根據(jù)35U.S.C.§119，本申請要求2014年1月27日提交的美國臨時(shí)申請U.S.61/931,959的權(quán)益，以引用的方式將其整體內(nèi)容并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本文所述的技術(shù)涉及制備和分析核酸的方法。

背景技術(shù)：

相比全基因組、全外顯子組以及全轉(zhuǎn)錄組測序，下一代測序(next-generation sequencing)前的靶富集更具成本效益，因此更適于在研究發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用中廣泛實(shí)施。例如，由靶富集方法提供的高覆蓋深度(high coverage depth)能夠?qū)崿F(xiàn)較寬動(dòng)態(tài)范圍的等位基因計(jì)數(shù)(在基因表達(dá)和拷貝數(shù)評估中)以及對低頻突變的檢測(用于評價(jià)癌癥中的體細(xì)胞突變的關(guān)鍵特征)。目前用于下一代測序的富集方案的實(shí)例包括：基于雜交的捕獲分析(TruSeq Capture，Illumina；SureSelect Hybrid Capture，Agilent)和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分析(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，Ion Torrent；TruSeq擴(kuò)增子，Illumina；乳液/數(shù)字PCR，Raindance)?；陔s交的方法不僅捕獲到被捕獲探針覆蓋的靶向序列，還捕獲到了消耗測序能力的附近的脫靶堿基(near off-target bases)。此外，這些方法都比較費(fèi)時(shí)、勞動(dòng)密集、并且特異性水平較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文所公開的技術(shù)的方面涉及用于制備和分析核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，本文提供了制備用于序列分析(例如，使用下一代測序)的核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，本文所述的技術(shù)針對確定核酸的核苷酸序列的方法。在一些實(shí)施方式中，本文所公開的方法涉及在測序前對靶核酸進(jìn)行富集。

本文所公開的技術(shù)的方面涉及確定與已知的靶核苷酸序列鄰近(contiguous to)的核苷酸序列的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法涉及：(a)在雜交條件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與起始靶特異性引物接觸；(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用靶核酸分子作為模板；(c)在雜交條件下，使步驟(b)的產(chǎn)物與加尾隨機(jī)引物群接觸；(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的靶核酸分子的一部分作為模板；(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對加尾隨機(jī)引物序列和靶核酸分子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；以及(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(f)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列和含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能夠在退火溫度下特異性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物嵌套(nested)。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含與加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物包含與第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相對于第一尾引物嵌套。

在一些實(shí)施方式中，所述方法涉及：(a)在雜交條件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的靶核酸分子的部分作為模板；(c)在雜交條件下，使步驟(b)的產(chǎn)物與起始靶特異性引物接觸；(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用靶核酸分子作為模板；(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對加尾隨機(jī)引物序列和靶核酸分子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；以及(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(f)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列和含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能夠在退火溫度下特異性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含與加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物包含與第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相對于第一尾引物嵌套。

在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步涉及在起始靶特異性引物的延伸之后，使樣品和/或產(chǎn)物與RNase接觸的步驟。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物可形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，起始靶特異性引物和第一靶特異性引物相同。在一些實(shí)施方式中，在與第一測序引物相同的5’核酸序列和含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列之間，加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的條形碼(barcode)部分。

在一些實(shí)施方式中，所述方法涉及：(a)在雜交條件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的靶核酸分子的部分作為模板；(c)用第一尾引物和第一靶特異性引物對加尾隨機(jī)引物序列和靶核酸分子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；(d)用第二尾引物和第二靶特異性引物對步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；以及(e)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(d)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列、含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的中間的條形碼部分以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能夠在退火溫度下特異性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含與加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物包含與第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相對于第一尾引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，在與第一測序引物相同的5’核酸序列和含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列之間，各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含間隔區(qū)核酸序列。在特定的實(shí)施方式中，在延伸步驟之后，將未雜交的引物從反應(yīng)中移除。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物相對于第一尾引物通過至少3個(gè)核苷酸嵌套。在特定的實(shí)施方式中，第一靶特異性引物進(jìn)一步包含5’標(biāo)簽序列部分，所述5’標(biāo)簽序列部分包含基本上不與任何引物的任何其它部分互補(bǔ)或基本上不與任何引物的任何其它部分相同的具有高GC含量的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物與全長的第一測序引物相同。在特定的實(shí)施方式中，特異性地退火至已知靶標(biāo)的靶特異性引物的部分將在PCR緩沖液中于約65℃的溫度下特異性地退火。在一些實(shí)施方式中，所述樣品包含基因組DNA。在一些實(shí)施方式中，所述樣品包含RNA，且所述方法進(jìn)一步包括使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄酶方案的第一步驟。在特定的實(shí)施方式中，存在于樣品中的核酸未經(jīng)受剪切或消化。在一些實(shí)施方式中，所述樣品包含單鏈gDNA或單鏈cDNA。在特定的實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶方案包括隨機(jī)六聚體的使用。在一些實(shí)施方式中，基因重排包括已知的靶序列。在特定的實(shí)施方式中，基因重排存在于選自于由基因組DNA、RNA和cDNA所組成的組中的核酸。在一些實(shí)施方式中，基因重排包括癌基因。在特定的實(shí)施方式中，基因重排包括融合癌基因。在一些實(shí)施方式中，通過下一代測序法對核酸產(chǎn)物進(jìn)行測序。在特定的實(shí)施方式中，下一代測序法包括選自于由如下所組成的組中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大規(guī)模平行簽名測序、固相可逆染料終止物測序以及DNA納米球測序。在特定的實(shí)施方式中，第一測序引物和第二測序引物兼容所選的下一代測序法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使所述樣品或所述樣品的單獨(dú)部分與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。在特定的實(shí)施方式中，所述方法包括使包含所述樣品的單一反應(yīng)混合物與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。在一些實(shí)施方式中，多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至單獨(dú)的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。在特定的實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。在一些實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的單個(gè)基因的不同部分。在特定的實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同外顯子。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)第一靶特異性引物包含相同的5’標(biāo)簽序列部分。在特定的實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群中的各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含相同的樣品條形碼化部分。在一些實(shí)施方式中，使多種樣品各自與具有樣品條形碼化部分的單獨(dú)的加尾隨機(jī)引物群接觸；其中，加尾隨機(jī)引物群各自具有不同的樣品條形碼化部分；并且其中，在步驟(b)后將所述樣品合并(pooled)。在特定的實(shí)施方式中，各擴(kuò)增步驟包括長度為5個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，對靶特異性引物和尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使其在約61℃-72℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，對靶特異性引物和尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使其在約65℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在特定的實(shí)施方式中，靶核酸分子來自樣品，任選地所述樣品是獲得自受試者的生物樣品。在一些實(shí)施方式中，所述樣品獲得自需要治療與遺傳改變(genetic alteration)相關(guān)的疾病的受試者。在特定的實(shí)施方式中，所述疾病為癌癥。在一些實(shí)施方式中，所述樣品包括腫瘤細(xì)胞群。在特定的實(shí)施方式中，所述樣品是腫瘤活檢物(biopsy)。在一些實(shí)施方式中，所述癌癥為肺癌。在特定的實(shí)施方式中，與疾病相關(guān)的基因包含已知的靶序列。在一些實(shí)施方式中，樣品中的基因重排產(chǎn)物包含已知的靶序列。在特定的實(shí)施方式中，基因重排產(chǎn)物是癌基因。

本文所公開的技術(shù)的方面涉及制備用于分析的核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法涉及：(a)在促進(jìn)模板特異性雜交和靶特異性引物的延伸的條件下，使包含靶核酸的第一鏈的核酸模板與包含靶特異性雜交序列的互補(bǔ)靶特異性引物接觸；以及(b)在促進(jìn)模板特異性雜交和多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸的條件下，使包含與靶核酸的第一鏈互補(bǔ)的第二鏈的核酸模板與共享如下共同序列的多個(gè)不同引物接觸，所述共同序列為不同雜交序列的5’端，其中，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物同時(shí)包含具有靶特異性引物的特征的序列和具有多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的特征的序列。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是核糖核酸。在特定的實(shí)施方式中，靶核酸是脫氧核糖核酸。在一些實(shí)施方式中，順序進(jìn)行步驟(a)和步驟(b)。在特定的實(shí)施方式中，步驟(a)中的核酸模板包含從步驟(b)中的多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，步驟(b)中的核酸模板包含從步驟(a)中的靶特異性引物的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方式中，靶核酸是編碼自包含基因重排的染色體片段的信使RNA。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是包含基因重排的一部分的染色體片段。在特定的實(shí)施方式中，基因重排是倒位、缺失或易位。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步涉及對延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。在特定的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步涉及在雜交發(fā)生在延伸產(chǎn)物和固定的寡核苷酸之間的條件下，使延伸產(chǎn)物或擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物與固定的寡核苷酸接觸。在特定的實(shí)施方式中，靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的側(cè)翼部分。在一些實(shí)施方式中，不同的雜交序列與側(cè)翼部分互補(bǔ)。在特定的實(shí)施方式中，靶特異性雜交序列與靶部分互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，靶特異性引物進(jìn)一步包含：靶特異性雜交序列的5’端；索引序列(index sequence)、條形碼序列和接頭序列中的至少一個(gè)。在特定實(shí)施方式中，共同序列包含索引序列、條形碼序列和接頭序列中的至少一個(gè)。在一些實(shí)施方式中，接頭序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接頭序列。

附圖說明

圖1A和圖1B描述了如本文所述的用于對側(cè)翼有3’未知融合伴侶(fusion partner)的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測序的工作流程的非限制性實(shí)施方式。

圖2A和圖2B描述了如本文所述的用于對側(cè)翼有5’未知融合伴侶的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測序的工作流程的非限制性實(shí)施方式。

圖3描述了如本文所述的使用包含發(fā)夾的寡核苷酸對側(cè)翼有3’未知融合伴侶的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測序的工作流程的非限制性實(shí)施方式。

具體實(shí)施方式

本文所公開的技術(shù)的方面涉及用于制備和分析核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法用于確定與已知的靶核苷酸序列鄰近(鄰接)的未知核苷酸序列。傳統(tǒng)測序方法隨機(jī)地生成序列信息(例如，“鳥槍”測序)，或生成用于設(shè)計(jì)引物的兩個(gè)已知序列間的序列信息。相比之下，在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法使得能夠以高特異性水平和高靈敏度水平確定已知序列的單個(gè)區(qū)域的上游或下游的核苷酸序列(例如，測序)。因此，在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法用于確定由基因排列(例如，引起癌癥或其它病癥的重排)產(chǎn)生的融合物(例如，融合mRNA)的序列。在一些實(shí)施方式中，本文提供的制備用于分析(例如，用于測序)的核酸的方法涉及：使用靶向靶核酸的已知序列(例如，第一基因的已知序列)的靶特異性引物的第一輪延伸，隨后為涉及使用加尾引物(例如，加尾隨機(jī)引物)的異源性群的第二輪延伸，所述加尾引物的異源性群包括具有與鄰接至靶核酸中的已知序列的未知序列互補(bǔ)的雜交序列的加尾引物。在一些實(shí)施方式中，加尾引物的尾區(qū)域包含促進(jìn)靶核酸的多重?cái)U(kuò)增和富集的條形碼序列或索引序列。

在本文公開的技術(shù)的一些方面，提供了制備用于分析的核酸的方法，所述方法涉及：(a)在促進(jìn)模板特異性雜交和靶特異性引物的延伸的條件下，使包含靶核酸的第一鏈的核酸模板與包含靶特異性雜交序列的互補(bǔ)的靶特異性引物接觸；以及(b)在促進(jìn)模板特異性雜交和多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸的條件下，使包含與靶核酸的第一鏈互補(bǔ)的第二鏈的核酸模板與共享如下共同序列的多個(gè)不同引物接觸，所述共同序列為不同雜交序列的5’端，其中，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物同時(shí)包含具有靶特異性引物特征的序列和具有多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的特征的序列。在一些實(shí)施方式中，順序進(jìn)行上述步驟(a)和步驟(b)。在一些實(shí)施方式中，步驟(a)中的核酸模板包含從步驟(b)中的多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，步驟(b)中的核酸模板包含從步驟(a)中的靶特異性引物的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，提供了用于制備核酸的方法，所述核酸具有鄰接區(qū)域(例如，未知序列的鄰接區(qū)域)的5’端的靶區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可使用一輪或多輪PCR來完成。

例如，圖1A-圖1B示出了對靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的示例性方法的示意圖，所述靶核酸具有鄰接區(qū)域的5’端的已知靶區(qū)域(例如，出于對鄰接區(qū)域進(jìn)行測序的目的)。在步驟101，在樣品中獲得或提供起始RNA，并將其用作模板。將RNA模板暴露至包含共同序列的多個(gè)加尾引物(例如，加尾隨機(jī)引物)，所述共同序列為不同雜交序列的5’端并在全部加尾引物群間共享。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)引物雜交至RNA分子，并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA鏈。在步驟102中，對未雜交的寡核苷酸進(jìn)行降解(例如，酶促降解，如通過核酸外切酶降解)。在步驟102中，從互補(bǔ)的DNA鏈對RNA模板進(jìn)行降解。

在一些實(shí)施方式中，提供了加尾引物，所述加尾引物雜交至RNA分子的多聚A尾。在一些實(shí)施方式中，提供了引物序列，所述引物序列雜交至包含多聚dT(例如，定位于3’端的2個(gè)dT、3個(gè)dT、4個(gè)dT、5個(gè)dT、6個(gè)dT、7個(gè)dT、8個(gè)dT、9個(gè)dT、10個(gè)dT或以上的延展段(stretch))的多聚A尾。在一些實(shí)施方式中，提供了多個(gè)加尾引物，各加尾引物進(jìn)一步包含條形碼序列或索引序列。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在本文公開的方法中RNA模板可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉斫到?，包括例如通過酶促降解(例如，使用RNaseH、尿嘧啶糖基化酶等)、通過水解(例如，將RNA暴露至相對高的pH條件(例如，pH 10、pH 11、pH 12))等。在一些實(shí)施方式中，通過暴露至相對高的pH來水解RNA是有利的，因?yàn)槠湎鄬Ρ阋?相較于一些其它的方法，如一些酶促方法)，而且因?yàn)槠渫瑫r(shí)破壞RNA和DNA:RNA雜交體。在一些實(shí)施方式中，在相對高的溫度下(例如，高于60℃(例如，60℃至95℃)的溫度)，通過暴露至相對高的pH條件而引起的水解來降解RNA。在一些實(shí)施方式中，使用相對高的溫度是有利的，因?yàn)槠錈岫仁乖谙戎苽洳襟E中使用的酶(例如，RT酶)失活。在一些實(shí)施方式中，起始核酸可以是在樣品中獲得或提供并被用作模板的DNA。在此類實(shí)施方式中，可將步驟101和步驟102省略。

在步驟103中，通過一個(gè)或多個(gè)起始靶特異性引物來接觸通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA分子，所述起始靶特異性引物可與第一靶特異性引物相同或不同。在步驟104中，起始靶特異性引物雜交至靶核酸(“靶序列”)的一部分啟動(dòng)了使用DNA分子作為模板以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA鏈的延伸反應(yīng)。在步驟105中純化延伸產(chǎn)物。然而，在一些實(shí)施方式中，可例如通過PCR對在步驟104中產(chǎn)生的DNA進(jìn)行直接擴(kuò)增，無需純化。

在步驟106中，通過第一靶特異性引物和第一尾引物來接觸DNA分子。第一靶特異性引物雜交至靶核酸的一部分。在一些實(shí)施方式中，可將不同的第一靶特異性引物的池(pool)用于雜交至靶核酸的不同部分。在一些實(shí)施方式中，使用不同的靶特異性引物可以是有利的，因?yàn)檫@使得能夠產(chǎn)生相對于靶核酸而言具有重疊但交錯(cuò)的序列的不同的延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，可對不同的延伸產(chǎn)物進(jìn)行測序，以產(chǎn)生重疊的序列讀取段(sequence reads)。在一些實(shí)施方式中，可對重疊序列讀取段進(jìn)行評估，以評價(jià)序列信息的準(zhǔn)確性、核酸擴(kuò)增的保真度和/或檢測突變(例如，檢測染色體重排的位置(例如，融合斷點(diǎn)))方面的增高的置信度。在一些實(shí)施方式中，可將不同的第一靶特異性引物的池用于雜交至存在于樣品中的不同的靶核酸的不同部分。在一些實(shí)施方式中，使用不同的靶特異性引物的池是有利的，因?yàn)檫@促進(jìn)了不同的靶核酸的平行加工(例如，擴(kuò)增)和分析。在一些實(shí)施方式中，使用了多至2個(gè)、多至3個(gè)、多至4個(gè)、多至5個(gè)、多至6個(gè)、多至7個(gè)、多至8個(gè)、多至9個(gè)、多至10個(gè)、多至15個(gè)、多至20個(gè)、多至100個(gè)或更多的不同的第一靶特異性引物的池。在一些實(shí)施方式中，使用了2個(gè)-5個(gè)、2個(gè)-10個(gè)、5個(gè)-10個(gè)、5個(gè)-15個(gè)、10個(gè)-15個(gè)、10個(gè)-20個(gè)、10個(gè)-100個(gè)、50個(gè)-100個(gè)或更多的不同的第一靶特異性引物的池。

在圖1A和圖1B中，第一尾引物雜交至由步驟101的加尾引物的尾部分提供的DNA分子的至少一部分。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物雜交至由步驟101的一個(gè)或多個(gè)引物的尾提供的共同序列。在一些實(shí)施方式中，在步驟106中使用嵌套的靶特異性引物(相對于步驟103的靶特異性引物嵌套)。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物可包含例如雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在步驟107中，第一靶特異性引物和第一尾核酸分子的雜交使得產(chǎn)物能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，在步驟108中純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，對步驟103的ssDNA產(chǎn)物直接進(jìn)行擴(kuò)增(例如，通過PCR)，而不進(jìn)行步驟104的延伸反應(yīng)和步驟105的純化。類似地，在本文所公開的任何方法的一些實(shí)施方式中，可在純化和/或PCR前對ssDNA產(chǎn)物直接進(jìn)行擴(kuò)增(例如，通過PCR)以產(chǎn)生dsDNA，而不進(jìn)行延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，可在PCR期間加入第一尾引物和第二尾引物。在一些實(shí)施方式中，將引物(例如，第一尾引物、靶特異性引物)用于PCR或延伸反應(yīng)中，然后使用單鏈核酸酶將過量的引物移除。隨后數(shù)輪的PCR或延伸可使用不同的引物(例如，第二尾引物或嵌套引物或第二靶特異性引物)進(jìn)行，以將不同序列加入到所得到的產(chǎn)物中。

在一些實(shí)施方式中，可將核酸外切酶(例如，ExoI)用于降解單鏈DNA。在一些實(shí)施方式中，將核酸外切酶用于降解ssDNA，并根據(jù)步驟109_A-B和步驟110_A-B對擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行加工，無需在步驟108的純化。

在圖1A中，在步驟109_A，使步驟107的擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物(例如，在步驟108中純化的)與第二靶特異性引物和第二尾引物接觸。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物雜交至存在于第一靶特異性引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物的嵌套可提高雜交反應(yīng)的特異性。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含例如條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在步驟110_A中，將步驟107的擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物(例如，在步驟108中純化的)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中，通過第二靶特異性引物和第二尾引物啟動(dòng)延伸。在一些實(shí)施方式中，對來自步驟107的擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，使用第三引物，所述第三引物雜交至第二靶特異性引物中的共同尾并添加了諸如條形碼序列、接頭等的附加序列。

在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含靶特異性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含條形碼序列、索引序列或接頭序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物雜交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在此類實(shí)施方式中，對來自步驟106的產(chǎn)物的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)中，第二靶特異性引物和第二尾引物的雜交使得靶核酸分子的一部分能夠指數(shù)擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，步驟106的第一靶特異性引物可與第二靶特異性引物一起使用。在此類實(shí)施方式中，第一靶特異性引物和第二靶特異性引物的雜交使得產(chǎn)物能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，可將步驟108-步驟110省略。在反應(yīng)111中將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，并準(zhǔn)備用于分析。例如，可對在步驟111中純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序(例如，使用下一代測序平臺(tái))。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物或第二靶特異性引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。

在一些實(shí)施方式中，如圖1B中所描述的，在步驟109_B中，使步驟107的DNA產(chǎn)物(例如，在步驟108中純化的)與第二靶特異性引物和第二尾引物接觸。通過與第二靶特異性引物的共同序列雜交的附加引物(例如，具有3’端測序接頭序列/索引序列的引物)，對第二靶特異性引物進(jìn)行進(jìn)一步接觸。在一些實(shí)施方式中，附加引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，附加引物是通用的測序接頭引物/索引引物。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物可相對于步驟107中使用的靶特異性引物嵌套。在步驟110_B中，通過PCR對步驟107的DNA產(chǎn)物(例如，在步驟108中純化的)進(jìn)行擴(kuò)增，其中，通過第二靶特異性引物和第二尾引物啟動(dòng)延伸。在PCR反應(yīng)中，第二靶特異性引物、附加引物以及第二尾引物的雜交使得靶核酸分子的一部分能夠指數(shù)擴(kuò)增。在此類實(shí)施方式中，對來自步驟108的擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，步驟106的第一尾引物可與第二靶特異性引物一起使用。在此類實(shí)施方式中，第一尾引物和第二靶特異性引物的雜交使得產(chǎn)物能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增，任選地具有與第二靶特異性引物的共同序列雜交的附加引物(例如，具有3’端測序接頭序列/索引序列的引物)。在一些實(shí)施方式中，可將步驟108-步驟110省略。

將產(chǎn)物在反應(yīng)111中純化，并準(zhǔn)備用于分析。例如，可對在步驟111中純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序(例如，使用下一代測序平臺(tái))。

在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟101-步驟104、步驟106-步驟107以及步驟109-步驟110，無需任何間插的純化步驟。在一些實(shí)施方式中，步驟101-步驟104、步驟106-步驟107以及步驟109-步驟110中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟101-步驟104。在一些實(shí)施方式中，步驟101-步驟104中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟106-步驟107。在一些實(shí)施方式中，步驟106-步驟107中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟109_A-步驟110_A或步驟109_B-步驟110_B。在一些實(shí)施方式中，步驟109_A-步驟110_A或步驟109_B-步驟110_B中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。

在一些實(shí)施方式中，提供了用于制備核酸的方法，所述核酸具有鄰接區(qū)域(例如，未知序列內(nèi)含物的鄰接區(qū)域)的3’端的靶區(qū)域。例如，圖2示出了對靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測序的示例性方法的示意圖，所述靶核酸具有鄰接區(qū)域的3’端的已知靶區(qū)域。在圖2A-圖2B中，在樣品中獲得或提供起始RNA(例如，融合mRNA)，并將其用作處理方法的模板。在步驟201，將RNA模板暴露至一個(gè)或多個(gè)起始靶特異性引物，所述起始靶特異性引物雜交至一個(gè)或多個(gè)靶核苷酸序列并起到啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的作用，從而使用起始RNA作為模板產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA分子。在一些實(shí)施方式中，起始靶特異性引物雜交至RNA模板的多聚A尾。在一些實(shí)施方式中，雜交至多聚A尾的引物序列包含多聚dT(例如，定位于3’端的2個(gè)dT、3個(gè)dT、4個(gè)dT、5個(gè)dT、6個(gè)dT、7個(gè)dT、8個(gè)dT、9個(gè)dT、10個(gè)dT或以上的延展段)。在步驟202中，對未雜交的引物進(jìn)行降解(例如酶促降解，如通過核酸外切酶降解)。在步驟202中，從互補(bǔ)的DNA鏈對RNA模板進(jìn)行降解(例如酶促降解，如通過RNaseH降解)。

在步驟203中，通過加尾引物(例如，加尾隨機(jī)引物)的異源性群對通過逆轉(zhuǎn)錄生成的DNA分子進(jìn)行接觸。在一些實(shí)施方式中，各加尾引物的尾部分是在加尾引物群的全部引物之間相同的共享序列或共同序列。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)引物包含與靶核酸模板互補(bǔ)并雜交至靶核酸模板的雜交序列。在步驟204中，將與模板核酸雜交的加尾引物在模板依賴性延伸反應(yīng)中延伸，以產(chǎn)生加入加尾引物序列和模板序列的互補(bǔ)的DNA鏈。在步驟205中將所得到的雙鏈DNA產(chǎn)物純化。

在步驟206中，使在步驟205中純化的DNA產(chǎn)物與第一靶特異性引物和第一尾引物接觸。第一靶特異性引物雜交至DNA的靶序列(區(qū)域)。第一尾引物雜交至具有步驟203的加尾引物的尾特征的DNA分子的一部分。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物雜交至由步驟203的一個(gè)或多個(gè)引物的尾提供的共同序列。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含條形碼序列或索引序列。在步驟207中，第一靶特異性引物和第一尾引物的雜交促進(jìn)了靶核酸分子的一部分在擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR反應(yīng))中的指數(shù)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在步驟208中將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方式中，略過在步驟208中的純化。例如，在一些實(shí)施方式，將引物(例如，第二靶特異性引物和第二尾引物)用于PCR或延伸反應(yīng)中，然后使用單鏈DNA核酸酶將過量的引物移除。隨后數(shù)輪的PCR或延伸可使用不同的引物進(jìn)行，以將不同的序列加入到所得到的產(chǎn)物中。

在一些實(shí)施方式中，如在圖2A中的步驟209_A所描述的，使步驟207中產(chǎn)生的DNA分子(例如，在步驟208中純化的)與第二靶特異性引物和第二尾引物接觸。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物相對于步驟207中所使用的靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，對來自步驟209_A的產(chǎn)物的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含靶特異性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含條形碼序列、索引序列或接頭序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物雜交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在一些實(shí)施方式中，對來自步驟209_A的產(chǎn)物的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，步驟206的第一尾引物可與第二靶特異性引物一起使用。在此類實(shí)施方式中，第一尾引物和第二靶特異性引物的雜交使得產(chǎn)物能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增。在此類實(shí)施方式中，可將步驟208-步驟210省略。

在一些實(shí)施方式中，如在圖2B中的步驟209_B所描述的，使在步驟207中產(chǎn)生的DNA分子(例如，在步驟208中純化的)與第二靶特異性引物和第二尾引物接觸，其中，第二靶特異性引物雜交至存在于第一靶特異性引物序列的3’端的模板DNA分子中的靶序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在一些實(shí)施方式中，對來自步驟209_B的產(chǎn)物的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，通過附加引物(例如，具有3’端測序接頭序列/索引序列的引物)對第二靶特異性引物進(jìn)行進(jìn)一步接觸，所述附加引物與第二靶特異性引物的共同序列雜交。在一些實(shí)施方式中，附加引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，附加引物是通用的測序接頭引物/索引引物。在此類實(shí)施方式中，第二靶特異性引物、附加引物以及第二尾引物的雜交使得靶核酸分子的一部分能夠在PCR反應(yīng)中指數(shù)擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含靶特異性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含條形碼序列、索引序列或接頭序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物雜交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在一些實(shí)施方式中，對來自步驟209_B的產(chǎn)物的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，第二尾引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在步驟210中，第二靶特異性引物和第二尾引物的雜交促進(jìn)了靶核酸分子的一部分在擴(kuò)增反應(yīng)中(例如，PCR反應(yīng))指數(shù)擴(kuò)增。將步驟210的擴(kuò)增產(chǎn)物在反應(yīng)211中純化，并準(zhǔn)備用于分析。例如，可對在步驟211中純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序(例如，使用下一代測序平臺(tái))。

在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟201-步驟204。在一些實(shí)施方式中，步驟201-步驟204中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟206-步驟207。在一些實(shí)施方式中，步驟206-步驟207中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟209_A-步驟210或步驟209_B-步驟210。在一些實(shí)施方式中，步驟209_A-步驟210或步驟209_B-步驟210中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法涉及使用隨機(jī)序列作為分子條形碼。在一些實(shí)施方式中，將分子條形碼構(gòu)建到引物中(例如，RT引物、靶特異性引物、延伸序列引物)，從而使得通過引物產(chǎn)生的個(gè)體分子各自獲得獨(dú)特的條形碼標(biāo)簽。因此，在一些實(shí)施方式中，分子條形碼標(biāo)簽使得能夠確定測序分子是否獨(dú)特。在一些實(shí)施方式中，分子條形碼可用于消除測序錯(cuò)誤、提高融合或其它突變所需要的置信度，并提高檢測限。

在一些實(shí)施方式中，提供了使用包含發(fā)夾的寡核苷酸來制備核酸的方法，所述核酸具有鄰接區(qū)域(例如，未知序列的鄰接區(qū)域)的5’端的靶區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，寡核苷酸可具有非發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如，寡核苷酸可以是線性的。例如，圖3示出了用于擴(kuò)增靶核酸的示例性方法的示意圖，所述靶核酸具有鄰接區(qū)域的5’端的已知靶區(qū)域(出于對鄰接區(qū)域進(jìn)行測序的目的)。在步驟301，在樣品中獲得或提供起始RNA，并將其用作處理方法的模板。將RNA模板暴露至包含發(fā)夾序列的多個(gè)發(fā)夾引物(例如，具有發(fā)夾尾的隨機(jī)引物)，所述發(fā)夾序列是不同的雜交序列的5’端并在全部引物群之間共享。發(fā)夾序列包含位于分子條形碼序列(MBC)側(cè)翼的兩個(gè)互補(bǔ)的共同序列?；パa(bǔ)的共同序列堿基配對形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)并保護(hù)MBC序列。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)引物處于另一結(jié)構(gòu)(非發(fā)夾結(jié)構(gòu))中，并包含位于分子條形碼序列(MBC)側(cè)翼的兩個(gè)互補(bǔ)的共同序列。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)引物雜交至RNA分子并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA鏈。在一些實(shí)施方式中，引物雜交至RNA分子的多聚A尾。在一些實(shí)施方式中，雜交至多聚A尾的引物序列包含多聚dT(例如，定位于3’端的2個(gè)dT、3個(gè)dT、4個(gè)dT、5個(gè)dT、6個(gè)dT、7個(gè)dT、8個(gè)dT、9個(gè)dT、10個(gè)dT或以上的延展段)。在步驟302中，對任何未雜交的寡核苷酸進(jìn)行酶促降解(例如，通過核酸外切酶降解)。同樣，在步驟302中，從互補(bǔ)的DNA鏈對RNA模板進(jìn)行酶促降解(例如，通過RNaseH降解)。

在步驟303中，通過一個(gè)或多個(gè)起始靶特異性引物對通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA分子進(jìn)行接觸，所述起始靶特異性引物可與第一靶特異性引物相同或不同。在步驟304中，第一靶特異性引物雜交至靶核酸引物的一部分啟動(dòng)了如下延伸反應(yīng)，所述延伸反應(yīng)使用DNA分子作為模板以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA鏈。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)的DNA鏈的合成可降低或消除互補(bǔ)的共同序列的發(fā)夾形成。在步驟305中將延伸產(chǎn)物純化。

在步驟306中，通過第一靶特異性引物和加尾引物對DNA分子進(jìn)行接觸。第一靶特異性引物雜交至靶核酸的一部分。第一尾引物雜交至通過在發(fā)夾形成步驟301中涉及的共同序列提供的DNA分子的一部分。在一些實(shí)施方式中，在步驟306中使用嵌套的靶特異性引物(例如，相對于步驟303的靶特異性引物嵌套)。在一些實(shí)施方式中，第一加尾引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含例如條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。在步驟307中，各第一靶特異性引物和加尾引物的雜交使得靶核酸分子的一部分能夠在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，在步驟308中將擴(kuò)增產(chǎn)物純化。

在步驟309中，使擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物(例如，在步驟308中純化的擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物)與第二靶特異性引物和共同序列引物接觸。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物雜交至存在于第一靶特異性引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，從而使所述反應(yīng)被嵌套。在一些實(shí)施方式中，共同序列引物與在步驟306中由第一尾引物所提供的序列雜交。在一些實(shí)施方式中，在步驟310中，通過PCR對在步驟308中純化的DNA產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，其中，所述延伸通過第二靶特異性引物和共同序列引物啟動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，可對來自步驟308的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物包含靶特異性序列的5’端的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含條形碼序列、索引序列或接頭序列。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物雜交至存在于第一尾引物序列的3’端的模板DNA分子中的序列，以便使所述反應(yīng)被嵌套。在此類實(shí)施方式中，對來自步驟308的產(chǎn)物的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，共同序列引物可包含雜交序列的5’端的附加序列，所述附加序列可包含條形碼序列、索引序列、接頭序列或測序引物位點(diǎn)。第二靶特異性引物和共同序列引物的雜交使得靶核酸分子的一部分能夠在PCR反應(yīng)中指數(shù)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，在反應(yīng)311中將用于分析的產(chǎn)物純化。例如，可對在步驟311中純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序(例如，使用下一代測序平臺(tái))。

在一些實(shí)施方式中，在步驟301-步驟311中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟301-步驟304、步驟306-步驟307以及步驟309-步驟310，無需任何間插的純化步驟。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟301-步驟304。在一些實(shí)施方式中，在步驟301-步驟304中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟306-步驟307。在一些實(shí)施方式中，在步驟306-步驟307中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。在一些實(shí)施方式中，在單個(gè)反應(yīng)管中接連進(jìn)行步驟309-步驟310。在一些實(shí)施方式中，在步驟309-步驟310中所涉及的全部組份在反應(yīng)開始時(shí)并在整個(gè)反應(yīng)中存在。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了涉及確定與已知的靶核苷酸序列鄰近(鄰接)的核苷酸序列的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括在合適的雜交條件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與起始靶特異性引物接觸。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將靶核酸分子保持在促進(jìn)雜交的起始靶特異性引物延伸(例如，使用靶核酸分子作為模板)的條件下，從而產(chǎn)生第一延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在合適的雜交條件下，使延伸產(chǎn)物與加尾隨機(jī)引物群接觸。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將延伸產(chǎn)物保持在促進(jìn)雜交的加尾隨機(jī)引物延伸(使用雜交位點(diǎn)下游的靶核酸分子的部分作為模板)的條件下，從而產(chǎn)生第二延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括用第一尾引物和第一靶特異性引物對靶核酸分子的一部分和加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而產(chǎn)生第一擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括用第二尾引物和第二靶特異性引物對擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增，從而產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。

在一些實(shí)施方式中，所述方法中使用的一個(gè)或多個(gè)靶特異性引物可相對于一個(gè)或多個(gè)其它的靶特異性引物嵌套。例如，在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物在第一靶特異性引物內(nèi)部。在一些實(shí)施方式中，靶特異性引物相同。在一些實(shí)施方式中，靶特異性引物相對于靶互補(bǔ)物嵌套但重疊。在一些實(shí)施方式中，靶特異性引物嵌套且非重疊。在一些實(shí)施方式中，在相同或不同的擴(kuò)增步驟中使用相同和嵌套的靶特異性引物的組合。在一些實(shí)施方式中，引物的嵌套增加了靶特異性。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用第一測序引物和第二測序引物對第二擴(kuò)增子進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群包括如下單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有5’核苷酸序列(與第一測序引物相同)和包含隨機(jī)核苷酸(例如，約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸)的3’核苷酸。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物包含能夠在適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认绿禺愋缘赝嘶鹬涟泻怂岬囊阎塑账嵝蛄械暮怂嵝蛄?。在一些?shí)施方式中，第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至第一擴(kuò)增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含與加尾隨機(jī)引物的尾的共同序列相同的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物上的共同序列與第一尾引物上的共同序列的精確匹配。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物包含與第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相對于第一尾引物嵌套。

本文所使用的術(shù)語“靶核酸”是指感興趣的核酸分子(例如，待分析的核酸)。在一些實(shí)施方式中，靶核酸同時(shí)包含靶核苷酸序列(例如，已知或預(yù)先確定的核苷酸序列)和待確定的鄰接的核苷酸序列(可將其稱作未知序列)。靶核酸可具有任何適當(dāng)?shù)拈L度。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是雙鏈的。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是DNA。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是基因組DNA或染色體DNA(gDNA)。在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以是互補(bǔ)的DNA(cDNA)。在一些實(shí)施方式中，靶核酸是單鏈的。在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以是RNA，例如mRNA、rRNA、tRNA、長鏈非編碼RNA、微小RNA。

本文所使用的術(shù)語“已知的靶核苷酸序列”是指其序列(例如，核酸的核苷酸堿基的種類(identity)和順序)是已知的靶核酸的一部分。例如，在一些實(shí)施方式中，已知的靶核苷酸序列是已知的核酸的核苷酸序列或在對核酸的鄰接的未知序列進(jìn)行綜合分析(interrogation)之前已測定的核酸的核苷酸序列。已知的靶核苷酸序列可具有任何適當(dāng)?shù)拈L度。

在一些實(shí)施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)的長度為10個(gè)以上的核苷酸、30個(gè)以上的核苷酸、40個(gè)以上的核苷酸、50個(gè)以上的核苷酸、100個(gè)以上的核苷酸、200個(gè)以上的核苷酸、300個(gè)以上的核苷酸、400個(gè)以上的核苷酸、500個(gè)以上的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)的長度范圍為10-100個(gè)核苷酸、10-500個(gè)核苷酸、10-1000個(gè)核苷酸、100-500個(gè)核苷酸、100-1000個(gè)核苷酸、500-1000個(gè)核苷酸、500-5000個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于確定核酸的鄰近(或鄰接)部分的序列的方法。本文所使用的術(shù)語“與…鄰近的核苷酸序列”是指為緊接另一核苷酸序列(例如，已知的核苷酸序列)的上游或下游的核酸分子(例如，靶核酸)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列可具有任何適當(dāng)?shù)拈L度。在一些實(shí)施方式中，與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列包含1kb以下的核苷酸序列，例如1kb以下的核苷酸序列、750bp以下的核苷酸序列、500bp以下的核苷酸序列、400bp以下的核苷酸序列、300bp以下的核苷酸序列、200bp以下的核苷酸序列、100bp以下的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，在樣品包含含有已知的靶核苷酸序列的不同的靶核酸(例如，已知的靶核苷酸序列在其基因組中、或在單獨(dú)的非全同染色體上出現(xiàn)多次的細(xì)胞)的情況中，可存在含有“與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列”的多個(gè)序列。本文所使用的術(shù)語“確定核苷酸序列”是指確定核酸的核苷酸堿基的種類和相對位置。

在本文公開的方法的一些實(shí)施方式中，將一個(gè)或多個(gè)加尾隨機(jī)引物雜交至核酸模板(例如，包含靶核酸鏈的模板)。在一些實(shí)施方式中，靶核酸存在于或獲得自包含多種核酸的樣品，所述核酸的一種或多種大多不包含靶核酸。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)引物(例如，一個(gè)或多個(gè)加尾隨機(jī)引物)基本上雜交至樣品中的所有核酸。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)引物(例如，一個(gè)或多個(gè)加尾隨機(jī)引物)雜交至包含靶核酸的核酸并雜交至不包含靶核苷酸序列的核酸。

本文公開的一些方法的方面涉及使核酸模板與共享如下共同序列的多種不同引物接觸，所述共同序列為不同的雜交序列的5’端(或上游)。在一些實(shí)施方式中，可將多種不同引物稱為不同引物群。在一些實(shí)施方式中，可將共同序列稱為尾，就這方面而言，將引物稱為“加尾引物”。在一些實(shí)施方式中，群的不同的雜交序列包含在群中隨機(jī)或偽隨機(jī)出現(xiàn)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，在群中隨機(jī)出現(xiàn)的核苷酸序列不包含可識(shí)別的規(guī)律，以便對于群中的各序列的各核苷酸而言，核苷酸包含與A、T、G或C互補(bǔ)的堿基的可能性相同。在此類實(shí)施方式中，應(yīng)當(dāng)理解的是包含與A、T、G或C互補(bǔ)的堿基的各核苷酸可以是天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸。

本文使用的“共同序列”或“共享的序列”是指存在于核酸群的各核酸中的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，共同序列的長度范圍為約4個(gè)-75個(gè)、4個(gè)-50個(gè)、4個(gè)-30個(gè)或4個(gè)-20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，共同序列的長度為4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、51個(gè)、52個(gè)、53個(gè)、54個(gè)、55個(gè)、56個(gè)、57個(gè)、58個(gè)、59個(gè)、60個(gè)、61個(gè)、62個(gè)、63個(gè)、64個(gè)、65個(gè)、66個(gè)、67個(gè)、68個(gè)、69個(gè)、70個(gè)、71個(gè)、72個(gè)、73個(gè)、74個(gè)或75個(gè)核苷酸。

本文所使用的術(shù)語“加尾隨機(jī)引物”是指具有5’核苷酸序列(例如，與第一測序引物相同或互補(bǔ)的5’核苷酸序列)和3’核酸序列的單鏈核酸分子，其中，3’核苷酸包含隨機(jī)核苷酸(例如，約3個(gè)-約15個(gè)隨機(jī)核苷酸、約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸)。在一些實(shí)施方式中，包含隨機(jī)核苷酸的3’核苷酸序列的長度為至少6個(gè)核苷酸，例如，長度為6個(gè)核苷酸以上、7個(gè)核苷酸以上、8個(gè)核苷酸以上、9個(gè)核苷酸以上、10個(gè)核苷酸以上、11個(gè)核苷酸以上、12個(gè)核苷酸以上、13個(gè)核苷酸以上、14個(gè)核苷酸以上、15個(gè)核苷酸以上、20個(gè)核苷酸以上、25個(gè)核苷酸以上。在一些實(shí)施方式中，包含隨機(jī)核苷酸的3’核苷酸序列的長度為3個(gè)-6個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-9個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-12個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-9個(gè)核苷酸、長度為6個(gè)-12個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-25個(gè)核苷酸、長度為6個(gè)-15個(gè)核苷酸或長度為6個(gè)-25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，在5’核苷酸序列和包含約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核苷酸序列之間，加尾隨機(jī)引物可進(jìn)一步包含間隔物。在一些實(shí)施方式中，所述間隔物是分子條形碼，例如，獨(dú)立地給模板核酸(例如，模板RNA)加標(biāo)簽的分子條形碼。在一些實(shí)施方式中，所述間隔物的長度可為3個(gè)-6個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-12個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-25個(gè)核苷酸、長度為3個(gè)-45個(gè)核苷酸、長度為6個(gè)-12個(gè)核苷酸、長度為8個(gè)-16個(gè)核苷酸、長度為6個(gè)-25個(gè)核苷酸或長度為6個(gè)-45個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，對于引物群而言，所述間隔物由隨機(jī)核苷酸組成(例如，NNNNNNNNN，其中各個(gè)N獨(dú)立地選自A、G、C和T)。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)的兩個(gè)共同區(qū)域位于所述間隔物(例如，分子條形碼(MBC))的側(cè)翼。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)的共同區(qū)域堿基配對形成具有環(huán)部分的發(fā)夾的莖，所述環(huán)部分包含MBC(例如，在圖3中所描述的)。在一些實(shí)施方式中，在5’端融合的情況中，這一發(fā)夾構(gòu)型保護(hù)MBC，以免使其退火至抑制延伸反應(yīng)的RT反應(yīng)的其它靶標(biāo)。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群可包含具有變化的3’序列的個(gè)體引物。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群可包含具有相同的5’核苷酸序列的個(gè)體引物，例如，所述個(gè)體引物均與相同的測序引物兼容。在一些實(shí)施方式中，加尾隨機(jī)引物群可包含具有變化的5’核苷酸序列的個(gè)體引物，例如，第一個(gè)體引物與第一測序引物兼容，且第二個(gè)體引物與第二測序引物兼容。

本文所使用的“雜交序列”是指與另一核酸(例如，模板分子、靶序列)的序列充分互補(bǔ)以使得能夠在核酸之間雜交的核酸序列(例如，引物的一部分)。在一些實(shí)施方式中，雜交序列的長度為約5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)或更多的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，雜交序列的長度范圍為5個(gè)-50個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-40個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-35個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-30個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-25個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-20個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-15個(gè)核苷酸、長度為5個(gè)-10個(gè)核苷酸、長度為10個(gè)-40個(gè)核苷酸、長度為10個(gè)-30個(gè)核苷酸或長度為10-20個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，本文所公開的方法包括延伸方案或延伸步驟。在此類實(shí)施方式中，延伸可使用雜交有引物的核酸分子作為模板，從一個(gè)或多個(gè)雜交的加尾隨機(jī)引物進(jìn)行。本文對延伸步驟進(jìn)行了描述。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)加尾隨機(jī)引物可基本上雜交至樣品中的所有核酸，樣品中的許多核酸可能不含已知的靶核苷酸序列。因此，在一些實(shí)施方式中，由于使用不含已知的靶核苷酸序列的模板進(jìn)行雜交，可出現(xiàn)隨機(jī)引物的延伸。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法可涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增方案，所述擴(kuò)增方案涉及一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。本文所使用的術(shù)語“擴(kuò)增方案”是指特異性地?cái)U(kuò)增感興趣的核酸(增加感興趣的核酸的豐度)的程序。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)先前的聚合酶延伸產(chǎn)物作為相繼的多輪延伸的模板時(shí)，指數(shù)擴(kuò)增出現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文所公開的方法的PCR擴(kuò)增方案可包括至少1個(gè)、在一些情況中至少5個(gè)以上的重復(fù)循環(huán)。在一些實(shí)施方式中，各重復(fù)循環(huán)包括以下步驟：1)鏈分離(例如，熱變性)；2)寡核苷酸引物退火至模板分子；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。應(yīng)該理解的是，可使用這些步驟中各自涉及的任何適合的條件和時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，選定的條件和時(shí)間可取決于與反應(yīng)中使用的核酸模板和/或引物相關(guān)的長度、序列內(nèi)容物、解鏈溫度、二級結(jié)構(gòu)特征或其它因素。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文所述方法的擴(kuò)增方案在熱循環(huán)儀中進(jìn)行，許多熱循環(huán)儀是可商購的。

在一些實(shí)施方式中，核酸延伸反應(yīng)涉及核酸聚合酶的使用。本文所使用的短語“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板依賴性聚合，以形成與模板核酸序列互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3’末端起始合成，并以朝向模板的5’末端的方向進(jìn)行。眾多的核酸聚合酶在本領(lǐng)域中是已知并可商購的。一組核酸聚合酶是熱穩(wěn)定的，即核酸聚合酶在經(jīng)受了足以使互補(bǔ)核酸的退火鏈變性的溫度(例如，94℃)或有時(shí)更高的溫度之后，仍保留功能。擴(kuò)增方案的非限制性實(shí)例涉及在下列條件下使用聚合酶(例如，Phoenix Taq、VeraSeq)：98℃下30秒，隨后為包含在98℃下解鏈10秒的14個(gè)-22個(gè)循環(huán)，然后在68℃退火30秒，隨后在72℃下延伸3min，然后將反應(yīng)保持在4℃下。然而，可使用其它適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件。在一些實(shí)施方式中，可對退火/延伸溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，以在鹽濃度中引起差異(例如，3℃以上對應(yīng)更高的鹽濃度)。在一些實(shí)施方式中，減緩例如從98℃至65℃的斜率(ramp rate)(例如，1℃/秒、0.5℃/秒、0.28℃/秒、0.1℃/秒或更慢)改善了在高度復(fù)用的樣品中的引物性能和覆蓋均勻度。

在一些實(shí)施方式中，在酶實(shí)施模板依賴性延伸的條件下，使用核酸聚合酶。在一些實(shí)施方式中，核酸聚合酶是DNA聚合酶I、Taq聚合酶、Pheonix Taq聚合酶、Phusion聚合酶、T4聚合酶、T7聚合酶、Klenow片段、Klenow exo-、phi29聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、VeraSeq ULtra聚合酶、VeraSeq HF 2.0聚合酶、EnzScript或另外的適當(dāng)?shù)木酆厦浮Ｔ谝恍?shí)施方式中，核酸聚合酶不是逆轉(zhuǎn)錄酶。在一些實(shí)施方式中，核酸聚合酶作用于DNA模板。在一些實(shí)施方式中，核酸聚合酶作用于RNA模板。在一些實(shí)施方式中，延伸反應(yīng)涉及針對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA分子(RNA-依賴性DNA聚合酶活性)。在一些實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶是小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(mouse molony murine leukemia virus，M-MLV)聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶或另外的適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄酶。

在一些實(shí)施方式中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)涉及包括鏈分離步驟的循環(huán)，所述鏈分離步驟通常涉及加熱反應(yīng)混合物。本文所使用的術(shù)語“鏈分離”或“將鏈分離”是指處理核酸樣品，從而使互補(bǔ)的雙鏈分子分離成可退火至寡核苷酸引物的兩條單鏈。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文所述的方法的鏈分離通過將核酸樣品加熱至高于其解鏈溫度(T_m)而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，對于在適于核酸聚合酶的反應(yīng)制劑中的含有核酸分子的樣品而言，加熱至94℃足以實(shí)現(xiàn)鏈分離。在一些實(shí)施方式中，適合的反應(yīng)制劑包含一種或多種鹽(例如，1mM-100mM KCl、0.1mM-10mM MgCl₂)、至少一種緩沖試劑(例如，1mM-20mM Tris-HCl)以及載體(例如，0.01％-0.5％BSA)。合適的緩沖液的非限定性實(shí)例含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、0.5mM-3mM MgCl₂和0.1％BSA。

在一些實(shí)施方式中，核酸擴(kuò)增涉及將引物退火至核酸模板，所述核酸模板具有靶核酸特征的鏈。在一些實(shí)施方式中，可將靶核酸的鏈作為模板核酸。

本文所使用的術(shù)語“退火”是指在兩個(gè)核酸之間的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)的堿基對的形成。在一些實(shí)施方式中，退火涉及兩個(gè)互補(bǔ)的核酸鏈或基本上互補(bǔ)的核酸鏈一起雜交。在一些實(shí)施方式中，在延伸反應(yīng)的背景中，退火涉及將引物雜交至模板，從而形成用于模板依賴性聚合酶的引物延伸底物。在一些實(shí)施方式中，退火條件(例如，在引物和核酸模板之間)可基于引物的長度和序列而變化。在一些實(shí)施方式中，退火條件基于引物的T_m(例如，計(jì)算出的T_m)。在一些實(shí)施方式中，延伸方案的退火步驟涉及在鏈分離步驟后將溫度降低至基于引物T_m(例如，計(jì)算的T_m)的溫度足夠長的時(shí)間，以使得能夠由此退火。在一些實(shí)施方式中，可使用多種算法(例如，OLIGO^TM(Molecular Biology Insights Inc.Colorado)引物設(shè)計(jì)軟件和VENTRO NTI^TM(Invitrogen,Inc.California)引物設(shè)計(jì)軟件以及在互聯(lián)網(wǎng)上可獲得的程序，包括Primer3、Oligo Calculator和NetPrimer(Premier Biosoft；Palo Alto，CA；以及在萬維網(wǎng)上免費(fèi)獲得的(例如，在premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上))中的任一種來測定T_m。在一些實(shí)施方式中，引物的T_m可利用以下公式進(jìn)行計(jì)算，該公式被NetPrimer軟件使用并在Frieir等的PNAS 198683:9373-9377中更詳細(xì)的描述，以引用的方式將其整體并入本文。

T_m＝ΔH/(ΔS+R*In(C/4))+16.6log([K⁺]/(1+0.7[K⁺]))-273.15

其中，ΔH為螺旋形成的焓；ΔS為螺旋形成的熵；R為摩爾氣體常數(shù)(1.987cal/℃*mol)；C為核酸濃度；以及[K⁺]為鹽濃度。對大多數(shù)擴(kuò)增方案而言，將退火溫度選擇為低于預(yù)測T_m約5℃，盡管可使用更接近T_m和高于T_m的溫度(例如，低于預(yù)測T_m 1℃和5℃之間的溫度或高于預(yù)測T_m1℃和5℃之間的溫度)，例如，低于預(yù)測T_m超過5℃的溫度(如，低6℃、低8℃、低10℃或更低)同樣可以。在一些實(shí)施方式中，退火溫度越接近T_m，退火越特異。在一些實(shí)施方式中，在延伸反應(yīng)(例如，在PCR擴(kuò)增方案的背景中)期間引物退火所使用的時(shí)間至少部分地基于反應(yīng)的體積(例如，較大的體積涉及更長的時(shí)間)來確定。在一些實(shí)施方式中，在延伸反應(yīng)(例如，在PCR擴(kuò)增方案的背景中)期間引物退火所使用的時(shí)間至少部分地基于引物和模板的濃度(例如，比起較低的引物與模板的相對濃度，較高的相對濃度涉及較少的時(shí)間)來確定。在一些實(shí)施方式中，取決于體積和相對的引物/模板濃度，延伸反應(yīng)中(例如，在PCR擴(kuò)增方案的背景中)的引物退火步驟范圍可為1秒-5分鐘、10秒-2分鐘或30秒-2分鐘。本文所使用的“基本上退火”是指當(dāng)在PCR擴(kuò)增方案的背景中使用時(shí)，兩個(gè)核酸之間形成的互補(bǔ)堿基對達(dá)到的足以產(chǎn)生可檢測水平的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的程度。

本文所使用的術(shù)語“聚合酶延伸”是指至少一個(gè)互補(bǔ)的核苷酸通過核酸聚合酶向退火至核酸模板的引物的3’末端的模板依賴性的添加。在一些實(shí)施方式中，聚合酶延伸添加多于1個(gè)核苷酸，例如，添加多至并包括對應(yīng)于模板全長的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，聚合酶延伸的條件至少部分地基于所使用的聚合酶種類。在一些實(shí)施方式中，用于聚合酶延伸的溫度基于酶的已知活性性質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，在退火溫度低于酶的最理想溫度的情況中，使用較低的延伸溫度是可接受的。在一些實(shí)施方式中，酶可在其最理想延伸溫度以下保留至少部分活性。在一些實(shí)施方式中，在65℃-75℃或68℃-72℃下進(jìn)行聚合酶延伸(例如，熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行的聚合酶延伸)(例如，Taq聚合酶和其變體)。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法涉及在PCR擴(kuò)增方案的各循環(huán)退火至核酸模板的引物的聚合酶延伸。在一些實(shí)施方式中，使用具有相對強(qiáng)的鏈置換活性的聚合酶進(jìn)行聚合酶延伸。在一些實(shí)施方式中，出于檢測融合(例如，5'端融合)的目的，將具有強(qiáng)的鏈置換活性的聚合酶用于制備核酸。

在一些實(shí)施方式中，引物延伸在允許退火的寡核苷酸引物延伸的條件下進(jìn)行。本文所使用的術(shù)語“允許退火的寡核苷酸延伸以使得延伸產(chǎn)物生成的條件”是指包括例如溫度、鹽濃度和輔因子濃度、pH和酶濃度的條件的組，核酸聚合酶在所述條件下催化引物延伸。在一些實(shí)施方式中，這些條件至少部分地基于所使用的核酸聚合酶。在一些實(shí)施方式中，聚合酶可在適合的反應(yīng)制劑中進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，適合的反應(yīng)制劑包含一種或多種鹽(例如，1mM-100mM KCl、0.1mM-10mM MgCl₂)、至少一種緩沖試劑(例如，1mM-20mM Tris-HCl)、載體(例如，0.01％-0.5％BSA)以及一種或多種NTPs(例如，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各10μM-200μM)。條件的非限制性組是50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、0.5mM-3mM MgCl₂、dNTP各200μM和0.1％BSA，72℃，聚合酶(例如，Taq聚合酶)在上述條件下催化引物延伸。在一些實(shí)施方式中，起始和延伸的條件可包括在適合的緩沖液中存在一種、兩種、三種或四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸(例如，選自dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和聚合誘導(dǎo)劑(例如，DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)。在一些實(shí)施方式中，“緩沖液”可包括溶劑(例如，水性溶劑)，加上適當(dāng)?shù)妮o因子以及影響pH、離子強(qiáng)度等的試劑。

在一些實(shí)施方式中，核酸擴(kuò)增涉及多至5輪、多至10輪、多至20輪、多至30輪、多至40輪或更多輪(循環(huán))擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，核酸擴(kuò)增可包括長度為5個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增步驟可包括長度為10個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，各擴(kuò)增步驟可包括長度為12個(gè)循環(huán)-16個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，退火溫度可低于70℃。在一些實(shí)施方式中，退火溫度可低于72℃。在一些實(shí)施方式中，退火溫度可低于65℃。在一些實(shí)施方式中，退火溫度可為約61℃至約72℃。

在不同的實(shí)施方式中，本文所述的方法和組合物涉及用一種或多種類型的本文所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增方案。本文所使用的“引物”是指能夠特異性地退火至核酸模板并提供作為模板依賴性聚合酶的底物的3’末端以產(chǎn)生與所述模板互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物的寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中，用于本文所述方法中的引物是單鏈的，以便使引物及其互補(bǔ)物能夠退火以形成雙鏈。根據(jù)本文所述方法和組合物的引物可包含雜交序列(例如，與核酸模板退火的序列)，所述雜交序列的長度為小于或等于300個(gè)核苷酸，例如，長度小于或等于300個(gè)、或250個(gè)、或200個(gè)、或150個(gè)、或100個(gè)、或90個(gè)、或80個(gè)、或70個(gè)、或60個(gè)、或50個(gè)、或40個(gè)、或30個(gè)或更少、或20個(gè)或更少、或15個(gè)或更少的核苷酸、但至少為6個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，引物的雜交序列的長度可為6個(gè)-50個(gè)核苷酸、6個(gè)-35個(gè)核苷酸、6個(gè)-20個(gè)核苷酸、10個(gè)-25個(gè)核苷酸。

可使用合成寡核苷酸和引物的任何適合的方法。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)來源提供了適于提供用于本文所述方法和組合物的引物的寡核苷酸合成服務(wù)，例如，INVITROGEN^TMCustom DNA Oligos；Life Technologies；Grand Island，NY或來自IDT的custom DNA Oligos；Coralville，IA。

在一些實(shí)施方式中，在來自加尾隨機(jī)引物的延伸已發(fā)生后，可在第一擴(kuò)增步驟中對延伸產(chǎn)物和模板進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增可涉及使用第一靶特異性引物和第一尾引物的PCR擴(kuò)增循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增可使得存在于延伸產(chǎn)物中的加尾隨機(jī)引物序列的至少部分被擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增可使得存在于延伸產(chǎn)物中的加尾隨機(jī)引物序列的全部被擴(kuò)增。

本文所使用的術(shù)語“第一靶特異性引物”是指包含能夠在適合的退火條件下特異性地退火至核酸模板(具有靶核酸特征的鏈)的核酸序列的單鏈寡核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，引物(例如，靶特異性引物)可包含5’標(biāo)簽序列部分。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)中存在的多個(gè)引物(例如，所有第一靶特異性引物)可包含相同的5’標(biāo)簽序列部分。在一些實(shí)施方式中，在多重PCR反應(yīng)中，不同的引物種類能夠以脫靶方式彼此相互作用，從而引起通過DNA聚合酶進(jìn)行的引物延伸和隨后的擴(kuò)增。在此類實(shí)施方式中，這些引物二聚體一般是短的，并且它們的高效擴(kuò)增可主導(dǎo)反應(yīng)并占據(jù)優(yōu)勢，從而導(dǎo)致期望的靶序列的擴(kuò)增不佳。因此，在一些實(shí)施方式中，在引物中(例如，在靶特異性引物上)包含有5’標(biāo)簽序列可引起引物二聚體(其在兩個(gè)末端上含有相同的互補(bǔ)尾)的形成。在一些實(shí)施方式中，在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中，此類引物二聚體將變性成單鏈DNA引物二聚體，各單鏈DNA引物二聚體在其兩個(gè)末端上含有由5’標(biāo)簽引入的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，并非是引物退火至這些單鏈DNA引物二聚體，而是可發(fā)生分子內(nèi)發(fā)夾(鍋柄狀結(jié)構(gòu))的形成，這是由于相同的引物二聚體分子上互補(bǔ)標(biāo)簽的接近的可及性(proximate accessibility)，而不是不同的分子上與新引物的分子間相互作用。因此，在一些實(shí)施方式中，這些引物二聚體可能難以有效擴(kuò)增，從而使得引物不會(huì)呈指數(shù)地被二聚體擴(kuò)增所消耗；相反，對于期望的靶序列的特異性擴(kuò)增而言，帶標(biāo)簽的引物可保持高且足夠的濃度。在一些實(shí)施方式中，在多重?cái)U(kuò)增的上下文中，引物二聚體的累積可能是不期望的，因?yàn)橐锒垠w競爭并消耗反應(yīng)中的其它試劑。

在一些實(shí)施方式中，5’標(biāo)簽序列可為富含GC的序列。在一些實(shí)施方式中，5’標(biāo)簽序列可包含至少50％的GC含量、至少55％的GC含量、至少60％的GC含量、至少65％的GC含量、至少70％的GC含量、至少75％的GC含量、至少80％的GC含量、或更高的GC含量。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)簽序列可包含至少60％的GC含量。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)簽序列可包含至少65％的GC含量。

在一些實(shí)施方式中，靶特異性引物(例如，第二靶特異性引物)是包含3’部分和5’部分的單鏈寡核苷酸，所述3’部分包含能夠特異性地退火至擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含標(biāo)簽序列(例如，與測序引物(例如，第二測序引物)相同或互補(bǔ)的核苷酸序列)。

在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增方案的第二靶特異性引物相對于擴(kuò)增方案的第一靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，第二靶特異性引物通過至少3個(gè)核苷酸(例如，通過3個(gè)以上、4個(gè)以上、5個(gè)以上、6個(gè)以上、7個(gè)以上、8個(gè)以上、9個(gè)以上、10個(gè)以上、15個(gè)以上核苷酸)相對于第一靶特異性引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增方案中使用的所有靶特異性引物(例如，第二靶特異性引物)包含相同的5’部分。在一些實(shí)施方式中，可對5’部分靶特異性引物進(jìn)行配置，以阻遏(suppress)本文所述的引物二聚體。

在一些實(shí)施方式中，在擴(kuò)增方案中使用的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物基本上與靶核酸的同一條鏈互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，特異性地退火至靶序列(例如，已知的靶序列)的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物的部分可包含所述已知的靶核苷酸序列的總共至少20個(gè)獨(dú)有(unique)堿基，例如，20個(gè)以上獨(dú)有堿基、25個(gè)以上獨(dú)有堿基、30個(gè)以上獨(dú)有堿基、35個(gè)以上獨(dú)有堿基、40個(gè)以上獨(dú)有堿基或50個(gè)以上獨(dú)有堿基。在一些實(shí)施方式中，特異性地退火至靶序列(例如，已知的靶序列)的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物的部分可含有所述已知的靶核苷酸序列的總共至少30個(gè)獨(dú)有堿基。

本文所使用的術(shù)語“第一尾引物”是指含有與加尾引物的尾部分相同的核酸序列的核酸分子。

本文所使用的術(shù)語“第二尾引物”是指含有與第一測序引物、接頭、索引引物等的一部分相同的核酸序列并任選相對于第一加尾引物嵌套的核酸分子。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物位于第一尾引物的外側(cè)，以促進(jìn)適當(dāng)?shù)乃饕龢?biāo)簽、接頭(例如，用于測序平臺(tái))等的添加。在一些實(shí)施方式中，第二加尾引物與測序引物相同。在一些實(shí)施方式中，第二加尾引物與測序引物互補(bǔ)。

在一些實(shí)施方式中，第二尾引物相對于第一尾引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，第二尾引物并未相對于第一尾引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增方案的尾引物通過至少3個(gè)核苷酸(例如，通過3個(gè)核苷酸、4個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷酸、6個(gè)核苷酸、7個(gè)核苷酸、8個(gè)核苷酸、9個(gè)核苷酸、10個(gè)核苷酸或更多)相對于彼此嵌套。

在一些實(shí)施方式中，第一尾引物包含與步驟(b)鏈的延伸產(chǎn)物相同或互補(bǔ)的核酸序列，所述核酸序列不被第二尾引物所包含，且與第二尾引物相同或互補(bǔ)的任何序列相比更接近于加尾隨機(jī)引物的5’末端。因此，在一些實(shí)施方式中，第二尾引物位于通過隨機(jī)尾引物所添加的區(qū)域的外側(cè)(5’末端)，例如，通過第一尾引物添加的5’尾內(nèi)。

在一些實(shí)施方式中，第一尾引物可包含與加尾隨機(jī)引物的最5’端核苷酸延展段(例如，具有約20個(gè)核苷酸)相同或互補(bǔ)的核酸序列，且第二尾引物可包含與加尾隨機(jī)引物的約30個(gè)堿基相同或互補(bǔ)的核酸序列，所述第二尾引物具有作為所述加尾隨機(jī)引物的5’末端的3’端方向的至少3個(gè)核苷酸的5’核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，嵌套尾引物的使用最小化或消除了可擴(kuò)增(例如，橋式PCR或乳液PCR中)但不能測序的最終擴(kuò)增子的生成，這是可能在半巢式(hemi-nested)方法中出現(xiàn)的情況。在一些實(shí)施方式中，使用與測序引物相同的引物進(jìn)行的半巢式方法可導(dǎo)致不期望的擴(kuò)增產(chǎn)物從第一PCR步驟遺留至第二PCR步驟，并將最終產(chǎn)生人為測序讀取段。在一些實(shí)施方式中，如本文所述，兩個(gè)尾引物的使用可以減少此類問題，并且在一些實(shí)施方式中可消除此類問題。

在一些實(shí)施方式中，在第一擴(kuò)增步驟的第一PCR擴(kuò)增循環(huán)中，第一靶特異性引物能夠特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的任何核酸的模板鏈。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)設(shè)計(jì)第一靶特異性引物的方向，將合成已知的靶核苷酸序列上游或下游且與模板鏈互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，在形成包含雜交序列(第一靶特異性引物與所述雜交序列形成互補(bǔ)的堿基對)的延伸產(chǎn)物的情況中，可形成包含以下的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物：第一靶特異性引物(以及與其互補(bǔ)的序列)、第一靶特異性引物下游的靶核苷酸序列(以及與其互補(bǔ)的序列)以及加尾隨機(jī)引物序列(以及與其互補(bǔ)的序列)。在此類實(shí)施方式中，在隨后的PCR擴(kuò)增循環(huán)中，第一靶特異性引物和第一尾引物兩者均能夠特異性地退火至擴(kuò)增產(chǎn)物的適當(dāng)鏈，并且已知的核苷酸靶序列和加尾隨機(jī)引物之間的序列可被擴(kuò)增。

在本文所述方法的一些實(shí)施方式中，在進(jìn)一步的數(shù)輪擴(kuò)增中對擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步的數(shù)輪擴(kuò)增可涉及使用第二靶特異性引物和第一測序引物或第二尾引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增循環(huán)。在一些實(shí)施方式中，PCR擴(kuò)增循環(huán)可涉及使用與一個(gè)或多個(gè)其它(例如，在先的)PCR擴(kuò)增循環(huán)的PCR參數(shù)相同或不同的PCR參數(shù)。在一些實(shí)施方式中，PCR擴(kuò)增方案可具有相同或不同的退火溫度、或者相同或不同的延伸步驟時(shí)長。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法使得能夠確定在已知的靶核苷酸序列的一側(cè)或兩側(cè)的側(cè)翼區(qū)域上與所述已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列。無論靶核酸是正常地以單鏈核酸的形式還是雙鏈核酸的形式存在，序列信息能夠以5’至3’的單鏈格式(鏈A)表示。在一些實(shí)施方式中，如果將要測定鏈A的已知的靶核苷酸序列的5’端的序列，基因特異性引物可與鏈A互補(bǔ)(退火至鏈A)。如果將要測定鏈A的已知的靶核苷酸序列的3’端的序列，基因特異性引物可與鏈A相同，從而使得所述引物將退火至雙鏈靶核酸的互補(bǔ)鏈。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的涉及使用第一基因特異性引物和第二基因特異性引物的方法可使分析具有優(yōu)秀的靶命中(on-target)率，例如，70％-90％。在一些實(shí)施方式中，本文所述的分析和方法可具有至少85％的靶特異率。

在一些實(shí)施方式中，對本文所公開的引物(例如，靶特異性引物、尾引物)進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使得所述引物在約61℃-72℃(例如，約61℃-69℃、約63℃-69℃、約63℃-67℃、約64℃-66℃)的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，對本文所公開的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使得所述引物在低于72℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，對本文所公開的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使得所述引物在低于70℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，對本文所公開的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使得所述引物在低于68℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，對本文所公開的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使得所述引物在約65℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。

在一些實(shí)施方式中，特異性地退火至已知的靶核苷酸序列的靶特異性引物的部分將在約61℃-72℃(例如，約61℃-69℃、約63℃-69℃、約63℃-67℃、約64℃-66℃)的溫度下特異性地退火。在一些實(shí)施方式中，特異性地退火至已知的靶核苷酸序列的靶特異性引物的部分將在PCR緩沖液中在約65℃的溫度下特異性地退火。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的引物不包含修飾的堿基(例如，引物可不包含封閉3’胺(blocking 3’amine))。然而，在一些實(shí)施方式中，本文所述的引物不包含修飾的堿基或天然存在的堿基。在一些實(shí)施方式中，可用能夠提供可檢測信號的標(biāo)記直接地或間接地對引物進(jìn)行修飾。此類標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括放射性同位素、熒光分子、生物素以及其它。在一些實(shí)施方式中，本文所公開的引物可包括生物素接頭或其它適合的接頭(例如，用于將引物綴合至支持物)。在一些實(shí)施方式中，引物可包含核酸內(nèi)切酶的靶序列，從而用適當(dāng)?shù)拿盖懈?。在其它?shí)施方式中，引物的5’末端可包含與結(jié)合至珠或其它支持物(例如，流通池基底)的核酸互補(bǔ)的序列。引物可包含或可不包含修飾的核苷間鍵。

在本文所述方法的一些實(shí)施方式中，可對核酸(例如，擴(kuò)增核酸、延伸產(chǎn)物、靶核酸)進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，測序可通過下一代測序法進(jìn)行。本文所使用的“下一代測序”是指寡核苷酸測序技術(shù)：所述寡核苷酸測序技術(shù)具有以高于傳統(tǒng)測序方法(例如，Sanger測序)的可能速度的速度對寡核苷酸進(jìn)行測序的能力，因?yàn)樗鱿乱淮鷾y序平行執(zhí)行和讀取數(shù)千至數(shù)百萬個(gè)測序反應(yīng)。下一代測序法/平臺(tái)的非限制性實(shí)例包括：大規(guī)模平行簽名測序(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸測序(454Life Sciences/Roche Diagnostics)；固相可逆染料終止物測序(Solexa/Illumina)：SOLiD技術(shù)(Applied Biosystems)；Ion半導(dǎo)體測序(ION Torrent)；DNA納米球測序(Complete Genomics)；以及可從Pacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、Oxford Nanopore Technologies和Helicos Biosciences獲得的技術(shù)。在一些實(shí)施方式中，測序引物可包含可與選定的下一代測序法兼容的部分。下一代測序技術(shù)及相關(guān)測序引物的限制和設(shè)計(jì)參數(shù)在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如，Shendure等，“Next-generation DNA sequencing”，Nature，2008，第26卷，第10期，1135-1145；Mardis，“The impact of next-generation sequencing technology on genetics”，Trends in Genetics，2007，第24卷，第3期，第133-141頁；Su等，“Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics”，Expert Rev Mol Diagn，2011，11(3):333-43；Zhang等，“The impact of next-generation sequencing on genomics”，J Genet Genomics，2011，38(3):95-109；Nyren,P.等，Anal Biochem 208:17175(1993)；Bentley,D.R.，Curr Opin Genet Dev 16:545-52(2006)；Strausberg,R.L.等，Drug Disc Today 13:569-77(2008)；美國專利號7,282,337；美國專利號7,279,563；美國專利號7,226,720；美國專利號7,220,549；美國專利號7,169,560；美國專利號6,818,395；美國專利號6,911,345；美國公開號2006/0252077、2007/0070349和20070070349，以引用的方式將其整體并入本文)。

在一些實(shí)施方式中，測序步驟涉及第一測序引物和第二測序引物的使用。在一些實(shí)施方式中，對第一測序引物和第二測序引物進(jìn)行選擇，以與本文所述的下一代測序法兼容。

將測序讀取段與基因組和/或cDNA序列的已知序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對的方法是本領(lǐng)域中公知的，并且用于此過程的軟件是可商購的。在一些實(shí)施方式中，并未完全映射(map)至野生型序列數(shù)據(jù)庫的讀取段(去掉測序引物核苷酸序列)可為基因組重排或大型插入缺失(indel)突變。在一些實(shí)施方式中，含有映射至基因組中多個(gè)位置的序列的讀取段(去掉測序引物核苷酸序列)可為基因組重排。

在一些實(shí)施方式中，引物可包含附加序列，例如，標(biāo)識(shí)符(identifier)序列(例如，條形碼序列、索引序列)、測序引物雜交序列(例如，Rd1)和接頭序列。在一些實(shí)施方式中，接頭序列是與下一代測序系統(tǒng)一起使用的序列。在一些實(shí)施方式中，接頭序列是用于基于Illumina的測序技術(shù)的P5序列和P7序列。在一些實(shí)施方式中，接頭序列是與Ion Torrent測序技術(shù)兼容的P1序列和A序列。

在一些實(shí)施方式中，本文所使用的“條形碼”、“分子條形碼”、“分子條形碼標(biāo)簽”和“索引”可互換使用，其通常是指用作標(biāo)識(shí)符(例如，諸如源標(biāo)識(shí)符、位置標(biāo)識(shí)符、日期標(biāo)識(shí)符或時(shí)間標(biāo)識(shí)符(例如，取樣或加工的日期或時(shí)間)或核酸的其它標(biāo)識(shí)符)的核酸的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，將此類條形碼序列或索引序列用于識(shí)別存在于核酸群中的核酸的不同方面。在一些實(shí)施方式中，條形碼序列或索引序列可向靶核酸提供源標(biāo)識(shí)符或位置標(biāo)識(shí)符。例如，條形碼序列或索引序列可用于識(shí)別從其獲得核酸的患者。在一些實(shí)施方式中，條形碼序列或索引序列使得能夠在單個(gè)反應(yīng)上(例如，在單個(gè)流通池中進(jìn)行)對多個(gè)樣品進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，出于檢測個(gè)體測序反應(yīng)的目的，可將索引序列用于定向序列成像儀。在一些實(shí)施方式中，條形碼序列或索引序列的長度可為2個(gè)-25個(gè)核苷酸、長度為2個(gè)-15個(gè)核苷酸、長度為2個(gè)-10個(gè)核苷酸、長度為2個(gè)-6個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，條形碼序列或索引序列可包含至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)或至少25個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，當(dāng)根據(jù)本文所述方法使用加尾隨機(jī)引物群時(shí)，在擴(kuò)增后可存在多個(gè)可區(qū)別的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，由于加尾隨機(jī)引物在貫穿樣品的核酸分子的不同位置處雜交，靶特異性引物的組可雜交(和擴(kuò)增)通過多于1個(gè)雜交事件所產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，例如，一個(gè)加尾隨機(jī)引物可在距靶特異性引物雜交位點(diǎn)的第一距離處(例如，100個(gè)核苷酸)雜交，且另一加尾隨機(jī)引物可在距靶特異性引物雜交位點(diǎn)的第二位置處(例如，200個(gè)核苷酸)雜交，從而產(chǎn)生兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物(例如，約100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物和約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物)。在一些實(shí)施方式中，可對這些多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物各自進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方式中，對這些多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的測序是有利的，因?yàn)槠涮峁┝硕鄠€(gè)重疊的序列讀取段，可對所述重疊的序列讀取段彼此進(jìn)行比較以檢測擴(kuò)增或測序過程中所引入的序列錯(cuò)誤。在一些實(shí)施方式中，可對個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比對，并且在其于特定堿基處存在的序列不同的情況中，可能存在PCR和/或測序的錯(cuò)誤或人為假象。

在一些實(shí)施方式中，可在方法的任意適當(dāng)步驟之前和/或之后，將靶核酸和/或其擴(kuò)增產(chǎn)物從酶、引物、或緩沖液組分中分離?？墒褂糜糜诜蛛x核酸的任何適合的方法。在一些實(shí)施方式中，分離可包括固相可逆固定(Solid Phase Reversible Immobilization，SPRI)純化。SPRI純化方法是本領(lǐng)域所熟知的，且試劑盒是可商購的，例如，Agencourt AMPure XP-PCR純化(目錄號A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些實(shí)施方式中，酶可通過加熱處理失活。

在一些實(shí)施方式中，可使用適當(dāng)?shù)姆椒?例如，純化、消化等)將未雜交的引物從核酸制劑中去除。在一些實(shí)施方式中，使用核酸酶(例如，核酸外切酶I)從制劑中去除引物。在一些實(shí)施方式中，在引物消化后，將此類核酸酶加熱失活。在核酸酶失活后，可與其它的適當(dāng)組分(例如，酶、緩沖液)一起添加進(jìn)一步的引物組，以進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增反應(yīng)。

在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以是基因組DNA或其部分。在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以是核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)或其部分。在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以是cDNA或其部分。

許多適于用于本文所述方法的測序方法提供最佳讀取段長度為數(shù)十至數(shù)百核苷酸堿基的測序運(yùn)行(例如，Ion Torrent技術(shù)可產(chǎn)生200bp-400bp的讀取段長度)。靶核酸可基本上長于或可基本上不長于這一最佳讀取段長度。在一些實(shí)施方式中，為了使由擴(kuò)增核酸部分具有在特定測序技術(shù)中使用的適合長度，已知的靶核苷酸序列和靶核酸末端(可將加尾隨機(jī)引物雜交至該末端)之間的平均距離應(yīng)盡可能接近所選定技術(shù)的最佳讀取段長度。在一些實(shí)施方式中，如果給定測序技術(shù)的最佳讀取段長度為200bp，則根據(jù)本文所述方法擴(kuò)增的核酸分子應(yīng)具有的平均長度為約800bp、約700bp、約600bp、約500bp、約400bp、約300bp、約200bp以下。

可對本文所使用的核酸進(jìn)行剪切(例如，在測序前)(例如，機(jī)械剪切或酶促剪切)，以產(chǎn)生具有任何期望大小的片段。機(jī)械剪切方法的非限制性實(shí)例包括：超聲、霧化以及可從Covaris(Woburn，MA)獲得的AFA^TM剪切技術(shù)。在一些實(shí)施方式中，可通過超聲對核酸進(jìn)行機(jī)械剪切。

在一些實(shí)施方式中，不對靶核酸進(jìn)行剪切或消化。在一些實(shí)施方式中，不對制備步驟的核酸產(chǎn)物(例如，延伸產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行剪切或酶促消化。

在一些實(shí)施方式中，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，可使樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄酶方案以生成DNA模板，并隨后可對所述DNA模板進(jìn)行剪切。在一些實(shí)施方式中，可在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶方案前對靶RNA進(jìn)行剪切。在一些實(shí)施方式中，含有靶RNA的樣品可用于本文所述的如下方法中：使用從新鮮樣本或降解樣本提取的總核酸；無需為cDNA測序去除基因組DNA；無需為cDNA測序而使核糖體RNA耗竭；在任何步驟中均不需要機(jī)械剪切或酶促剪切；通過使用隨機(jī)六聚體使RNA經(jīng)受雙鏈cDNA合成。

在一些實(shí)施方式中，已知的靶核苷酸可包含由基因重排產(chǎn)生的融合序列。在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法適合于確定基因重排的存在和/或種類。在一些實(shí)施方式中，基因重排的一部分的種類是先前已知的(例如，待由基因特異性引物所靶向的基因重排的部分)，并可使用本文所公開的方法對其它部分的序列進(jìn)行確定。在一些實(shí)施方式中，基因重排可涉及癌基因。在一些實(shí)施方式中，基因重排可包含融合癌基因。

在一些實(shí)施方式中，靶核酸存在于或獲得自適當(dāng)?shù)臉悠?例如，食物樣品、環(huán)境樣品、諸如血液樣品的生物樣品等)。在一些實(shí)施方式中，樣品為獲得自受試者的生物樣品。在一些實(shí)施方式中，樣品可為獲得自受試者的診斷樣品。在一些實(shí)施方式中，樣品可進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)、細(xì)胞、流體、生物流體、保護(hù)劑和/或其它物質(zhì)。以非限制性實(shí)例的方式，樣品可為面頰拭子(cheek swab)、血液、血清、血漿、痰、腦脊液流體、尿液、淚液、肺泡分離物(alveolar isolates)、胸膜液、心包液、囊液(cyst fluid)、腫瘤組織、組織、活檢物、唾液、抽出物(aspirate)或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，樣品可通過切除術(shù)或活檢物獲得。

在一些實(shí)施方式中，樣品可獲得自需要治療與遺傳改變相關(guān)的疾病(例如，癌癥或遺傳性疾病)的受試者。在一些實(shí)施方式中，已知的靶序列存在于與疾病相關(guān)的基因中。

在一些實(shí)施方式中，樣品獲得自需要治療癌癥的受試者。在一些實(shí)施方式中，樣品包含腫瘤細(xì)胞群，例如，至少一種腫瘤細(xì)胞的群。在一些實(shí)施方式中，樣品包含腫瘤活檢物，包括但不限于未經(jīng)處理的活檢組織或經(jīng)過處理的活檢組織(例如，福爾馬林固定的活檢組織和/或石蠟包埋的活檢組織)。

在一些實(shí)施方式中，將樣品新鮮收集。在一些實(shí)施方式中，在用于本文所述的方法和組合物中之前，將樣品儲(chǔ)存。在一些實(shí)施方式中，樣品是未經(jīng)處理的樣品。本文所使用的“未經(jīng)處理的樣品”是指除了稀釋于溶液中和/或懸浮于溶液中之外的未曾進(jìn)行任何事先的樣品預(yù)處理的生物樣品。在一些實(shí)施方式中，樣品獲得自受試者，并在用于本文所述的方法和組合物之前對其進(jìn)行保存或加工。以非限制性實(shí)例的方式，可將樣品包埋于石蠟中、冷藏或冷凍?？稍诟鶕?jù)本文所述的方法和組合物確定核酸的存在之前，將冷凍的樣品解凍。在一些實(shí)施方式中，樣品可為加工過的或處理過的樣品。用于處理或加工樣品的示例性方法包括但不限于：離心、過濾、超聲、均質(zhì)化、加熱、冷凍和解凍、與保護(hù)劑(例如，抗凝血?jiǎng)┗蚝怂崦敢种苿?接觸以及它們的任意組合。在一些實(shí)施方式中，可用化學(xué)試劑和/或生物試劑對樣品進(jìn)行處理?？刹捎没瘜W(xué)試劑和/或生物試劑在加工和/或存儲(chǔ)期間保護(hù)和/或保持樣品或樣品所含核酸的穩(wěn)定性。可替代地或額外地，可采用化學(xué)試劑和/或生物試劑使核酸從樣品的其它組分中釋放。以非限制性實(shí)例的方式，在用于本文所述的方法和組合物之前，可用抗凝血?jiǎng)┨幚硌簶悠贰？稍诒疚乃_的方法中使用用于核酸分析的樣品加工、保存或處理的適合的方法和過程。在一些實(shí)施方式中，樣品可以是例如通過離心得到的澄清流體樣品。在一些實(shí)施方式中，可通過低速離心(例如，3000×g以下)并收集含有澄清流體樣品的上清液來使樣品澄清。

在一些實(shí)施方式中，可在用于本文所述的方法和組合物之前，對樣品中存在的核酸進(jìn)行分離、富集或純化。可使用從樣品分離、富集或純化核酸的適合的方法。例如，用于從各種樣品類型分離基因組DNA的試劑盒是可商購的(例如，目錄號51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法涉及例如在靶核酸的測序之前，富集靶核酸的方法。在一些實(shí)施方式中，在測序之前，待富集的靶核酸的一個(gè)末端的序列是未知的。在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法涉及在使用下一代測序技術(shù)確定核苷酸序列之前，富集特異性核苷酸序列的方法。在一些實(shí)施方式中，富集特異性核苷酸序列的方法不包括雜交富集。

本文所述的方法能夠以多重(multiplex)形式使用。在本文所述方法的實(shí)施方式中，多重應(yīng)用可包括確定與一種或多種已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列。本文所使用的“多重?cái)U(kuò)增”是指涉及在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行多于一種靶核酸的同時(shí)擴(kuò)增的過程。在一些實(shí)施方式中，方法涉及隨后使用一組或多組引物對多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行確定。多重可指在單個(gè)反應(yīng)中檢測約2種-1,000種之間的不同的靶序列。本文所使用的多重是指在單個(gè)反應(yīng)中檢測2種-1,000種之間的任何范圍(例如，5-500種、25-1000種或10-100種之間)的不同靶序列等。當(dāng)施用至PCR時(shí)，術(shù)語“多重”意味著在同一PCR反應(yīng)中存在對于至少兩種不同的靶序列具有特異性的引物。

在一些實(shí)施方式中，可用多個(gè)引物(例如，多個(gè)第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)對樣品或樣品的單獨(dú)部分中的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)引物(例如，多個(gè)第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)可存在于單個(gè)反應(yīng)混合物中，例如，可在同一反應(yīng)混合物中產(chǎn)生多種擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)引物(例如，多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)能夠特異性地退火至單獨(dú)的基因所包含的已知靶序列。在一些實(shí)施方式中，至少兩組引物(例如，至少兩組的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)能夠特異性地退火至已知靶序列的不同部分。在一些實(shí)施方式中，至少兩組引物(例如，至少兩組的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)能夠特異性地退火至單個(gè)基因所包含的已知靶序列的不同部分。在一些實(shí)施方式中，至少兩組引物(例如，至少兩組的第一靶特異性引物和第二靶特異性引物)能夠特異性地退火至含有已知的靶序列的基因的不同的外顯子。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)引物(例如，第一靶特異性引物)可含有相同的5’標(biāo)簽序列部分。

在本文所述方法的實(shí)施方式中，多重應(yīng)用可包括在一個(gè)測序反應(yīng)或測序運(yùn)行中確定多個(gè)樣品中與一個(gè)或多個(gè)已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)樣品可具有不同的來源，例如，來自不同的組織和/或不同的受試者。在此類實(shí)施方式中，引物(例如，加尾隨機(jī)引物)可進(jìn)一步包含條形碼部分。在一些實(shí)施方式中，可將具有獨(dú)特條形碼部分的引物(例如，加尾隨機(jī)引物)添加至各樣品，并與其中的核酸連接；可隨后將所述樣品合并。在此類實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物所得到的各測序讀取段將包含識(shí)別含有模板核酸的樣品的條形碼，所述擴(kuò)增產(chǎn)物源自所述模板核酸。

在本文所述方法的一些實(shí)施方式中，確定與已知的寡核苷酸靶序列鄰近的序列可提供與治療疾病相關(guān)的信息。因此，在一些實(shí)施方式中，可將本文所公開的方法用于幫助治療疾病。在一些實(shí)施方式中，樣品可來自需要治療與遺傳改變相關(guān)的疾病的受試者。在一些實(shí)施方式中，已知的靶序列可以是與疾病相關(guān)的基因(例如，癌基因)的序列。在一些實(shí)施方式中，與已知的寡核苷酸靶序列鄰近的序列和/或所述已知的寡核苷酸靶序列可含有疾病相關(guān)的突變或遺傳異常，例如，SNP、插入、缺失和/或基因重排。在一些實(shí)施方式中，與已知的靶序列鄰近的序列和/或存在于樣品中的已知的靶序列包含基因重排產(chǎn)物的序列。在一些實(shí)施方式中，基因重排可為癌基因，例如，融合癌基因。

癌癥的某些治療對于含有特定癌基因的腫瘤特別有效，例如，靶向給定融合癌基因的作用或表達(dá)的治療劑可對于含有該融合癌基因的腫瘤有效，但對于缺乏該融合癌基因的腫瘤無效。本文所述的方法可促進(jìn)對揭示癌基因狀態(tài)(例如，突變、SNP和/或重排)的特異性序列的確定。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)側(cè)翼區(qū)域的序列已知時(shí)，本文所述的方法可進(jìn)一步使得能夠確定特異性的序列，例如，本文所述的方法可確定涉及已知基因(例如，癌基因)的基因重排的存在和種類，其中，在進(jìn)行本文所述方法之前，精確位置和/或重排伴侶是未知的。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的技術(shù)涉及治療癌癥的方法。因此，在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可涉及：檢測獲得自需要治療癌癥的受試者的腫瘤樣品中的一種或多種癌基因重排的存在；以及給予對于具有任何檢測到的癌基因重排的腫瘤有效的癌癥治療。在一些實(shí)施方式中，本文所述的技術(shù)涉及確定需要治療癌癥的受試者是否會(huì)對給定的治療作出響應(yīng)的方法。因此，在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可涉及：檢測獲得自受試者的腫瘤樣品中的癌基因重排的存在；其中，如果檢測到存在癌基因重排，則所述受試者被確定為對靶向癌基因重排產(chǎn)物的治療作出響應(yīng)。

在一些實(shí)施方式中，受試者需要治療肺癌。在一些實(shí)施方式中，例如，當(dāng)樣品獲得自需要治療肺癌的受試者時(shí)，已知的靶序列可包含來自選自以下組的基因的序列：ALK、ROS 1和RET。因此，在一些實(shí)施方式中，基因重排引起涉及ALK、ROS 1或RET的融合。在例如，Soda等，Nature 2007 448561-6；Rikova等，Cell 2007 131:1190-1203；Kohno等，Nature Medicine 2012 18:375-7；Takouchi等，Nature Medicine 201218:378-81中對涉及ALK、ROS 1或RET的基因重排的非限制性實(shí)例進(jìn)行了描述，以引用的方式將它們整體并入本文。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，基因重排的精確位置和重排中涉及的第二基因的種類可以是事先未知的。因此，在本文所述的方法中，可以在不必知道重排的位置或基因重排中涉及的第二基因的種類的情況下，對此類重排的存在和種類進(jìn)行檢測。

在一些實(shí)施方式中，已知的靶序列可包含來自選自以下組的基因的序列：ALK、ROS1和RET。

在一些實(shí)施方式中，獲得自受試者的腫瘤的樣品中的ALK的基因重排的存在可說明所述腫瘤易受用選自于由以下所組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：ALK抑制劑、克唑替尼(PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802、ALK激酶活性的二氨基抑制劑和氨基嘧啶抑制劑(例如，NVP-TAE684和PF-02341066)(參見例如，Galkin等，Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:270-275；Zou等，Cancer Res，2007，67:4408-4417；Hallberg和Palmer F1000Med Reports 2011 3:21；以及Sakamoto等，Cancer Cell 2011 19:679-690)；以及WO 04/079326中公開的分子。以引用的方式將上述所有參考文獻(xiàn)整體并入本文。ALK抑制劑可包括降低ALK或其部分的表達(dá)和/或激酶活性的任何試劑，包括例如，降低ALK或其部分的表達(dá)和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“間變性淋巴瘤激酶”或“ALK”是指在野生型形式中通常在神經(jīng)元調(diào)節(jié)中涉及的跨膜酪氨酸激酶。許多物種的ALK基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:2(mRNA)，NCBI Gene ID:238)。

在一些實(shí)施方式中，獲得自受試者的腫瘤的樣品中ROS1的基因重排的存在可說明所述腫瘤易受用選自于由如下所組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：ROS1抑制劑和如上所述的ALK抑制劑(例如，克唑替尼)。ROS1抑制劑可包括降低ROS1或其部分的表達(dá)和/或激酶活性的任何試劑，包括例如，降低ROS 1或其部分的表達(dá)和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“c-ros癌基因1”或“ROS1”(在本領(lǐng)域中也稱為ROS-1)是指與PTPN6相互作用的sevenless亞家族的跨膜酪氨酸激酶。許多物種的ROS1基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:1(mRNA)，NCBI Gene ID:238)。

在一些實(shí)施方式中，獲得自受試者的腫瘤的樣品中的RET的基因重排的存在可說明所述腫瘤易受用選自于由以下所組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：RET抑制劑、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊馬替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素A(參見例如，Samadi等，Surgery 2010148:1228-36；Cuccuru等，JNCI 2004 13:1006-1014；Akeno-Stuart等，Cancer Research 2007 67:6956；Grazma等，J Clin Oncol 2010 28:15s 5559；Mologni等，J Mol Endocrinol 2006 37:199-212；Calmomagno等，Journal NCI 2006 98:326-334；Mologni.Curr Med Chem 2011 18:162-175；以及WO 06/034833、美國專利公開2011/0201598和美國專利8,067,434中公開的化合物)。以引用的方式將上述所有參考文獻(xiàn)整體并入本文。RET抑制劑可包括降低RET或其部分的表達(dá)和/或激酶活性的任何試劑，包括例如，降低RET或其部分的表達(dá)和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文所使用的“轉(zhuǎn)染重排(rearranged during transfection)”或“RET”是指鈣粘著蛋白超家族的受體酪氨酸激酶，其參與神經(jīng)嵴發(fā)育并識(shí)別神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族信號分子。許多物種的RET基因和mRNA的核苷酸序列是已知的，包括人(例如，SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4(mRNA)，NCBI Gene ID:5979)。

本文所述方法的應(yīng)用的進(jìn)一步非限制性實(shí)例包括檢測血液惡性腫瘤標(biāo)志物(hematological malignancy)及其組(panels)(例如，包括用于在淋巴瘤和白血病中檢測基因組重排的標(biāo)志物及其組)、檢測肉瘤相關(guān)的基因組重排及其組、以及檢測針對淋巴瘤測試的IGH/TCR基因重排及其組。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法涉及用癌癥治療劑來治療患有或被診斷為具有例如癌癥的受試者?；加邪┌Y的受試者可由醫(yī)師使用目前診斷癌癥的方法來鑒定。例如，表征這些病癥和有助于診斷的肺癌癥狀和/或并發(fā)癥是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于：呼吸微弱、鎖骨以上淋巴結(jié)腫大、肺部異常聲音、輕叩(tapped)胸部時(shí)有濁音(dullness)、以及胸部疼痛。可有助于診斷例如肺癌的測試包括但不限于X射線、對高水平特定物質(zhì)(例如，鈣)的血液測試、CT掃描和腫瘤活檢。肺癌家族病史或暴露于肺癌風(fēng)險(xiǎn)因素(例如，吸煙或暴露于煙霧和/或空氣污染)也可有助于確定受試者是否可能患有肺癌或有助于對肺癌進(jìn)行診斷。

癌癥可包括但不限于：惡性腫瘤(carcinoma)，包括腺癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、白血病、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、膽道癌、膀胱癌、腦癌(包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤)；乳腺癌、子宮頸癌、絨毛膜癌；結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜惡性腫瘤(endometrial carcinoma)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)；食道癌、胃癌；各種頭頸部癌、上皮內(nèi)腫瘤(包括Bowen病和佩吉特氏病)；血液腫瘤(包括急性淋巴細(xì)胞性白血病和急性髓細(xì)胞性白血病)；卡波濟(jì)氏肉瘤、毛細(xì)胞白血??；慢性髓細(xì)胞性白血病、AIDS相關(guān)的白血病和成人T細(xì)胞白血病淋巴瘤；腎癌(如腎細(xì)胞癌)、T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞性白血病/淋巴瘤、淋巴瘤(包括霍奇金病和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤)；肝癌(如肝惡性腫瘤和肝細(xì)胞瘤)、Merkel細(xì)胞惡性腫瘤、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)；卵巢癌(包括由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的卵巢癌)、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤)；胰腺癌；皮膚癌(包括黑色素瘤、基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞)；前列腺癌、直腸癌；外陰癌、腎癌(包括腺癌)；睪丸癌(包括胚腫瘤(例如，精原細(xì)胞瘤)、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、間質(zhì)瘤和生殖細(xì)胞腫瘤)；甲狀腺癌(包括甲狀腺腺癌和甲狀腺髓癌)；食道癌、唾液腺惡性腫瘤和Wilm氏腫瘤。在一些實(shí)施方式中，癌癥可為肺癌。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法包括向受試者給予有效量的本文所述的組合物(例如，癌癥治療劑)，以減輕癌癥癥狀。本文所使用的“減輕癌癥癥狀”為改善與癌癥相關(guān)的任何病癥或癥狀。相比等同的未治療對照，由任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)所測量的此類減少為至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。向受試者給予本文所述組合物的各種手段對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。此類方法可包括但不限于口服給予、腸胃外給予、靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、皮下給予、經(jīng)皮給予、氣道(氣霧劑)給予、肺部給予、皮膚給予、局部給予、注射給予或腫瘤內(nèi)給予。給予可以是局部的或全身的。本文所使用的術(shù)語“有效量”是指減輕疾病或紊亂的至少一種或多種癥狀所需的治療劑的量，并涉及足以提供期望效果的藥物組合物的量。因此，術(shù)語“治療上有效量”是指當(dāng)給予典型受試者時(shí)足以產(chǎn)生特定的抗癌效果的量。本文使用的有效量在不同的上下文中還可涵蓋足以延緩疾病癥狀發(fā)展的量、足以改變疾病癥狀進(jìn)程(例如但不限于，減緩疾病癥狀進(jìn)展)的量、或逆轉(zhuǎn)疾病癥狀的量。因此，指定精確的“有效量”通常是不實(shí)際的。然而，對于任何給定情況，適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊笨捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。任何特定劑量的效果可通過合適的生物測定進(jìn)行監(jiān)測。劑量可由醫(yī)師確定，并可在適當(dāng)時(shí)進(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)所觀測到的治療效果。

癌癥治療的非限制性實(shí)例可包括放射治療、外科手術(shù)、吉西他濱、順鉑(cisplastin)、紫杉醇、卡鉑、硼替佐米、AMG479、伏立諾他(vorinostat)、利妥昔單抗(rituximab)、替莫唑胺(temozolomide)、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化劑，例如，噻替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如，白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亞胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、硫代三乙烯磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenins)(特別是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特別是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成類似物、KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；軟海綿素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素，例如，烯二炔(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，特別是卡奇霉素γ1和卡奇霉素Ω1(參見例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸鹽(bisphosphonates)，例如，氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔抗生素生色團(tuán))，aclacinomysins，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博萊霉素，cactinomycin，carabicin，caminomycin，嗜癌霉素，chromomycinis，更生霉素，柔紅霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括嗎啉代阿霉素、菁基嗎啉代阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脫氧阿霉素)，表阿霉素，依索比星，伊達(dá)比星，麻西羅霉素，絲裂霉素(例如，絲裂霉素C)，麥考酚酸，諾加霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑菌素，鏈脲菌素，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物，例如，甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如，二葉甲酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤和三甲曲沙；嘌呤類似物，例如，氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如，安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，例如，卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺，例如，氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，例如，亞葉酸(frolinic acid)；乙葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物堿(maytansinoids)，例如，美登素(maytansine)和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；丙亞胺；根瘤菌素；sizofuran；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(特別是T-2毒素、verracurin A、漆斑菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉烷類，例如，紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法國)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，例如，順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；NAVELBINE.RTM.長春瑞濱；諾消靈；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；柔紅霉素；氨基喋呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康與5-FU和甲酰四氫葉酸的治療方案)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇，例如，視黃酸；卡培他濱；康普瑞?。患柞Ｋ臍淙~酸(LV)；奧沙利鉑，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb.RTM)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼)和VEGF-A的抑制劑(減少細(xì)胞增殖)，以及以上任何物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。此外，治療方法可進(jìn)一步包括使用放射物或放射療法。此外，治療方法可進(jìn)一步包括使用外科手術(shù)治療。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法可適用于重測序，例如，用于確認(rèn)由大量核酸的非定向測序獲得的特別相關(guān)的、低質(zhì)量和/或復(fù)雜的序列。以非限制性實(shí)例的方式，本文所述的方法可使得能夠：進(jìn)行靶向疾病基因組(例如，10-100個(gè)基因)的定向和/或靶向重測序；進(jìn)行重測序以確認(rèn)在大規(guī)模測序項(xiàng)目中獲得的變體；進(jìn)行全外顯子組(whole exome)重測序；和/或進(jìn)行用于檢測單核甘酸變體、多核苷酸變體、插入、缺失、拷貝數(shù)變化以及甲基化狀態(tài)的靶向重測序。

在一些實(shí)施方式中，本文所述的方法可使得能夠進(jìn)行微生物群(microbiota)測序、古代樣品(ancient sample)測序和/或新變異病毒基因分型。

為方便起見，下文提供了在說明書、實(shí)施例以及所附權(quán)利要求中使用的一些術(shù)語和短語的含義。除非另有說明或在上下文中有所暗示，下列術(shù)語和短語包括下文提供的含義。提供所述定義以輔助描述具體實(shí)施方式，而由于本發(fā)明的范圍僅受權(quán)利要求所限，因此并不意味著限制所請求保護(hù)的發(fā)明。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。如果在本領(lǐng)域中術(shù)語的使用和本文所提供的術(shù)語定義之間存在明顯不一致，應(yīng)以本說明書中所提供的定義為準(zhǔn)。

為方便起見，在此收集了在說明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中采用的某些術(shù)語。

本文使用的術(shù)語“降低(decrease)”、“減少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”通常都意味著統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著量的降低。然而，為避免疑義，“減少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”表示相比參比水平降低至少10％，例如，降低至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或多至并包括降低100％(例如，相比參比樣品的缺失水平或不可檢測水平)、或相比參比水平降低在10％到100％之間的任意量。在標(biāo)志物(marker)或癥狀(symptom)的情況下，意味著此類水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。例如，所述降低可為至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并優(yōu)選降至被認(rèn)為是無此種紊亂的個(gè)體的正常范圍內(nèi)的水平。

本文使用的術(shù)語“增加(increased/increase)”、“增強(qiáng)(enhance)”或“活化(activate)”通常都意味著統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著量的增加；為避免疑義，術(shù)語“增加(increased/increase)”、“增強(qiáng)(enhance)”或“活化(activate)”表示相比參比水平增加至少10％，例如，增加至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％、或多至并包括增加100％、或相比參比水平增加在10％到100％之間的任意量；或相比參比水平至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約10倍的增加、或在2倍和10倍之間的任意量的增加、或是更大量的增加。

本文所使用的術(shù)語“受試者”是指人或動(dòng)物。通常，所述動(dòng)物為脊椎動(dòng)物，如靈長類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、家畜或狩獵動(dòng)物(game animal)。靈長類動(dòng)物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和獼猴(如恒河猴)。嚙齒動(dòng)物包括小鼠、大鼠、旱獺(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和倉鼠。家畜和狩獵動(dòng)物包括牛(cows)、馬、豬、鹿、野牛、水牛、貓科物種(如，家貓)、犬科物種(如，狗、狐貍、狼)、鳥類物種(如，雞、鴯鹋(emu)、鴕鳥)和魚類(如，鱒魚(trout)、鯰魚和鮭魚)。在一些實(shí)施方式中，受試者為哺乳動(dòng)物，例如，靈長類動(dòng)物、如人類。術(shù)語“個(gè)體”、“患者”和“受試者”在本文中可互換使用。

優(yōu)選地，受試者為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可為人、非人靈長類動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限于這些實(shí)例。除人以外的哺乳動(dòng)物可有利于用作代表例如肺癌的動(dòng)物模型的受試者。受試者可以為雄性或雌性。

受試者可為先前已被診斷患有或鑒定為遭受或患有需要治療的病癥(例如，癌癥)或者與此種病癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的受試者，并且所述受試者任選已接受對所述病癥或者與所述病癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的治療?；蛘?，受試者還可為先前未曾被診斷為患有所述病癥(例如，癌癥)或者與所述病癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的受試者。例如，受試者可為表現(xiàn)出針對所述病癥或與所述病癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者，或者可為并未表現(xiàn)出風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者。

對于特定病癥的治療“有需要的受試者”可為患有該病癥、被診斷為患有該病癥、或處于發(fā)展為該病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。

本文所使用的“與遺傳改變相關(guān)的疾病”指的是至少部分由相對于健康野生型受試者而言受試者的遺傳物質(zhì)的改變(例如，缺失、插入、SNP、基因重排)引起的任何疾病。如果改變增加受試者發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)、增加受試者對疾病(包括傳染性疾病或具有傳染性組分的疾病)的易感性、引起疾病相關(guān)分子的產(chǎn)生、或使細(xì)胞變?yōu)榛疾〉幕虿徽５?例如，癌細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控的缺失)，疾病可至少部分由受試者遺傳物質(zhì)中的所述改變引起。疾病可與多種遺傳改變相關(guān)，例如，癌癥。

本文所使用的術(shù)語“核酸”是指并入核糖核酸、脫氧核糖核酸或其類似物單元的任何分子、優(yōu)選聚合分子。所述核酸可為單鏈的或雙鏈的。單鏈核酸可為變性雙鏈DNA的一條鏈的核酸?；蛘?，單鏈核酸可為不來源于任何雙鏈DNA的單鏈核酸。在一個(gè)方面，模板核酸為DNA。在另一方面，模板為RNA。合適的核酸分子為DNA，包括基因組DNA或cDNA。其它合適的核酸分子為RNA，包括mRNA。

在核酸的情況下，本文所使用的術(shù)語“分離的”或“部分純化的”是指從與在其天然來源中見到的核酸一起存在的至少一種其它成分(例如，核酸或多肽)中分離出的核酸；和/或從當(dāng)通過細(xì)胞表達(dá)時(shí)與核酸一起存在的至少一種其它成分(例如，核酸或多肽)中分離出的核酸。化學(xué)合成的核酸或使用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯合成的核酸被認(rèn)為是“分離的”。

本文所使用的術(shù)語“互補(bǔ)”是指核苷酸形成氫鍵堿基配對的能力。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)是指核苷酸堿基G、A、T、C和U之間的氫鍵堿基配對形成偏好，從而使得當(dāng)兩種給定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火時(shí)，在DNA中A與T配對、G與C配對，在RNA中G與C配對、A與U配對。本文所使用的“基本上互補(bǔ)”是指核酸分子或其部分(例如，引物)在所述分子或其部分的全長上與第二核苷酸序列具有至少90％的互補(bǔ)性，例如，90％互補(bǔ)、95％互補(bǔ)、98％互補(bǔ)、99％互補(bǔ)或100％互補(bǔ)。本文所使用的“基本上相同”是指核酸分子或其部分在所述分子或其部分的全長上與第二核苷酸序列具有至少90％的一致性，例如，90％一致性、95％一致性、98％一致性、99％一致性或100％一致性。

在靶核酸的特異性引物的情況下，本文所使用的“特異的”指引物與靶標(biāo)之間的互補(bǔ)性水平，從而使得存在如下的退火溫度：在該退火溫度時(shí)，引物將退火至所述靶核酸并介導(dǎo)所述靶核酸的擴(kuò)增、而并不退火至樣品中存在的非靶序列或介導(dǎo)樣品中存在的非靶序列的擴(kuò)增。

本文所使用的“擴(kuò)增產(chǎn)物(amplified product/amplification product)”或“擴(kuò)增子(amplicon)”是指由擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的寡核苷酸，所述寡核苷酸是特定靶核酸模板鏈和/或其互補(bǔ)序列的一部分的拷貝，其在核苷酸序列上對應(yīng)于模板核酸序列和/或其互補(bǔ)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)一步包含對引物而言特異性的序列和位于序列(其為所述靶核酸和/或其互補(bǔ)物的一部分)側(cè)翼的序列。雖然可以指代其單個(gè)鏈，本文所述的擴(kuò)增產(chǎn)物通常將為雙鏈DNA。

本文所使用的核酸分子的“部分(portion)”是指由該分子包含的核苷酸的鄰近集合。部分可包含由該分子包含的核苷酸的全部或僅子集。部分可為雙鏈的或單鏈的。

本文所使用的術(shù)語“治療(treat/treatment/treating)”或“改善(amelioration)”是指治療處理，其中，目的是扭轉(zhuǎn)、減輕、改善、抑制、減緩或停止與疾病或紊亂(例如，肺癌)相關(guān)的病癥的進(jìn)展或嚴(yán)重程度。術(shù)語“治療”包括減少或減輕病癥、與病癥有關(guān)的疾病或紊亂的至少一種不良影響或癥狀。如果一種或多種癥狀或臨床標(biāo)志物得到減少，則治療通常是“有效”的?；蛘?，如果疾病進(jìn)展得到減少或停止，則治療是“有效”的。也就是說，“治療”不僅包括癥狀或標(biāo)志物的改善，也包括與未進(jìn)行治療時(shí)所預(yù)期的情況相比而言癥狀進(jìn)展或惡化的中止或至少延緩。有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于：減輕一種或多種癥狀、降低疾病程度、穩(wěn)定(即，不惡化)疾病狀態(tài)、延遲或延緩疾病進(jìn)展、改善或緩和(palliation)疾病狀態(tài)、緩解(部分或全部)、和/或降低死亡率，無論上述結(jié)果是可檢測的還是不可檢測的。術(shù)語“治療”疾病還包括提供疾病的癥狀或不良影響的舒緩(包括姑息治療(palliative treatment))。

術(shù)語“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(statistically significant)”或“顯著地(significantly)”是指統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且通常意味著低于正常標(biāo)志物濃度兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(2SD)或更低。

除了在操作實(shí)施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反應(yīng)條件的全部數(shù)值在所有情況下都應(yīng)該被理解為被術(shù)語“約”修飾。與百分比相連使用的術(shù)語“約”可意味著±1％。

本文所使用的術(shù)語“包含/包括(comprising或comprises)”用于表示對方法或組合物而言必要的組合物、方法及其各自的組成部分，并且無論是否必要都仍然對未指定的要素保持開放。

術(shù)語“由…組成”涉及本文所述的組合物、方法及其各自的組成部分，排除沒有在實(shí)施方式描述中詳述的任何要素。

本文所使用的術(shù)語“基本上由…組成”涉及給定實(shí)施方式所需的那些元素。該術(shù)語允許存在實(shí)質(zhì)上不影響該實(shí)施方式的基礎(chǔ)和新穎性或起作用的特征的元素。

除非上下文中明確地另有所指，單數(shù)術(shù)語“一(a/an)”和“該/所述(the)”涵蓋復(fù)數(shù)的所指物。相似地，除非上下文中明確地另有所指，單詞“或(or)”意在涵蓋“和(and)”。盡管與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本公開的實(shí)踐或測試中，合適的方法和材料在下文有所描述?？s寫“e.g.”源自拉丁文的例如，(exempli gratia)，并在本文中用于表示非限制性實(shí)例。因此，縮寫“e.g.”與術(shù)語“例如，(for example)”同義。

細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義可以在如下中找到：“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(著)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)。分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義還可在如下中找到：Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等(著)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Current Protocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等著。

除非另有說明，使用例如在如下中所述的標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行本發(fā)明：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)；以及Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing,Inc.，New York，USA(1995)，以引用的方式將它們整體全部并入本文。

其它術(shù)語在本發(fā)明各個(gè)方面的描述中進(jìn)行定義。

出于描述和公開的目的，在此以引用的方式將本申請通篇所引用的所有專利與其它出版物(包括參考文獻(xiàn)、授權(quán)專利、公開的專利申請以及共同的未決(co-pending)專利申請)明確地并入本文，例如，在此類出版物中描述的可用于本文所述技術(shù)的方法學(xué)。這些出版物僅僅由于它們的公開早于本申請的申請日而提供。在這一方面不應(yīng)當(dāng)視作承認(rèn)本發(fā)明人沒有權(quán)利借助于先前的發(fā)明或因?yàn)槿魏纹渌蚨鴮⒐_的內(nèi)容提前。所有關(guān)于這些文件的日期的聲明或這些文件的內(nèi)容的表述是基于申請人可得的信息，并不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或這些文件的內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。

對本公開的實(shí)施方式的描述不意味著窮舉或?qū)⒈竟_限制在所公開的確切形式。盡管本文出于說明目的對本公開的具體實(shí)施方式和實(shí)施例進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可在本公開范圍內(nèi)作出多種等同修改。例如，雖然將方法步驟或功能以給定順序給出，其它實(shí)施方式可以不同順序來實(shí)施功能、或可以基本上同時(shí)實(shí)施這些功能。本文所提供的本公開的教導(dǎo)可以適當(dāng)?shù)姆绞綉?yīng)用于其它程序或方法。可將本文所述的各種實(shí)施方式組合以提供進(jìn)一步的實(shí)施方式。如果適當(dāng)?shù)脑?，可對本公開的方面進(jìn)行修改，以利用上述參考和應(yīng)用的組合物、功能和構(gòu)思來提供本公開更進(jìn)一步的實(shí)施方式。可根據(jù)詳細(xì)描述來對本公開進(jìn)行上述改變和其它改變。所有此類修改都落入所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

任何前述實(shí)施方式中的具體要素均可進(jìn)行組合或替代其它實(shí)施方式中的要素。此外，盡管與本公開的特定實(shí)施方式相關(guān)的優(yōu)勢已經(jīng)在這些實(shí)施方式的上下文中描述，其它實(shí)施方式也可表現(xiàn)出此類優(yōu)勢，但不是所有實(shí)施方式都必須展現(xiàn)出此類優(yōu)勢，才能落入本公開的范圍。

本文所述的技術(shù)進(jìn)一步由以下實(shí)施例予以說明，但決不應(yīng)當(dāng)理解為本文所述的技術(shù)被進(jìn)一步限定。

可根據(jù)以下編號段落的任一段對本文所述技術(shù)的一些實(shí)施方式進(jìn)行定義：

1.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與起始靶特異性引物接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用所述靶核酸分子作為模板；

(c)在雜交條件下，使所述步驟(b)的產(chǎn)物與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(f)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由所述步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

2.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(c)在雜交條件下，使所述步驟(b)的產(chǎn)物與起始靶特異性引物接觸；

(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用所述靶核酸分子作為模板；

(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(f)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于所述第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

3.如段落1-2中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在所述起始靶特異性引物的延伸之后，使所述樣品和產(chǎn)物與RNase接觸的步驟。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述加尾隨機(jī)引物可形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。

5.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，所述起始靶特異性引物和所述第一靶特異性引物相同。

6.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，在與第一測序引物相同的5’核酸序列和含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列之間，所述加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的條形碼部分。

7.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(c)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(d)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(e)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(d)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列、含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的中間的條形碼部分以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由所述步驟(c)產(chǎn)生的所述擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于所述第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

8.如段落7所述的方法，其中，在與第一測序引物相同的所述5’核酸序列和含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的所述3’核酸序列之間，所述各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含間隔區(qū)核酸序列。

9.如段落7或8所述的方法，其中，在延伸步驟之后，將未雜交的引物從反應(yīng)中去除。

10.如段落7-9中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物相對于所述第一尾引物通過至少3個(gè)核苷酸嵌套。

11.如段落7-10中任一段所述的方法，其中，所述第一靶特異性引物進(jìn)一步包含5’標(biāo)簽序列部分，所述5’標(biāo)簽序列部分包含基本上不與任何引物的任何其它部分互補(bǔ)或基本上不與任何引物的任何其它部分相同的高GC含量的核酸序列。

12.如段落7-11中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物與全長的第一測序引物相同。

13.如段落7-12中任一段所述的方法，其中，特異性地退火至已知靶標(biāo)的所述靶特異性引物的部分將在PCR緩沖液中于約65℃的溫度下特異性地退火。

14.如段落7-13中任一段所述的方法，其中，所述樣品包含基因組DNA。

15.如段落7-14中任一段所述的方法，其中，所述樣品包含RNA，且所述方法進(jìn)一步包括使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄酶方案的第一步驟。

16.如段落7-15中任一段所述的方法，其中，存在于所述樣品中的所述核酸未經(jīng)受剪切或消化。

17.如段落7-16中任一段所述的方法，其中，所述樣品包含單鏈gDNA或單鏈cDNA。

18.如段落7-17中任一段所述的方法，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶方案包括隨機(jī)六聚體的使用。

19.如段落7-18中任一段所述的方法，其中，基因重排包括所述已知的靶序列。

20.如段落19所述的方法，其中，所述基因重排存在于選自于由基因組DNA、RNA和cDNA所組成的組中的核酸中。

21.如段落19-20中任一段所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。

22.如段落21所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。

23.如段落7-22中任一段所述的方法，其中，通過下一代測序法對所述核酸產(chǎn)物進(jìn)行測序。

24.如段落23所述的方法，其中，所述下一代測序法包括選自于由如下所組成的組中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大規(guī)模平行簽名測序、固相可逆染料終止物測序以及DNA納米球測序。

25.如段落7-24中任一段所述的方法，其中，第一測序引物和第二測序引物兼容所選的下一代測序法。

26.如段落7-25中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使所述樣品或所述樣品的單獨(dú)部分與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。

27.如段落7-26中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使包含所述樣品的單一反應(yīng)混合物與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。

28.如段落7-27中任一段所述的方法，其中，多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至由單獨(dú)的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。

29.如段落7-28中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。

30.如段落7-29中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的單個(gè)基因的不同部分。

31.如段落7-30中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同的外顯子。

32.如段落7-31中任一段所述的方法，其中，多個(gè)第一靶特異性引物包含相同的5’標(biāo)簽序列部分。

33.如段落7-32中任一段所述的方法，其中，加尾隨機(jī)引物群中的各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含相同的樣品條形碼化部分。

34.如段落33所述的方法，其中，使多種樣品各自與具有樣品條形碼化部分的單獨(dú)的加尾隨機(jī)引物群接觸；其中，加尾隨機(jī)引物群各自具有不同的樣品條形碼化部分；并且其中，在步驟(b)之后將所述樣品合并。

35.如段落7-34中任一段所述的方法，其中，各擴(kuò)增步驟包括長度為5個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。

36.如段落7-35中任一段所述的方法，其中，對所述靶特異性引物和所述尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使它們在約61℃-72℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。

37.如段落7-36中任一段所述的方法，其中，對所述靶特異性引物和所述尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使它們在約65℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。

38.如段落7-37中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸分子來自樣品，任選地所述樣品是獲得自受試者的生物樣品。

39.如段落38所述的方法，其中，所述樣品獲得自需要治療與遺傳改變相關(guān)的疾病的受試者。

40.如段落39所述的方法，其中，所述疾病為癌癥。

41.如段落38所述的方法，其中，所述樣品包括腫瘤細(xì)胞群。

42.如段落38所述的方法，其中，所述樣品是腫瘤活檢物。

43.如段落40所述的方法，其中，所述癌癥為肺癌。

44.如段落7-43中任一段所述的方法，其中，與疾病相關(guān)的基因包含所述已知的靶序列。

45.如段落38所述的方法，其中，所述樣品中的基因重排產(chǎn)物包含所述已知的靶序列。

46.如段落45所述的方法，其中，所述基因重排產(chǎn)物是癌基因。

47.一種制備用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

(a)在促進(jìn)模板特異性雜交和所述靶特異性引物的延伸的條件下，使包含靶核酸的第一鏈的核酸模板與包含靶特異性雜交序列的互補(bǔ)的靶特異性引物接觸；以及

(b)在促進(jìn)模板特異性雜交和多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸的條件下，使包含與所述靶核酸的第一鏈互補(bǔ)的第二鏈的核酸模板與共享如下共同序列的多個(gè)不同引物接觸，所述共同序列為不同的雜交序列的5’端；

其中，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物同時(shí)包含具有靶特異性引物特征的序列和具有多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的特征的序列。

48.如段落47所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。

49.如段落47所述的方法，其中，所述靶核酸是脫氧核糖核酸。

50.如段落47-49中任一段所述的方法，其中，順序進(jìn)行步驟(a)和步驟(b)。

51.如段落47-50中任一段所述的方法，其中，步驟(a)中的所述核酸模板包含從步驟(b)中的多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。

52.如段落47-50中任一段所述的方法，其中，步驟(b)中的所述核酸模板包含步驟(a)中的所述靶特異性引物的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。

53.如段落48所述的方法，其中，所述靶核酸是編碼自包含基因重排的染色體片段的信使RNA。

54.如段落49所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色體片段。

55.如段落48所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。

56.如段落47-55中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

57.如段落47-55中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在雜交發(fā)生在所述延伸產(chǎn)物和固定的寡核苷酸之間的條件下，使所述延伸產(chǎn)物或擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物與固定的寡核苷酸接觸。

58.如前述段落中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的側(cè)翼部分。

59.如段落58所述的方法，其中，不同的雜交序列與所述側(cè)翼部分互補(bǔ)。

60.如段落58或59中任一段所述的方法，其中，所述靶特異性雜交序列與所述靶部分互補(bǔ)。

61.如段落47-60中任一段所述的方法，其中，所述靶特異性引物進(jìn)一步包含：所述靶特異性雜交序列的5’端；條形碼序列、接頭序列和索引序列的至少一個(gè)。

62.如段落47-60中任一段所述的方法，其中，所述共同序列包括條形碼序列、接頭序列和索引序列的至少一個(gè)。

63.如段落1-62中任一段所述的方法，其中，所述接頭序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接頭序列。

可根據(jù)以下編號段落的任一段對本文所述技術(shù)的一些實(shí)施方式進(jìn)行定義：

1.一種制備用于分析的核酸的方法，所述方法包括：

(a)在促進(jìn)模板特異性雜交和靶特異性引物的延伸的條件下，使包含靶核酸的第一鏈的核酸模板與包含靶特異性雜交序列的互補(bǔ)的靶特異性引物接觸；以及

(b)在促進(jìn)模板特異性雜交和多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸的條件下，使包含與所述靶核酸的第一鏈互補(bǔ)的第二鏈的核酸模板與共享如下共同序列的多個(gè)不同引物接觸，所述共同序列為不同雜交序列的5’端；

其中，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物同時(shí)包含具有靶特異性引物特征的序列和具有多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的特征的序列。

2.如段落1所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。

3.如段落1所述的方法，其中，所述靶核酸是脫氧核糖核酸。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，順序進(jìn)行步驟(a)和步驟(b)。

5.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，步驟(a)中的所述核酸模板包含從步驟(b)中的所述多個(gè)不同引物的至少一個(gè)的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。

6.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，步驟(b)中的所述核酸模板包含步驟(a)中的所述靶特異性引物的延伸和雜交產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物。

7.如段落2所述的方法，其中，所述靶核酸是編碼自包含基因重排的染色體片段的信使RNA。

8.如段落3所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色體片段。

9.如段落8所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。

10.如段落1-9中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括對所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

11.如段落1-9中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在雜交發(fā)生在所述延伸產(chǎn)物和固定的寡核苷酸之間的條件下，使所述延伸產(chǎn)物或擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物與固定的寡核苷酸接觸。

12.如前述段落中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的側(cè)翼部分。

13.如段落12所述的方法，其中，不同的雜交序列與所述側(cè)翼部分互補(bǔ)。

14.如段落12或13所述的方法，其中，所述靶特異性雜交序列與所述靶部分互補(bǔ)。

15.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，所述靶特異性引物進(jìn)一步包含：所述靶特異性雜交序列的5’端；條形碼序列、接頭序列和索引序列的至少一個(gè)。

16.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，所述共同序列包括條形碼序列、接頭序列和索引序列的至少一個(gè)。

17.如段落15或16所述的方法，其中，所述接頭序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接頭序列。

18.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與起始靶特異性引物接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用所述靶核酸分子作為模板；

(c)在雜交條件下，使所述步驟(b)的產(chǎn)物與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用所述雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自所述步驟(f)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，所述加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由所述步驟(e)產(chǎn)生的所述擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于所述第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

19.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(c)在雜交條件下，使步驟(b)的產(chǎn)物與起始靶特異性引物接觸；

(d)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的起始靶特異性引物啟動(dòng)并使用所述靶核酸分子作為模板；

(e)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(f)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(e)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(g)使用第一測序引物和第二測序引物對來自步驟(f)的所述擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，所述加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由所述步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于所述第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

20.如段落18-19中任一段所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在所述起始靶特異性引物的延伸之后，使所述樣品和產(chǎn)物與RNase接觸的步驟。

21.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述加尾隨機(jī)引物可形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。

22.如段落1-4中任一段所述的方法，其中，所述起始靶特異性引物和所述第一靶特異性引物相同。

23.如段落1-5中任一段所述的方法，其中，在與第一測序引物相同的所述5’核酸序列和含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的所述3’核酸序列之間，所述加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的條形碼部分。7.一種確定與已知的靶核苷酸序列鄰近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)在雜交條件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子與加尾隨機(jī)引物群接觸；

(b)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)通過雜交的加尾隨機(jī)引物啟動(dòng)并使用所述雜交位點(diǎn)下游的所述靶核酸分子的一部分作為模板；

(c)用第一尾引物和第一靶特異性引物對所述靶核酸分子的一部分和所述加尾隨機(jī)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增；

(d)用第二尾引物和第二靶特異性引物對所述步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分進(jìn)行擴(kuò)增；

(e)使用第一測序引物和第二測序引物對來自所述步驟(d)的擴(kuò)增部分進(jìn)行測序；

其中，所述加尾隨機(jī)引物群包括單鏈寡核苷酸分子，所述單鏈寡核苷酸分子具有與第一測序引物相同的5’核酸序列、含有6個(gè)-12個(gè)隨機(jī)核苷酸的中間的條形碼部分以及含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的3’核酸序列；

其中，所述第一靶特異性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火溫度下能夠特異性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；

其中，所述第二靶特異性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能夠特異性地退火至由所述步驟(c)產(chǎn)生的擴(kuò)增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含與第二測序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特異性引物相對于所述第一靶特異性引物嵌套；

其中，所述第一尾引物包含與所述加尾隨機(jī)引物相同的核酸序列；以及

其中，所述第二尾引物包含與所述第一測序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相對于所述第一尾引物嵌套。

24.如段落23所述的方法，其中，在與第一測序引物相同的所述5’核酸序列和含有約6個(gè)-約12個(gè)隨機(jī)核苷酸的所述3’核酸序列之間，所述各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含間隔區(qū)核酸序列。

25.如段落23或24所述的方法，其中，在延伸步驟之后，將未雜交的引物從所述反應(yīng)中去除。

26.如段落23-25中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物相對于所述第一尾引物通過至少3個(gè)核苷酸嵌套。

27.如段落23-26中任一段所述的方法，其中，所述第一靶特異性引物進(jìn)一步包含5’標(biāo)簽序列部分，所述5’標(biāo)簽序列部分包含基本上不與任何引物的任何其它部分互補(bǔ)或基本上不與任何引物的任何其它部分相同的高GC含量的核酸序列。

28.如段落23-27中任一段所述的方法，其中，所述第二尾引物與所述全長的第一測序引物相同。

29.如段落23-28中任一段所述的方法，其中，特異性地退火至所述已知靶標(biāo)的所述靶特異性引物的部分將在PCR緩沖液中于約65℃的溫度下特異性地退火。

30.如段落23-29中任一段所述的方法，其中，所述樣品包含基因組DNA。

31.如段落23-30中任一段所述的方法，其中，所述樣品包含RNA，且所述方法進(jìn)一步包括使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄酶方案的第一步驟。

32.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，存在于所述樣品中的所述核酸未經(jīng)受剪切或消化，或者其中，所述樣品包含單鏈gDNA或單鏈cDNA。

33.如段落23-32中任一段所述的方法，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶方案包括隨機(jī)六聚體的使用。

34.如段落23-33中任一段所述的方法，其中，基因重排包括所述已知的靶序列。

35.如段落34所述的方法，其中，所述基因重排存在于選自于由基因組DNA、RNA和cDNA所組成的組中的核酸中。

36.如段落34-35中任一段所述的方法，其中，所述基因重排包括癌基因。

37.如段落36所述的方法，其中，所述基因重排包括融合癌基因。

38.如段落23-37中任一段所述的方法，其中，通過下一代測序法對所述核酸產(chǎn)物進(jìn)行測序。

39.如段落38所述的方法，其中，所述下一代測序法包括選自于由如下所組成的組中的方法：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454、大規(guī)模平行簽名測序、固相可逆染料終止物測序以及DNA納米球測序。

40.如段落23-39中任一段所述的方法，其中，第一測序引物和第二測序引物兼容所選的下一代測序法。

41.如段落23-40中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使所述樣品或所述樣品的單獨(dú)部分與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。

42.如段落23-41中任一段所述的方法，其中，所述方法包括使包含所述樣品的單一反應(yīng)混合物與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。

43.如段落23-42中任一段所述的方法，其中，多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至由單獨(dú)的基因所包含的已知的靶核苷酸序列。

44.如段落23-43中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至已知的靶核苷酸序列的不同部分。

45.如段落23-44中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的單個(gè)基因的不同部分。

46.如段落23-45中任一段所述的方法，其中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物特異性地退火至含有已知的靶核苷酸序列的基因的不同的外顯子。

47.如段落23-46中任一段所述的方法，其中，多個(gè)第一靶特異性引物包含相同的5’標(biāo)簽序列部分。

48.如段落23-47中任一段所述的方法，其中，加尾隨機(jī)引物群中的各加尾隨機(jī)引物進(jìn)一步包含相同的樣品條形碼化部分。

49.如段落48所述的方法，其中，使多種樣品各自與具有樣品條形碼化部分的單獨(dú)的加尾隨機(jī)引物群接觸；其中，加尾隨機(jī)引物群各自具有不同的樣品條形碼化部分；并且其中，在步驟(b)之后，將所述樣品合并。

50.如段落23-49中任一段所述的方法，其中，各擴(kuò)增步驟包括長度為5個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增方案循環(huán)組。

51.如段落23-50中任一段所述的方法，其中，對所述靶特異性引物和所述尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使它們在約61℃-72℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。

52.如段落23-51中任一段所述的方法，其中，對所述靶特異性引物和所述尾引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而使它們在約65℃的退火溫度下特異性地退火至它們的互補(bǔ)序列。

53.如段落23-52中任一段所述的方法，其中，所述靶核酸分子來自樣品，任選地所述樣品是獲得自受試者的生物樣品。

54.如段落53所述的方法，其中，所述樣品獲得自需要治療與遺傳改變相關(guān)的疾病的受試者。

55.如段落54所述的方法，其中，所述疾病為癌癥。

56.如段落53所述的方法，其中，所述樣品包括腫瘤細(xì)胞群。

57.如段落53所述的方法，其中，所述樣品是腫瘤活檢物。

58.如段落55所述的方法，其中，所述癌癥為肺癌。

59.如段落23-58中任一段所述的方法，其中，與疾病相關(guān)的基因包含所述已知的靶序列。

60.如段落53所述的方法，其中，所述樣品中的基因重排產(chǎn)物包含所述已知的靶序列。

61.如段落60所述的方法，其中，所述基因重排產(chǎn)物是癌基因。

實(shí)施例

實(shí)施例1：使用逆轉(zhuǎn)錄酶與加尾隨機(jī)寡核苷酸和基因特異性寡核苷酸來擴(kuò)增3’融合事件的方法

第一鏈合成

作為對擴(kuò)增用于序列分析的3’融合事件而言的第一步，從分離自受試者的樣品中獲得RNA。將以下反應(yīng)集合在冰上，以合成第一cDNA鏈：

●12μl純化RNA和H₂O

●2μl 1.2μg/μl隨機(jī)引物#1(9mer)

●2μl dNTP

將反應(yīng)轉(zhuǎn)移至熱循環(huán)儀，并在65℃下孵育5分鐘。然后，將反應(yīng)離心，并在冰上孵育至少一分鐘。

對于上述反應(yīng)而言，在冰上準(zhǔn)備如下：

●2μl 10X M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液

●1μl 40U/μl RNase抑制劑

●1μl 200U/μl M-MuLV酶

將反應(yīng)混合并短暫離心，以收集在管底部的反應(yīng)物質(zhì)，然后放回冰上。然后將反應(yīng)在42℃下孵育60分鐘，隨后在4℃下孵育。

ExoI處理

將如下添加至上述反應(yīng)，

●1μl 20U/μl核酸外切酶I

將反應(yīng)混合并短暫離心，以收集在管底部的反應(yīng)物質(zhì)，然后在37℃下孵育10分鐘。接著，加入1.28μl的1N NaOH，并通過上下吹吸混合，然后離心以收集物質(zhì)。將反應(yīng)在80℃孵育10分鐘，然后加入4μl 10mM Tris(pH 8.3)，并通過上下吹吸混合。在冰上將20μl的經(jīng)核酸外切酶處理的DNA溶液轉(zhuǎn)移至的新的200μl PCR管。

第二鏈cDNA合成

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自以上的20μl DNA溶液

●11μl無核酸酶的H₂O

●4μl 10X PCR緩沖液II

●4μl 3μM基因特異性引物#1

●1μl 0.5mM dNTP

通過上下吹吸將反應(yīng)混合，然后短暫離心以收集物質(zhì)，并置于冰上。然后將反應(yīng)在95℃下孵育3分鐘，然后在22℃下孵育10秒，接著在4℃下孵育，直至進(jìn)行下一步驟。將反應(yīng)在冰上孵育至少一分鐘。

將如下添加至反應(yīng)：

●1μl 400U/μl Manta 1.0DNA聚合酶(高濃度)

將反應(yīng)在25℃下孵育10秒，然后在70℃下孵育10分鐘，并保持在4℃下直至進(jìn)行下一步驟。

用AMPure珠#1純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●88.4μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的12μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將珠轉(zhuǎn)移至新的管。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在一些實(shí)施方式中，珠與反應(yīng)混合物的比例可影響返回片段的大小。在一些實(shí)施方式中，就融合檢測而言，所有片段或基本上所有片段均長于60nt(例如，融合斷點(diǎn)或結(jié)點(diǎn)各側(cè)上30nt)，從而能夠容易地識(shí)別各基因。

擴(kuò)增#1

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自上述純化#1的10μl純化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start緩沖液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_條形碼引物

●2μl 3μM基因特異性引物#1

●0.5單元-2單元的聚合酶(例如，Pheonix Hot Start Taq，VeraSeq)

按照如下對反應(yīng)進(jìn)行孵育：

●步驟1：95℃孵育3分鐘

●步驟2：95℃孵育30秒

●步驟3：65℃孵育5分鐘，返回至步驟2共14個(gè)循環(huán)

●步驟4：72℃孵育2分鐘

●步驟5：4℃，直至將方案進(jìn)行下去

用AMPure珠#2純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●36.4μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的9μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將磁珠轉(zhuǎn)移至新的管。

擴(kuò)增#2

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自上述純化#2的8.5μl純化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start緩沖液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_29bp引物

●2μl 10μM P7條形碼引物

●2μl 3μM基因特異性引物#2

●0.2μl 5U/μl Phoenix Hot Start Taq聚合酶

●2μl 10μM P7條形碼引物

按照如下對反應(yīng)進(jìn)行孵育：

●步驟1：95℃孵育3分鐘

●步驟2：95℃孵育30秒

●步驟3：65℃孵育5分鐘，返回至步驟2共14個(gè)循環(huán)

●步驟4：72℃孵育2分鐘

●步驟5：4℃，直至將方案進(jìn)行下去

用AMPure珠#3純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●37.3μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將磁珠轉(zhuǎn)移至新的管。

文庫濃度的定量

使用Illumina的Kapa Biosystems qPCR試劑盒，以對使用上述方案制備的各文庫的濃度進(jìn)行定量。將條形碼化的文庫以等摩爾濃度合并。然后按照制造商的說明，使用MiSeq v2 300循環(huán)試劑盒，以XpM將文庫加載到Illumina MiSeq上。使用2x150bp讀取段(具有7個(gè)堿基編碼的索引讀取段)對樣品進(jìn)行測序。

實(shí)施例2：使用逆轉(zhuǎn)錄酶與基因特異性寡核苷酸和加尾隨機(jī)寡核苷酸來擴(kuò)增5’融合事件的方法

第一鏈合成

作為對擴(kuò)增用于序列分析的5’融合事件而言的第一步，從分離自受試者的樣品中獲得RNA。將以下反應(yīng)集合在冰上，以合成第一cDNA鏈：

●12μl純化RNA和H₂O

●2μl基因特異性引物#1

●2μl dNTP

將反應(yīng)轉(zhuǎn)移至熱循環(huán)儀，并在65℃下孵育5分鐘。然后，將反應(yīng)離心，并在冰上孵育至少一分鐘。

對于上述反應(yīng)而言，在冰上準(zhǔn)備如下：

●2μl 10X M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液

●1μl 40U/μl RNase抑制劑

●1μl 200U/μl M-MuLV酶

將反應(yīng)混合并短暫離心，以收集在管底部的反應(yīng)物質(zhì)，然后放回冰上。然后將反應(yīng)在42℃下孵育60分鐘，隨后在4℃孵育。

ExoI處理

將如下添加至上述反應(yīng)，

●1μl 20U/μl核酸外切酶I

將反應(yīng)混合并短暫離心，以收集在管底部的反應(yīng)物質(zhì)，然后在37℃下孵育10分鐘。接著，加入1.28μl的1N NaOH，并通過上下吹吸混合，然后離心以收集物質(zhì)。將反應(yīng)在80℃孵育10分鐘，然后加入4μl 10mM Tris(pH 8.3)，并通過上下吹吸混合。將20μl的經(jīng)核酸外切酶處理的DNA溶液轉(zhuǎn)移至在冰上的新的200μl PCR管。

第二鏈cDNA合成

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自以上的20μl DNA溶液

●11μl無核酸酶的H₂O

●4μl 10X PCR緩沖液II

●4μl 1.2μg/μl隨機(jī)引物(9mer)

●1μl 0.5mM dNTP

通過上下吹吸將反應(yīng)混合，然后短暫離心以收集物質(zhì)，并置于冰上。然后將反應(yīng)在95℃下孵育3分鐘，然后在22℃下孵育10秒，接著在4℃下孵育，直至進(jìn)行下一步驟。將反應(yīng)在冰上孵育至少一分鐘。

將如下添加至反應(yīng)：

●1μl 400U/μl Manta 1.0DNA聚合酶(高濃度)

將反應(yīng)在25℃下孵育10秒，然后在70℃下孵育10分鐘，并保持在4℃下直至進(jìn)行下一步驟。

用AMPure珠#1純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●88.4μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的12μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將磁珠轉(zhuǎn)移至新的管。

擴(kuò)增#1

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自上述純化#1的10μl純化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start緩沖液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_條形碼引物

●2μl 3μM基因特異性引物#1

●0.5單元-2單元的聚合酶(例如，Pheonix Hot Start Taq，VeraSeq)

按照如下對反應(yīng)進(jìn)行孵育：

●步驟1：95℃孵育3分鐘

●步驟2：95℃孵育30秒

●步驟3：65℃孵育5分鐘，返回至步驟2共14個(gè)循環(huán)

●步驟4：72℃孵育2分鐘

●步驟5：4℃，直至將方案進(jìn)行下去

用AMPure珠#2純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●36.4μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的9μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將磁珠轉(zhuǎn)移至新的管。

擴(kuò)增#2

準(zhǔn)備以下反應(yīng)：

●來自上述純化#2的8.5μl純化DNA

●4μl 5X Phoenix Hot Start緩沖液

●2μl 2mM dNTP

●2μl 10μM P5_29bp引物

●2μl 10μM P7條形碼引物

●2μl 3μM基因特異性引物#2

●0.2μl 5U/μl Phoenix Hot Start Taq聚合酶

●2μl 10μM P7條形碼引物

按照如下對反應(yīng)進(jìn)行孵育：

●步驟1：95℃孵育3分鐘

●步驟2：95℃孵育30秒

●步驟3：65℃孵育5分鐘，返回至步驟2共14個(gè)循環(huán)

●步驟4：72℃孵育2分鐘

●步驟5：4℃，直至將方案進(jìn)行下去

用AMPure珠#3純化DNA

將如下添加至上述反應(yīng)，

●37.3μl AMPure珠

將懸浮液充分混合并在室溫下孵育5分鐘。使用磁體2-4分鐘以對珠進(jìn)行收集，且溶液表現(xiàn)為澄清。棄去上清液，并在磁體上用200μl 70％乙醇將珠洗滌兩次。第二次洗滌后，將珠在室溫下干燥5分鐘。最后，通過從磁體將管移除并將珠重懸于包含在AMPure試劑盒中的20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.3)洗脫緩沖液中，從而洗脫DNA。將RNA-珠溶液置于磁體上2分鐘。然后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至新的PCR管，確保避免將磁珠轉(zhuǎn)移至新的管。

文庫濃度的定量

使用Illumina的Kapa Biosystems qPCR試劑盒，以對使用上述方案制備的各文庫的濃度進(jìn)行定量。將條形碼化的文庫以等摩爾濃度合并。然后按照制造商的說明，使用MiSeq v2 300循環(huán)試劑盒，以XpM將文庫加載到Illumina MiSeq上。使用2x150bp讀取段(具有7個(gè)堿基編碼的索引讀取段)對樣品進(jìn)行測序。