起被添加至水性溶液中，然 后混合獲得懸浮液。或者，可以在獲得包含乳鏈菌肽和增稠劑的懸浮液之后添加額外的功 能性化合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，首先對水性溶液添加乳鏈菌肽，之后添加額外的功能性 化合物，之后添加增稠劑，并將溶液混合獲得懸浮液。在又一個(gè)實(shí)施方案中，首先對水性溶 液添加增稠劑，之后添加額外的功能性化合物，之后添加乳鏈菌肽并將混合物混合獲得懸 浮液。在又一個(gè)實(shí)施方案中，首先對水性溶液添加額外的功能性化合物，之后添加增稠劑和 /或乳鏈菌肽。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的水性懸浮液用于制備用于處理食物、飼料或 農(nóng)業(yè)制品的處理液體的用途。可以通過將水性溶液與根據(jù)本發(fā)明的懸浮液混合來制備處理 液體。食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品的處理可以通過噴霧、浸漬(dipping)、浸沒(immersion)、涂 刷來完成，此處僅舉出幾例。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物或懸浮液作為食物、飼料或農(nóng) 業(yè)制備中和/或上的防腐劑的用途。下文中，術(shù)語“懸浮液”還包括由根據(jù)本發(fā)明的懸浮 液制備的處理液體。本發(fā)明的組合物和懸浮液不具有與粉末配制物相關(guān)的缺點(diǎn)它們更易 于使用(易于施用)并且使用它們時(shí)不形成粉塵。另外防止了將乳鏈菌肽粉末溶于溶劑中時(shí)發(fā)生的泡沫形成和溶解問題。使食物制品防腐的乳鏈菌肽的有效水平范圍是從1到 1500IU/g或0. 025到37. 5ppm的乳鏈菌肽。根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮液可以單獨(dú)使用， 但是也可以與其他抗微生物組合物(例如包含有機(jī)酸或其鹽、溶菌酶的組合物)組合使用。 抗微生物組合物可在應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的組合物或懸浮液之前、期間或之后應(yīng)用于食物、飼 料或農(nóng)業(yè)制品。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含1到1000升根據(jù)本發(fā)明的組合物或懸浮液的容 器。容器可以是瓶、袋或罐，此處僅舉出幾例。根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品防腐的方法，其中使用 (例如在各種制品中和/或上應(yīng)用)本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物或懸浮液?？梢酝ㄟ^噴霧、 浸漬、浸沒、涂刷來應(yīng)用乳鏈菌肽組合物和懸浮液，此處僅舉出幾例方法。當(dāng)?shù)孜?制品是 液體或半液體時(shí)，它們可以直接被添加。組合物或懸浮液甚至可以在應(yīng)用它們的底物上留 下涂層，例如抗微生物涂層。任選地，在又一個(gè)步驟中，制品也可以被巴氏消毒/滅菌。所 述步驟當(dāng)然也可以在應(yīng)用本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物或懸浮液之前進(jìn)行?？梢杂帽景l(fā)明的組 合物或懸浮液處理所有種類的食物制品。食物制品可以是乳品食物制品；含有或源自蛋、 肉(尤其是禽例如新鮮屠宰的禽)、蔬菜、甲殼和魚的食物制品；水稻制品如米飯制品；烘焙 食物制品；飲料；冷凍食物制品；澄清的食物制品如基于果凍的食物制品，如果凍甜點(diǎn)；果 汁；涂抹物；果醬；罐裝水果和其他罐裝制品；其中對表面/在表面上應(yīng)用本發(fā)明的組合物 或懸浮液的食物制品。乳品食物制品包括但不限于經(jīng)加工的乳酪，奶，凝結(jié)奶油，乳制品甜 點(diǎn)，冰激凌混合物，調(diào)味汁和酸奶。根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮液也可以用于處理食物包 裝和操作設(shè)備，并可包括在用于包裝食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品的包裝材料中/上。本發(fā)明的 組合物和懸浮液也可以被用作消毒劑用于清潔食品加工工廠和其中制備或供應(yīng)食物的任 何區(qū)域(如醫(yī)院、養(yǎng)老院、餐廳尤其是快餐廳、熟食店等等)中的表面和烹飪炊具。根據(jù)本 發(fā)明的組合物和懸浮液能夠?qū)⒅破分械募?xì)菌生長抑制延長的時(shí)間段，例如至少約1天，2、 3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、 300、400、500、600、700、800、900天和優(yōu)選地至少約1000天。根據(jù)本發(fā)明的組合物和懸浮 液可以被用于預(yù)防細(xì)菌生長，例如革蘭氏陽性細(xì)菌如Maphylococcus、Streptococcus, Listeria和Coryneform細(xì)菌的生長。其甚至可以被用于預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌的生長，如革 蘭氏陰性細(xì)菌例如 Salmonella、Shigella、Escherichia Coli、Klebsiella、Pseudomonas> Bacterioides 禾口 Actinobacillus 細(xì)菌的生長。因此，包含根據(jù)本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物或懸浮液的食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品是本 發(fā)明的另一部分。在另一方面中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)固體(例如粉末)乳鏈菌肽組合物的方法，所述方 法包括對根據(jù)本發(fā)明的液體乳鏈菌肽組合物進(jìn)行例如干燥步驟、冷凍干燥步驟、結(jié)晶步驟 (需要時(shí)之后進(jìn)行過濾或離心)或沉淀步驟(需要時(shí)之后進(jìn)行過濾或離心)的步驟，此處僅 舉出幾例。這些步驟可以在上文所述本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物的制備方法的步驟c、d或e 之后立即進(jìn)行。它們也可以在將本發(fā)明的液體乳鏈菌肽組合物儲存一段時(shí)間后進(jìn)行。得到 的固體/粉末乳鏈菌肽組合物可與包含其他合適化合物(如例如上文所述的額外的功能性 化合物)的粉末組合物混合。本發(fā)明通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步闡述，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1制備液體乳鏈菌肽組合物制備以下的液體乳鏈菌肽組合物組合物A 將10克含有2. 5 % w/w乳鏈菌肽和至少50 % w/w NaCl的乳鏈菌肽粉 末 Nisaplin (Danisco，丹麥)溶于 HCl 水溶液(pH 2. 0-3. 0 ；總體積 100ml)中。組合物B 將10克含有2. 5 % w/w乳鏈菌肽和至少50 % w/w NaCl的乳鏈菌肽粉 末 Nisaplin (Danisco，丹麥)溶于 HCl 水溶液(pH 5. 5-6. 5 ；總體積 100ml)中。組合物C和D 將10克含有2. 5 % w/w乳鏈菌肽和至少50 % w/wNaCl的乳鏈菌肽 粉末Nisaplin (Danisco，丹麥)溶于0. 2M磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的經(jīng)緩沖的水溶液 (pH 7. 0 ；總體積IOOml ；另外制造pH為6的組合物和pH為6. 5的組合物)中。隨后將混 合物混合約15分鐘。將混合物在4500xg下于10°C離心15分鐘，獲得含有乳鏈菌肽的沉 淀物。隨后將沉淀物溶于檸檬酸水溶液(PH 2. 0到3. 0 ；總體積100ml)中。將混合物攪拌 15分鐘。將獲得的含有乳鏈菌肽的溶液在4500xg下于10°C離心15分鐘以去除剩余的固 體組分。將獲得的液體組合物保持在2. 0到3. 0的pH下(組合物C)，或通過添加NaOH將 PH調(diào)節(jié)至5. 5和6. 5之間的pH(組合物D)。組合物E和F 組合物E和F的制備與組合物C和D的制備相同，前提是將沉淀物 溶于pH為2. 0到3. 0的HCl水溶液中。組合物G和H 將10克含有2. 5 % w/w乳鏈菌肽和至少50 % w/wNaCl的乳鏈菌肽 粉末Nisaplin (Danisco，丹麥)溶于HCl水溶液(pH 2.0-3.0 ；總體積100ml)中。將 獲得的混合物在PH 2.0到3.0的HCl水溶液中透析M小時(shí)。接著將經(jīng)透析的混合物在 4500xg下于10°C離心15分鐘。將獲得的液體組合物保持在2. 0到3. 0的pH下(組合物 G)或者通過添加NaOH將pH調(diào)節(jié)至5. 5和6. 5之間的pH(組合物H)。將獲得的組合物用 于以下實(shí)驗(yàn)中。實(shí)施例2MIC測定法為了進(jìn)行MIC測定法，從在30°C下分別在Iso Sensitest發(fā)酵液(Oxoid)和平 板計(jì)數(shù)發(fā)酵液(Difco)中培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物中獲得新鮮培養(yǎng)的Micrococcus Iuteus細(xì)胞 (B212)和Pseudomonas aeruginosa細(xì)胞(ATCC9027)。在生理鹽水中制備分別具有4. 3xl05 和2.切104個(gè)菌落形成單位CFU/ml的菌種懸浮液。將30 μ 1各種菌種溶液分別添加至30ml Iso Sensitest發(fā)酵液(懸浮液A)和平板計(jì)數(shù)發(fā)酵液(懸浮液B)中。然后將100 μ 1懸 浮液A轉(zhuǎn)移至第一個(gè)96孔微量滴定板的每個(gè)孔中，并將100 μ 1懸浮液B轉(zhuǎn)移至第二個(gè)96 孔微量滴定板的每個(gè)孔中。根據(jù)實(shí)施例1制備乳鏈菌肽組合物。在標(biāo)準(zhǔn)微稀釋發(fā)酵液測定 法中使用100 μ 1乳鏈菌肽組合物來測定每種乳鏈菌肽組合物的最小抑制濃度(MIC)。表1 中展示的結(jié)果顯示乳鏈菌肽組合物C、D、E和F在pH 2. 5和pH 6. 0下顯示針對兩種微生物 (革蘭氏陽性微生物，即M. luteu，和革蘭氏陰性微生物，即P. aeruginosa)的最高活性(即 最低MIC)。組合物C和E的MIC比組合物A和G (組合物均具有2. 5的pH)的MIC低約40到約100倍之間，而組合物D和F的MIC比組合物B和H(組合物均具有6. 0的pH)的MIC 顯著更低。在PH 7下用0. IM磷酸鹽緩沖液制備的組合物C和D的MIC與在pH 6或pH 6. 5 下用0. 2M磷酸緩沖液制備的組合物C和D的MIC相當(dāng)。在另外單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，針對新鮮培養(yǎng)的Bacillus subtilis (ATCC31578)、 Staphylococcus aureus(ATCC 27661)、Lactococcus lactis(ATCC19257)禾口 Listeria innocua(LMD92. 20)比較組合物A和C的MIC濃度。與上述實(shí)驗(yàn)相同地進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)，前提 是制備的菌種懸浮液分別含有1. OxlO6U. 3x106、7. 7x104和2. 8xl05CFU/ml的各種微生物。 結(jié)果顯示對測試的革蘭氏陽性微生物而言，組合物C的MIC比組合物A的MIC低約5到約 300倍(數(shù)據(jù)未展示)。在pH 7下用0. IM磷酸鹽緩沖液制備的組合物C的MIC與在pH 6 或pH 6. 5下用0. 2M磷酸鹽緩沖液制備的組合物C的MIC相當(dāng)。實(shí)施例3液體乳鏈菌肽組合物在烘焙應(yīng)用中的用途制備兩種蛋糕。對每種蛋糕而言，將1000克Moscovisch Powder Damco與800克 液體蛋和100克水混合。一種蛋糕通過向液體蛋中添加120mg乳鏈菌肽粉末Nisaplin (Danisco，丹麥)來制備。第二種蛋糕通過向液體蛋中添加1. 2克組合物C來制備。在兩 種蛋糕中使用相同量的乳鏈菌肽(150mg乳鏈菌肽/1蛋)。在10分鐘期間在Hobart混合 器中將混合物于第三檔混合，并在170°C烤箱中烘焙25分鐘。兩種蛋糕以相同方式烘焙。包含組合物C的經(jīng)烘焙的蛋糕顯示精細(xì)的、羊毛樣碎屑結(jié)構(gòu)(woolly crumb structure)，而包含乳鏈菌肽粉末的蛋糕顯示堅(jiān)硬的不規(guī)則碎屑結(jié)構(gòu)。這清楚地顯示其中 使用本發(fā)明組合物的烘焙制品比其中使用乳鏈菌肽粉末的烘焙制品具有更好的結(jié)構(gòu)。與添 加乳鏈菌肽粉末相比，通過添加根據(jù)本發(fā)明的乳鏈菌肽組合物改進(jìn)了烘焙制品的結(jié)構(gòu)。該 實(shí)施例還顯示根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在烘焙之前被添加至制品中。實(shí)施例4液體乳鏈菌肽組合物在飲料應(yīng)用中的用途在該實(shí)驗(yàn)中針對減少飲料應(yīng)用中不同的污染性微生物活菌數(shù)(viable count)的 能力測試組合物A和C。使用來自中國Silver El印hant的乳鏈菌肽粉末，根據(jù)實(shí)施例1 制備組合物A和C。使用的飲料是來自哥倫比亞，Bavaria的麥芽飲品Pony。為了進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)，從30°C下平板計(jì)數(shù)發(fā)酵液(Difco)中過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)物中獲得從被污染的制品中分 1 的羊士音#的 Listeria monocytogenes MM (LMD 92. 20)、 Leuconostoc oenos MM (ML-34)和 Leuconostoc mesenteroides 細(xì)胞。在生理鹽水中制備分別為 3. 8xl05、5. 7xl06 和7. 2xl05CFU/ml的菌種懸浮液。將25 μ 1各種菌種溶液添加至25ml的加入了組合物A 或C的飲料中。測試的乳鏈菌肽濃度對Listeria monocytogenes細(xì)胞而言是0. 5ppm，對 Leuconostoc oenos 細(xì)胞而言是 4ppm,對 Leuconostoc mesenteroides 細(xì)胞而言是 2ppm。 每種微生物包括不含乳鏈菌肽的對照。將樣品在室溫下孵育，并使用公知方法以不同的時(shí) 間間隔測量微生物的總計(jì)數(shù)(以CFU/ml表示)。結(jié)果展示于表2中。它們清楚地證明對測試的三種不同的微生物的每一種而言， 組合物C在少于1天內(nèi)將活細(xì)胞計(jì)數(shù)降低至低于lCFU/ml的檢出極限，而組合物A需要兩 或三天來實(shí)現(xiàn)。因此，組合物C至少比組合物A快M-48小時(shí)。實(shí)施例5
液體乳鏈菌肽組合物在食物應(yīng)用模型中的用途在該實(shí)驗(yàn)中，在食物應(yīng)用模型中測試組合物A和C降低Listeria monocytogenes 的活菌數(shù)的能力。將活細(xì)胞計(jì)數(shù)降低至低于10CFU/ml的檢出極限后，還針對維持該低水平 和防止存活細(xì)胞向外生長的能力來測試乳鏈菌肽組合物。使用來自中國Silver Elephant 的乳鏈菌肽，根據(jù)實(shí)施例1制備組合物A和C。使用平板計(jì)數(shù)發(fā)酵液(Difco)制備應(yīng)用模 型。用HCl將培養(yǎng)基的pH設(shè)定為pH 7.0，并在1211下高壓滅菌15分鐘。為了進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)，從30°C下平板計(jì)數(shù)發(fā)酵液(Difco)中培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物中獲得新鮮培養(yǎng)的Listeria monocytogenes細(xì)胞(LMD 92.20)。在生理鹽水中制備3. ^107CFU/ml的菌種懸浮液。將 25 μ 1的菌種溶液添加至25ml的加入了組合物A或C的模型培養(yǎng)基中。測試的乳鏈菌肽濃 度對10°C下的實(shí)驗(yàn)而言是2. 5 μ g/ml，對室溫下的實(shí)驗(yàn)而言是12. 5 μ g/ml。測試的每個(gè)溫 度下包括不含乳鏈菌肽的對照。將樣品在10°C和室溫下孵育，并使用公知方法以不同的時(shí) 間間隔測量微生物的總計(jì)數(shù)(以CFU/ml表示)。結(jié)果清楚地證實(shí)在10°C的食物應(yīng)用模型中，組合物C將Listeria monocytogenes 的向外生長抑制了多于25天，而組合物A僅將所述向外生長抑制了 4天(見表幻。結(jié)果還 顯示在室溫下的食物應(yīng)用模型中，組合物C將Listeria monocytogenes的向外生長抑制了 多于25天，而組合物A僅將所述向外生長抑制了 2或3天(見表4)。實(shí)施例6使用離心制備中試規(guī)模的液體乳鏈菌肽組合物將100千克含有2. 5% w/w乳鏈菌肽和至少50% w/w NaCl的乳鏈菌肽粉末(中 國，Silver El印hant)溶于水中。用NaOH將pH設(shè)定至7. 0。隨后將混合物混合約1小 時(shí)。以1.5g/kg混合物添加消泡劑(Clerol FBA3107)。以2001/h的進(jìn)料速率，在10°C和 12000xg下對混合物進(jìn)行連續(xù)離心?；厥蘸腥殒溇墓腆w的濃縮物。隨后將濃縮物溶于 HCl水溶液(pH 2. O到3. O ；總混合物的質(zhì)量1000kg)中。將混合物攪拌至少1小時(shí)。再 次以2001/h的進(jìn)料速率，在10°C和12000xg下對混合物進(jìn)行連續(xù)離心，之后進(jìn)行深層過濾 (使用孔徑為3微米的濾器)和無菌過濾以去除剩余的固體組分。將獲得的液體組合物保 持在2.0到3.0的pH下。最終產(chǎn)物的濁度為21FNU，即獲得了澄清的液體組合物。獲得的 液體乳鏈菌肽組合物具有良好的抗微生物活性，即可與組合物C的MIC相比的MIC (見實(shí)施 例2)。還進(jìn)行上述方法而不進(jìn)行第二次連續(xù)離心的步驟。最終產(chǎn)物具有與上述最終產(chǎn)物 相同的特性。另外，進(jìn)行所述方法而不進(jìn)行第二次連續(xù)離心步驟，也不進(jìn)行深層過濾步驟。得到 的產(chǎn)物也具有與上述最終產(chǎn)物相同的特性。實(shí)施例7使用過濾制備中試規(guī)模的液體乳鏈菌肽組合物將100千克含有2. 5% w/w乳鏈菌肽和至少50% w/w NaCl的乳鏈菌肽粉末(中 國，Silver Elephant)溶于0. 2M磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的緩沖的水溶液(pH 7. 0 ；總混 合物的質(zhì)量1000kg)中。隨后將混合物混合約1小時(shí)。使用Dicalite BF助濾劑，在10°C 下通過死端過濾(dead-end filtration)來過濾混合物。回收含有乳鏈菌肽固體的濾餅。 隨后將濾餅溶于檸檬酸水溶液(PH 2. 0到3. 0 ；總混合物的質(zhì)量1000kg)中。將混合物攪拌至少1小時(shí)。在10°C下對獲得的含有乳鏈菌肽的溶液進(jìn)行死端過濾、深層過濾和無菌過 濾，以去除剩余的固體組分。將獲得的液體組合物保持在2. 0到3. 0的pH下。最終產(chǎn)物的 濁度為25FNU，即獲得了澄清的液體組合物。獲得的液體乳鏈菌肽組合物具有良好的抗微生 物活性，即能夠與組合物C的MIC(見實(shí)施例2、相比的MIC。實(shí)施例8在低pH下使用過濾制備液體乳鏈菌肽組合物將100克含有2. 5 % w/w乳鏈菌肽和至少50 % w/w NaCl的乳鏈菌肽粉末(中國， Silver Elephant)溶于水中。用NaOH將pH設(shè)定至4. 0。隨后將混合物混合約1小時(shí)。使 用Dicalite BF助濾劑，在10°C下通過死端過濾來過濾混合物。回收含有乳鏈菌肽固體的 濾餅。隨后將濾餅溶于HCl水溶液(pH 2. 0到3. 0)中。將混合物攪拌至少1小時(shí)。在10°C 下使用死端過濾、深層過濾和無菌過濾來過濾獲得的含有乳鏈菌肽的溶液，以去除剩余的 固體組分。將獲得的液體組合物保持在2. 0到3. 0的pH下。最終產(chǎn)物的濁度為123FNU，即 獲得了渾濁的液體組合物。獲得的液體乳鏈菌肽組合物具有良好的抗微生物活性，即能夠 與組合物C的MIC(見實(shí)施例2)相比的MIC0實(shí)施例9制備穩(wěn)定的乳鏈菌肽粉末懸浮液將含有2. 5% w/w乳鏈菌肽和至少50% w/w NaCl的乳鏈菌肽粉末(中國，Silver Elephant)懸浮于水中。添加多種用量的多種增稠劑。用HCl或NaOH溶液將pH設(shè)定為 PH 2或pH 5。在室溫下儲存9天后，通過分析含47.5ml懸浮液的50ml管中沉降鋒線 (sedimentation front)的高度，來分析懸浮液的物理穩(wěn)定性。結(jié)果展示于表5中。所有懸 浮液中的乳鏈菌肽濃度為0. 25% w/w。沉降被表述為觀察到的澄清液體(即不含有顆粒的 液體)的百分比。0%表示未發(fā)生沉降，因此懸浮液具有良好的物理穩(wěn)定性。結(jié)果顯示以高 于0.05% (w/w)的濃度使用黃原膠時(shí)，在pH 2和pH 5下懸浮液是物理穩(wěn)定的。結(jié)果還顯 示以(w/w)或更高的濃度使用CMC或藻酸鹽時(shí)，在pH 2和pH 5下懸浮液是物理穩(wěn)定 的，而對HPMC而言，3% (w/w)或更高的濃度導(dǎo)致物理穩(wěn)定的乳鏈菌肽懸浮液。表1 以μ g/ml表示的，乳鏈菌肽組合物針對M. Iuteus和P. aeruginosa的MIC
權(quán)利要求
1.制備液體乳鏈菌肽組合物的方法，所述方法包括步驟a)將粉末乳鏈菌肽與水性溶液混合制備含乳鏈菌肽的第一液體組合物，所述第一液體 組合物具有3. 5到12的pH和1. 5M或更低的最終無機(jī)鹽濃度，b)從所制備的含乳鏈菌肽的第一液體組合物中分離固體化合物，c)將經(jīng)分離的所述固體化合物與PH約1到約3的溶液接觸，以制備第二液體乳鏈菌肽 組合物，和任選地d)從所述第二液體乳鏈菌肽組合物中去除固體化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括步驟e)將所述第二液體乳鏈菌肽組合物的pH調(diào)節(jié)至期望值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述固體化合物通過離心、過濾或其任何組合方式 被分離或去除。
4.能夠通過根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法獲得的液體乳鏈菌肽組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其針對Micrococcusluteus B212具有0. 001 μ g/ml或 更低的最小抑制濃度(MIC)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物，所述組合物具有1.5到5的pH。
7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含的鹽與乳鏈菌肽的比 例為 100 1 到 1 100。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物具有0到100FNU的濁度。
9.根據(jù)權(quán)利要求4到8中任一項(xiàng)的組合物，還包含至少一種選自下組的化合物，所述組 由額外的抗微生物化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、冷凍保護(hù)劑、消泡劑和增稠劑組成。
10.包含增稠劑并具有2到12的PH的乳鏈菌肽水性懸浮液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的懸浮液，其包含0.01%到5%(w/w)的乳鏈菌肽和0.05%到 5% (w/w)的增稠劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的懸浮液，其中所述增稠劑選自由黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯 膠、黃蓍膠、結(jié)冷膠、刺槐豆膠、角叉菜膠、鼠李聚糖膠、藻酸鹽、淀粉、羧甲基纖維素、羧乙基 纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚丙二醇組 成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求10到12中任一項(xiàng)的懸浮液，其還包含至少一種選自下組的化合物， 所述組由額外的抗微生物化合物、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、消泡劑和冷凍保護(hù)劑組成。
14.制備根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的懸浮液的方法，所述方法包括步驟a)向水性溶液中添加乳鏈菌肽和增稠劑，所述乳鏈菌肽和增稠劑分別單獨(dú)地添加或作 為粉末組合物添加，b)混合以獲得懸浮液，和c)需要時(shí)將所述懸浮液的pH調(diào)節(jié)至2到12。
15.在權(quán)利要求14的方法中使用的包含乳鏈菌肽和增稠劑的粉末組合物。
16.權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)所要求保護(hù)的水性懸浮液用于制備用于處理食物、飼料 或農(nóng)業(yè)制品的處理液體的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求4到9中任一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的懸浮 液作為食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品中的防腐劑和/或食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品上的防腐劑的用途。
18.對食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品防腐的方法，其中對所述食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品應(yīng)用根據(jù) 權(quán)利要求4到9中任一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的懸浮液。
19.生產(chǎn)固體乳鏈菌肽組合物的方法，所述方法包括對根據(jù)權(quán)利要求4到9中任一項(xiàng)的 組合物進(jìn)行干燥步驟、冷凍干燥步驟、結(jié)晶步驟或沉淀步驟。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求4到9中任一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的 懸浮液的食物、飼料或農(nóng)業(yè)制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有高抗微生物活性的液體乳鏈菌肽組合物。本發(fā)明還涉及用于制備液體乳鏈菌肽組合物的方法以及它們在食物制品中作為防腐劑的用途。
文檔編號A23L3/3463GK102123616SQ200980131530
公開日2011年7月13日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日
發(fā)明者本·魯多爾夫·翰·德, 約翰尼斯·馬丁努斯·雅各布斯·威瑟爾 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司