專利名稱：核酸提取裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸提取裝置，并且更具體地涉及一種將水凝膠柱用作支撐構(gòu)件 的核酸提取裝置。
背景技術(shù)：
最近，由于已基于人類基因組研究的結(jié)果在基因水平上對(duì)疾病的原因進(jìn)行了解 釋，對(duì)于以治療和預(yù)防疾病為目的而對(duì)生物樣本的改造和生物化學(xué)分析的需求增加。此外， 不僅用于診斷疾病，還在如新藥發(fā)現(xiàn)和研發(fā)、病毒或細(xì)菌感染的預(yù)試和法醫(yī)學(xué)等的各種領(lǐng) 域中都需要用于從生物樣本或包含細(xì)胞的樣本中提取并分析核酸的技術(shù)。當(dāng)提取核酸時(shí)，低純度的核酸抑制或干擾例如DNA印跡的雜交反應(yīng)和例如酶反應(yīng) 的化學(xué)反應(yīng)，并且核酸污染材料會(huì)溶解待測(cè)核酸并在核酸量測(cè)量中引起錯(cuò)誤。這樣的污染 材料包括例如脂肪的低分子材料、酶抑制劑、例如蛋白質(zhì)的酶、多糖和多核苷酸。為了保持高純度核酸以用于分子生物學(xué)，已研發(fā)出各種方法來(lái)解決上述問(wèn)題。用于從細(xì)胞中提取核酸的方法包括這樣的方法，即在所述方法中，通過(guò)用十二烷 基硫酸鈉(SDQ或蛋白酶K處理來(lái)溶解含有該細(xì)胞的樣本，然后用酚(penyol)將蛋白質(zhì)變 性并除去以提純核酸。然而，酚提取方法因?yàn)槠浒ê芏嗖襟E而需要很長(zhǎng)時(shí)間，并且核酸提 取效率極大地依賴于工作人員的技術(shù)。因此，最近，使用柱的試劑盒已經(jīng)成為用于降低上述問(wèn)題的核酸提取的基本工 具。此工具使用一種采用與核酸獨(dú)特地結(jié)合的二氧化硅或玻璃纖維的方法，并且所述方 法通過(guò)將細(xì)胞用促溶劑處理將其溶解并通過(guò)利用水分子和核酸分子之間的結(jié)構(gòu)互動(dòng)機(jī)制 (structural interactive mechanism)來(lái)從細(xì)胞的蛋白質(zhì)和其他材料中提純核酸。玻璃纖維或二氧化硅薄膜與細(xì)胞代謝物的結(jié)合比率低，因此可獲得相對(duì)高地濃縮 的核酸。盡管此方法與酚提取方法相比更簡(jiǎn)單，但是此方法在操作的復(fù)雜性和耗時(shí)方面有 缺點(diǎn)，因?yàn)樾枰耆コ龔?qiáng)烈阻斷例如PCR的酶反應(yīng)的促溶劑或乙醇。最近，在國(guó)際公開文本No. WO 00/21973中已公開用于通過(guò)使用濾器來(lái)直接提純 核酸的方法。在此方法中，通過(guò)將樣本通過(guò)濾器而將細(xì)胞附著在濾器上，將所附著的細(xì)胞溶 解并過(guò)濾通過(guò)所述濾器，然后將附著于所述濾器上的核酸洗滌并洗脫。但是，為了在將細(xì)胞 附著于所述濾器之后洗脫核酸，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型選擇濾器。在背景技術(shù)部分公開的上述信息僅是為了增進(jìn)對(duì)本發(fā)明背景的理解，因此其可包 含不構(gòu)成已為這個(gè)國(guó)家本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)的信息。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題為解決上述問(wèn)題，在努力提供可更加穩(wěn)定并且容易地提取核酸的提取裝置的過(guò)程 中完成了本發(fā)明。技術(shù)方案
本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置可包括一個(gè)在其一端具有一個(gè)開 放式出口的管形管、和一個(gè)位于所述管內(nèi)的并且過(guò)濾雜質(zhì)使其不包含于提取目標(biāo)材料中的 水凝膠支持構(gòu)件。所述核酸提取裝置還可包括一個(gè)外殼，所述管插入其中并與所述出口相連，并且 其一邊形成為封閉的管形。所述水凝膠支持構(gòu)件可由瓊脂糖凝膠形成，并且所述瓊脂糖凝 膠可包含至2%的瓊脂糖。另外，所述瓊脂糖凝膠可包含0. 5%至5%的瓊脂糖?？稍谒鏊z支持構(gòu)件的上表面形成在所述管的長(zhǎng)度方向延伸的注射槽，并且 所述注射槽可形成于所述水凝膠支持構(gòu)件的中央部分中。此外，可在所述管的外周形成多 個(gè)與所述水凝膠支持構(gòu)件接觸的減壓孔。所述水凝膠支持構(gòu)件可附著在所述管的內(nèi)表面， 并且所形成的水凝膠支持構(gòu)件可以為旋轉(zhuǎn)體(rotating body)形。所述核酸提取裝置從細(xì)胞中提取核酸，并且所述細(xì)胞可以是一種可以選自如下的 生物樣品動(dòng)物樣品、植物樣品或微生物樣品，或者可以是人源細(xì)胞，所述人源細(xì)胞包括血 液、血清、血漿、骨髓、尿、糞便、唾液、細(xì)胞吸出物、組織和組織來(lái)源的材料。所述核酸提取裝置可在離心分離器中提供，并且所述核酸可為DNA。此外，所述核 酸提取裝置可應(yīng)用于DNA芯片試驗(yàn)中的核酸提取，并且可應(yīng)用于即時(shí)試驗(yàn)(point-of-care test)中的核酸提取。有益效果根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，可通過(guò)使用水凝膠支持構(gòu)件作為濾器容易地提取 不含雜質(zhì)的核酸。此外，可通過(guò)使用瓊脂糖凝膠作為所述水凝膠支持構(gòu)件來(lái)獲取純的核酸。通過(guò)在所述水凝膠支持構(gòu)件上形成注射槽能提高核酸回收效率。此外，通過(guò)在管上形成減壓孔來(lái)減少對(duì)核酸的破壞時(shí)可更加容易地提取核酸。


圖1是本發(fā)明的第一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置的剖面圖。圖2是通過(guò)使用本發(fā)明的核酸提取裝置分離到的MC3T3成骨細(xì)胞的基因組DNA的 電泳照片。圖3是用于檢查MC3T3成骨細(xì)胞基因組DNA的純度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果的照 片，所述基因組DNA是通過(guò)使用本發(fā)明的核酸提取裝置分離到的。圖4是對(duì)HPV細(xì)胞的核酸進(jìn)行PCR之后的電泳結(jié)果的照片，所述HPV細(xì)胞的核酸 是通過(guò)使用本發(fā)明的第一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置提取到的。圖5是對(duì)HPV細(xì)胞的核酸進(jìn)行的核酸芯片試驗(yàn)結(jié)果的照片，所述HPV細(xì)胞的核酸 是通過(guò)使用本發(fā)明的第一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置提取到的。圖6是本發(fā)明的第二個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置的剖面圖。圖7是本發(fā)明的第三個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置的剖面圖。<附圖中指示基本元件的附圖標(biāo)記的說(shuō)明>12:外殼13 蓋14 管15 減壓孔16 水凝膠支持構(gòu)件 18 注射槽
24 出口
具體實(shí)施例方式在下文中參考附圖更充分地說(shuō)明本發(fā)明，在所述附圖中示出了本發(fā)明的示例性實(shí) 施方案。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)認(rèn)識(shí)到的，可用多種不同方式改造所描述的實(shí)施方案，全部 不背離本發(fā)明的精神或范圍。所述附圖和說(shuō)明應(yīng)被理解為本質(zhì)上是例證性的而非限制性 的。在本說(shuō)明書通篇中同樣的附圖標(biāo)記指示同樣的元件。圖1是本發(fā)明的第一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置的剖面圖。參看圖1，本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置包括一個(gè)形成所述核酸 提取裝置的外部形狀的外殼12、一個(gè)插入外殼12內(nèi)的管14、一個(gè)安裝于管14內(nèi)的水凝膠 支持構(gòu)件16和一個(gè)封蓋管14的蓋13。外殼12由內(nèi)部有空間的圓柱形管構(gòu)成，并且其下部封口。此外，外殼12的內(nèi)徑向 其底部逐漸減小，使得所提取到的核酸或酸可被收集到底部。管14被插入所述外殼內(nèi)部，并在其中形成用于容納細(xì)胞提取物的空間。向底部開 口的出口 M在管14的下部形成，使得核酸可從此穿過(guò)移至外殼。出口 M的內(nèi)徑比它的其 他部分小以僅使核酸通過(guò)而不讓蛋白質(zhì)等通過(guò)。水凝膠支持構(gòu)件16位于管14內(nèi)，并且其形狀與管14的內(nèi)部形狀相符。此處所述 形狀大致為柱形，為旋轉(zhuǎn)體。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中的水凝膠支持構(gòu)件16由可容易地形成并對(duì)人體無(wú)害 的瓊脂糖凝膠形成。但是，本發(fā)明的示例性實(shí)施方案并不局限于此，可應(yīng)用各種水凝膠。所述水凝膠支持構(gòu)件16含濃度為1.0%至2.0%的瓊脂糖，其體積可為300μ 1至 600 μ 1。在應(yīng)用離心分離方法時(shí)，當(dāng)所述水凝膠柱16中的瓊脂糖的濃度低于1. 0%時(shí)，在 離心分離過(guò)程中水凝膠柱16很容易被破壞；并且當(dāng)瓊脂糖的濃度高于2. 0%時(shí)，縫隙變得 過(guò)小而不能充分地提取核酸。當(dāng)使用壓力法或電學(xué)法時(shí)，水凝膠柱16可包含0. 5%至5. 0%的瓊脂糖。當(dāng)使用 壓力提取核酸時(shí)，水凝膠柱16中含有的瓊脂糖需要少于5. 0%以防止水凝膠柱16被輕易地 破壞。當(dāng)含有的瓊脂糖多于5. 0%時(shí)，孔的尺寸縮小使得核酸不能穿過(guò)水凝膠柱16。此外，當(dāng)使用電學(xué)方法時(shí)，孔的尺寸相對(duì)較大時(shí)有利，并且因此需要包含0. 5%或 更高的瓊脂糖。當(dāng)水凝膠柱16含有少于0.5%的瓊脂糖時(shí)，孔的尺寸變得過(guò)大，并且由于壓 力導(dǎo)致水凝膠柱16可被破壞或異質(zhì)材料(foreign material)可通過(guò)所述瓊脂糖凝膠柱被 分離。所述水凝膠是可含水分的聚合物材料，并且具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分子在其中通過(guò) 化學(xué)和物理結(jié)合作用相互連接。此外，所述水凝膠通過(guò)親水官能團(tuán)、毛細(xì)管作用和滲透壓力 含水分。因此，所述水凝膠具有較高的空氣通透性和滲透吸收性，并且適用于血液、體液和 身體組織。水凝膠支持構(gòu)件16具有親水性并且有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且因此在離心分離過(guò)程 中起到核酸濾器的作用。也就是說(shuō)，因?yàn)榘诩?xì)胞提取物中的核酸尺寸較小并且具有親 水性，它可以穿過(guò)在水凝膠支持構(gòu)件16中形成的孔并被通過(guò)出口 M排出。然而，相對(duì)較大并且非水相的液體雜質(zhì)如蛋白質(zhì)不能穿過(guò)水凝膠支持構(gòu)件16，使得它停留在管14中?，F(xiàn)在將進(jìn)一步詳細(xì)描述通過(guò)使用本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置提取 核酸的方法。首先，獲取細(xì)胞提取物。這里，所述細(xì)胞提取物是指包括通過(guò)破壞所述細(xì)胞獲取的 細(xì)胞組分的混合物。所述細(xì)胞可由動(dòng)物、植物或微生物的生物樣品形成。此外，所述細(xì)胞可以是人源細(xì) 胞，所述人源細(xì)胞包括血液、血清、血漿、骨髓、尿、糞便、唾液、細(xì)胞吸出物、組織和組織來(lái)源 的材料。所述細(xì)胞提取物可通過(guò)向裝有細(xì)胞的容器中加入溶解緩沖液制備，并且所述溶解 緩沖液可由各種市售的材料形成。此外，除了所述溶解緩沖液外，還可包含作為蛋白水解酶 的蛋白酶K或作為核糖DNA酶(ribo DNAase)的核糖核酸酶。接著，在管14中形成水凝膠支持構(gòu)件16。在這種情況下，水凝膠支持構(gòu)件16由含 有2%瓊脂糖的瓊脂糖凝膠形成。但是，瓊脂糖的濃度可根據(jù)樣品的粘度和濃度來(lái)進(jìn)行各種 改變。在將瓊脂糖加入至蒸餾水中之后，通過(guò)加熱所得混合物溶解瓊脂糖。然后，將所得 瓊脂糖水溶液加入管14，之后將管14置于室溫下來(lái)形成柱形水凝膠支持構(gòu)件16。將細(xì)胞提取物裝入其中形成有所述水凝膠支持構(gòu)件16的管14中，然后進(jìn)行離 心分離過(guò)程。在這種情況下，所述離心分離過(guò)程在微型離心分離器(micro-centrifugal separator)中以2000rpm進(jìn)行3次，每次耗時(shí)5分鐘。在離心分離過(guò)程中，DNA穿過(guò)水凝膠支持構(gòu)件16并且通過(guò)出口 M被排出至外殼 12，而不能穿過(guò)水凝膠的異質(zhì)材料如蛋白質(zhì)會(huì)留下來(lái)。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，通過(guò)使用離心分離器來(lái)提取核酸，但是本發(fā)明不 局限于此。因此，可通過(guò)使用壓力或電學(xué)方法提取核酸，并且在這種情況下，水凝膠支持構(gòu) 件16被用作濾器。所提取的核酸可用于基因組試驗(yàn)或DNA芯片試驗(yàn)。也就是說(shuō)，本發(fā)明的示例性實(shí) 施方案的核酸提取裝置可應(yīng)用于基因組試驗(yàn)或DNA芯片試驗(yàn)中的核酸提取。此外，本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置可應(yīng)用于即時(shí)試驗(yàn)(通常被稱作 POC試驗(yàn))中的核酸提取。POC試驗(yàn)是可以為在臨床環(huán)境、醫(yī)院環(huán)境或在患者家中診斷患者 的疾病而進(jìn)行的試驗(yàn)。本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的核酸提取裝置因其可用簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)提取 核酸而可便捷地使用，因此由所述便攜式提取裝置提取的核酸可容易地應(yīng)用于POC試驗(yàn)。圖2顯示了通過(guò)使用外殼12收集的DNA的電泳結(jié)果。圖2是MC3T3成骨細(xì)胞基因組DNA的電泳照片，所述基因組DNA是通過(guò)使用本發(fā) 明的核酸提取裝置分離到的。在圖2中，條帶M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1和條帶2是 MC3T3成骨細(xì)胞的基因組DNA的電泳結(jié)果，所述基因組DNA是通過(guò)使用本發(fā)明的方法獲得 的。圖3是用于檢查MC3T3成骨細(xì)胞的基因組DNA的純度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果的照 片，所述基因組DNA是通過(guò)使用本發(fā)明的核酸提取裝置分離到的。在圖3中，條帶M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶1是擴(kuò)增MC3T3成骨細(xì)胞的基因組 DNA中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PHD)后的電泳結(jié)果，所述基因組DNA是通過(guò)使用本發(fā)明的方法獲得的。條帶2和3是擴(kuò)增MC3T3成骨細(xì)胞的基因組DNA中的甘油醛_3_磷酸脫氫 酶(G3PHD)后的電泳結(jié)果，所述基因組DNA是通過(guò)使用市售基因組提取裝置獲得的。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，DNA被用作所述核酸，但是本發(fā)明并不局限于此。 也就是說(shuō)，本發(fā)明的示例性實(shí)施方案可應(yīng)用于各種核酸分離，例如RNA。進(jìn)行用于通過(guò)使用瓊脂糖凝膠支持構(gòu)件來(lái)檢測(cè)臨床樣本的DNA提取可能性和適 當(dāng)凝膠濃度水平的實(shí)驗(yàn)。為了排除PCR反應(yīng)抑制劑的影響，從使用DNA的眾多試驗(yàn)中選出包括雜交過(guò)程的試驗(yàn)。選出要對(duì)其進(jìn)行人乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA芯片試驗(yàn)的宮頸拭子樣本之一，并且 通過(guò)使用具有瓊脂糖凝膠支持構(gòu)件的核酸提取裝置對(duì)選出的樣本進(jìn)行DNA提取，并對(duì)所 獲的DNA提取物進(jìn)行HPV DNA芯片試驗(yàn)。為評(píng)價(jià)敏感性，在常規(guī)PCR試驗(yàn)后進(jìn)行電泳閱讀 (electrophoresis reading)。所述樣本為 HPV-58，將 20 μ 1 的蛋白酶 Κ、400 μ 1 的用于 HPV檢測(cè)的樣本和200μ 1的溶解緩沖液加入到其中有瓊脂糖凝膠支持構(gòu)件的管中，然后 在2000RPM/200RCF下離心分離3次，每次5分鐘。作為所述瓊脂糖支持構(gòu)件，使用體積為 0. 3ml的支持構(gòu)件和體積為0. 6ml的支持構(gòu)件。當(dāng)用電泳讀取常規(guī)PCR的電泳結(jié)果時(shí)，僅在2%瓊脂糖凝膠濃度下可讀取0. 3ml和 0. 6ml的柱的結(jié)果。同時(shí)，在即使DNA拷貝數(shù)低也能獲得結(jié)果的DNA芯片試驗(yàn)中，在0. 3ml 的支持構(gòu)件中，在瓊脂糖凝膠濃度為1%、1. 5%和2%時(shí)可以獲得準(zhǔn)確的HPV型結(jié)果，而在 0. 6ml的支持構(gòu)件中，在瓊脂糖凝膠濃度為2%時(shí)可得到準(zhǔn)確的HPV型結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，當(dāng)使用2%的瓊脂糖凝膠時(shí)，在0. 3ml和0. 6ml的支持 構(gòu)件上均可進(jìn)行用于獲取HPV型信息的常規(guī)PCR試驗(yàn)和DNA芯片試驗(yàn)。下表1顯示每個(gè)條帶的實(shí)驗(yàn)條件。
權(quán)利要求
1.一種核酸提取裝置，包括一個(gè)在其一端具有一個(gè)開放式出口的管形管；和一個(gè)位于所述管內(nèi)的并且過(guò)濾雜質(zhì)使其不包含于提取目標(biāo)材料的水凝膠支持構(gòu)件。
2.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，還包括一個(gè)外殼，所述管插入其中并與所述出口相連， 并且其一邊形成為封閉的管形。
3.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述水凝膠支持構(gòu)件由瓊脂糖凝膠形成。
4.權(quán)利要求3的核酸提取裝置，其中所述瓊脂糖凝膠包含至2%的瓊脂糖。
5.權(quán)利要求3的核酸提取裝置，其中所述瓊脂糖凝膠包含0.5%至5%的瓊脂糖。
6.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中在所述水凝膠支持構(gòu)件的上表面形成一個(gè)在所述 管的長(zhǎng)度方向延伸的注射槽。
7.權(quán)利要求6的核酸提取裝置，其中所述注射槽形成于所述水凝膠支持構(gòu)件的中央部 分中。
8.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中在所述管的外周形成多個(gè)與所述水凝膠支持構(gòu)件 接觸的減壓孔。
9.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述水凝膠支持構(gòu)件附著在所述管的內(nèi)表面。
10.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所形成的水凝膠支持構(gòu)件為旋轉(zhuǎn)體形。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置應(yīng)用于離心分離器。
12.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置從細(xì)胞中提取核酸，并且所述 細(xì)胞是生物樣本。
13.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置從細(xì)胞中提取核酸，并且所述 細(xì)胞由選自以下的一種形成動(dòng)物樣品、植物樣品和微生物樣品。
14.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置從細(xì)胞中提取核酸，并且所述 細(xì)胞是人源細(xì)胞，所述人源細(xì)胞包括血液、血清、血漿、骨髓、尿、糞便、唾液、細(xì)胞吸出物、組 織和組織來(lái)源的材料。
15.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸是DNA。
16.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置應(yīng)用于DNA芯片試驗(yàn)中的核酸 提取。
17.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置應(yīng)用于基因組試驗(yàn)中的核酸 提取。
18.權(quán)利要求1的核酸提取裝置，其中所述核酸提取裝置應(yīng)用于即時(shí)試驗(yàn)中的核酸提取。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸提取裝置，并且所述核酸提取裝置可包括一個(gè)在其一端具有開放式出口的管形管，和一個(gè)位于所述管內(nèi)的并且過(guò)濾雜質(zhì)不含提取目標(biāo)材料中的水凝膠支持構(gòu)件。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102137719SQ200980134053
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者J-M·康, 權(quán)浩澤, 林根培, 鄭鎮(zhèn)花 申請(qǐng)人:浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)