專利名稱：新的調(diào)控組件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明系關(guān)于新的調(diào)控組件，以及自諸如克隆化基因等核酸改良多肽之表達(dá)的方法，及在使用該等新穎調(diào)控組件的真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)各種多肽。
背景技術(shù)：
供人類治療使用之生物藥物之市場(chǎng)繼續(xù)以高速率增長(zhǎng)，其中逾900種生物藥物正在臨床研究中進(jìn)行評(píng)估且估計(jì)2010年銷售額為500億。當(dāng)前，愈來愈多之生物藥物系自哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，原因在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠正確加工并修飾人類蛋白質(zhì)。因此，重組蛋白質(zhì)在功能與藥效方面皆與人類兼容。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，缺點(diǎn)通常為蛋白質(zhì)表達(dá)量大幅降低。因此自哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功且高產(chǎn)量生產(chǎn)生物藥物至關(guān)重要，且視包括以下之各種因素而定宿主細(xì)胞系、表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)及生產(chǎn)力、培養(yǎng)及肴料培養(yǎng)基、生產(chǎn)及純化程序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及序列、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及配方。表達(dá)重組蛋白質(zhì)需要編碼所要目標(biāo)基因的表達(dá)載體。多種方法可用于優(yōu)化表達(dá)載體以便進(jìn)行有效蛋白質(zhì)生產(chǎn)?；虮磉_(dá)系在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯水平加以調(diào)控。因此，許多方法系關(guān)于鑒別及優(yōu)化強(qiáng)啟動(dòng)子及增強(qiáng)子以提升蛋白質(zhì)編碼基因之轉(zhuǎn)錄效率。此等啟動(dòng)子及增強(qiáng)子之實(shí)例為CMV即刻早期啟動(dòng)子及增強(qiáng)子、SV40啟動(dòng)子及增強(qiáng)子、延伸因子(EF)啟動(dòng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子及雞[β]_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。同樣，亦使用穩(wěn)定mRNA并強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止之強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)序列、經(jīng)由表達(dá)載體所編碼之基因增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)。提升所得mRNA 之轉(zhuǎn)譯效率的方法為使用轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)(AUG)、最佳核糖體結(jié)合位點(diǎn)(諸如Kozak序列 (GCCGCCACCAUGG，AUG構(gòu)成起始密碼子))或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。用以優(yōu)化表達(dá)載體以便在真核細(xì)胞中獲得更高量之重組基因表達(dá)之方法之一系關(guān)于聚腺苷酸化信號(hào)之使用及選擇。多種聚腺苷酸化信號(hào)可用于載體中以便表達(dá)重組蛋白質(zhì)。最常用之聚腺苷酸化信號(hào)包括例如來自牛生長(zhǎng)激素(BGH)(美國專利第5，122，458號(hào))、 猴病毒40晚期及早期區(qū)、兔β-血球蛋白、小鼠或人類免疫球蛋白、多瘤病毒晚期區(qū)的聚腺苷酸化信號(hào)。在真核信使RNA(mRNA)中，3'非翻譯區(qū)(3' UTR)為重要調(diào)控組件。在多種情形下，其控制mRNA穩(wěn)定性，且其亦可調(diào)控轉(zhuǎn)譯效率。聚腺苷酸化信號(hào)為3' UTR內(nèi)的核苷酸序列，其導(dǎo)引聚腺苷酸化蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合至信號(hào)序列內(nèi)之AAUAAA序列。復(fù)合物含有核酸內(nèi)切酶，其在AAUAAA序列之下游約14至30個(gè)核苷酸處剪切mRNA ；及聚合酶，其使一連串約100至200個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyA尾)轉(zhuǎn)錄后合并至裂解之3'端。這種polyA尾影響 mRNA代謝之許多方面，包括穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)譯效率及自細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)之轉(zhuǎn)運(yùn)。通常，聚腺苷酸化信號(hào)由側(cè)接裂解及聚腺苷酸化位點(diǎn)的兩個(gè)識(shí)別組件組成位于裂解位點(diǎn)上游約14至30 個(gè)核苷酸的高保守AAUAAA序列，及位于AAUAAA序列下游約20至50個(gè)核苷酸的低保守G/ U富集區(qū)或U富集區(qū)。此等兩個(gè)組件之間的裂解通常位于A殘基之3'側(cè)。在活體內(nèi)，不同聚腺苷酸化位點(diǎn)之加工效率變化較大。聚腺苷酸化蛋白質(zhì)復(fù)合物之組裝速度為多級(jí)程序，且與聚腺苷酸化信號(hào)序列之強(qiáng)度相關(guān)。舉例而言，因?yàn)榻M裝速率更快，所以強(qiáng)SV40晚期聚腺苷酸化信號(hào)中發(fā)生裂解快于較弱SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)(Chao等人，Molecular and Cellular Biology，第 19 卷(8)，5588-5600，1999)。需要鑒別替代性強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)或甚至極強(qiáng)之聚腺苷酸化信號(hào)以促進(jìn)用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)之高生產(chǎn)細(xì)胞系的產(chǎn)生。使用強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)或甚至極強(qiáng)之聚腺苷酸化信號(hào)可強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止，從而增強(qiáng)經(jīng)載體編碼之mRNA、之生產(chǎn)、穩(wěn)定性、核輸出及/或翻譯。此應(yīng)產(chǎn)生較高量mRNA且因此可提高生產(chǎn)細(xì)胞之生產(chǎn)力。發(fā)明概述本文描述自中國倉鼠(灰倉鼠(Cricetus griseus))之生長(zhǎng)激素所分離的新穎聚腺苷酸化信號(hào)。驚人地，已發(fā)現(xiàn)命名為HGH之此新鑒別聚腺苷酸化信號(hào)優(yōu)于BGH及SV40晚期強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)。當(dāng)使用包含HGH作為聚腺苷酸化信號(hào)序列之載體時(shí)，CH0-DG44細(xì)胞之瞬間轉(zhuǎn)染中之蛋白質(zhì)效價(jià)與包含BGH之細(xì)胞相比增加高達(dá)35%。在穩(wěn)定細(xì)胞中，獲得高達(dá)每天每個(gè)細(xì)胞45pg之高比生產(chǎn)力及補(bǔ)料分批培養(yǎng)中高達(dá)6. 3g/L的效價(jià)。本發(fā)明之一實(shí)施例為多核苷酸序列，其包含至少一個(gè)HGH聚腺苷酸化信號(hào)及至少一個(gè)編碼目標(biāo)產(chǎn)物的異源核苷酸序列。HGH聚腺苷酸化信號(hào)位于下游，且操作性連接至異源核苷酸序列。本發(fā)明之另一實(shí)施例為一種新穎載體，其包含至少一個(gè)編碼目標(biāo)產(chǎn)物的異源核苷酸序列及至少一個(gè)HGH聚腺苷酸化信號(hào)。HGH聚腺苷酸化信號(hào)位于下游，且操作性連接至異源核苷酸序列。本發(fā)明之又一實(shí)施例為新穎載體或多核苷酸序列，其包含至少一個(gè)操作性連接至上游多克隆位點(diǎn)之HGH聚腺苷酸化信號(hào)，該上游多克隆位點(diǎn)允許經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶之識(shí)別序列克隆目標(biāo)基因。本發(fā)明之又一實(shí)施例為一種包含HGH聚腺苷酸化信號(hào)的真核細(xì)胞(較佳為哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。本發(fā)明之又一實(shí)施例為一種用于生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的方法，其包含培養(yǎng)經(jīng)包含HGH聚腺苷酸化信號(hào)之載體或多核苷酸序列轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，較佳哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一較佳實(shí)施例中，目標(biāo)產(chǎn)物為多肽，且所要多肽系自培養(yǎng)基中回收。本發(fā)明之資料展示HGH聚腺苷酸化信號(hào)序列對(duì)sICAM之瞬間表達(dá)的影響(圖6)。 驚人地，使用來源于倉鼠之生長(zhǎng)激素基因之聚腺苷酸化信號(hào)序列獲得最高sICAM表達(dá)。與經(jīng)含有BGH聚腺苷酸化信號(hào)之載體pJRl 10轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，效價(jià)增加高達(dá)21 % (轉(zhuǎn)染系列 #1)，且與經(jīng)含有SV40晚期聚腺苷酸化信號(hào)之載體PJR106所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，效價(jià)增加高達(dá)40% (轉(zhuǎn)染系列#1)。本發(fā)明之資料另外展示HGH聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)IgG4抗體之瞬間表達(dá)的影響。驚人地，用HGH聚腺苷酸化信號(hào)序列所得之效價(jià)相對(duì)于BGH聚腺苷酸化信號(hào)之效價(jià)平均高35 % (圖 7)。本發(fā)明之資料另外展示不同HGH變體之測(cè)試(圖8)。表達(dá)載體PJR135中所含之 113bp最短HGH序列與表達(dá)載體PJR131中所含之324bp HGH序列相比，使sICAM表達(dá)減幅高達(dá)78%。而表達(dá)載體PJR134中所含之189bpHGH序列產(chǎn)生與用BGH達(dá)成之表達(dá)量相當(dāng)?shù)臉O優(yōu)sICAM表達(dá)(圖7)。使用表達(dá)載體PJR131中所含之324bp HGH序列達(dá)成最佳表達(dá)結(jié)果(圖8)，大大優(yōu)于(35%)用BGH聚腺苷酸化信號(hào)所達(dá)成的表達(dá)(圖7)。這表明，SEQ ID NO 8序列bp 190至3 之間的HGH區(qū)對(duì)目標(biāo)基因的有效表達(dá)作出貢獻(xiàn)。本發(fā)明之?dāng)?shù)據(jù)還表明，用所述HGH聚腺苷酸化信號(hào)高水平穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)。獲得比生產(chǎn)力在每天每個(gè)細(xì)胞10-45pg范圍內(nèi)且補(bǔ)料分批培養(yǎng)中效價(jià)高達(dá)6. 3g/L的細(xì)胞池 (pool)及細(xì)胞克隆(圖9)。本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ IDNO 9至少 75%—致的序列。本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :9具有至少75% —致性的序列。本發(fā)明另外系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :9具有至少75% —致性的序列。本發(fā)明尤其系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸基本上由與SEQ ID NO :9至少75%—致之序列組成。本發(fā)明較佳系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸由與SEQID NO 9至少75%—致的序列組成。本發(fā)明另外系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含 SEQ ID NO:9。在一特定實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :8至少75%—致的序列。本發(fā)明尤其系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸基本上由與SEQ ID NO :8至少75%—致的序列組成。本發(fā)明較佳系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸由與SEQ ID NO :8至少75%—致的序列組成。本發(fā)明另外系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含SEQ ID NO :8。在本發(fā)明之又一實(shí)施例中，聚腺苷酸化信號(hào)包含與SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 8 至少80 %、85 %、90 %、95 %或98 % —致的序列。在一特定實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :9至少85%—致的序列。在另一特定實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID N0:9至少 95%—致的序列。在一特定實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :8至少85%—致的序列。在另一特定實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ IDNO 8至少95%—致的序列。本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列包含SEQ ID NO :9。較佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列基本上由SEQ ID N0:9組成。更佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列由SEQ ID NO 9組成。本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列包含SEQ ID NO :8。較佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列基本上由SEQ ID N0:8組成。更佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種核酸，其序列由SEQ ID NO 8組成。在一較佳實(shí)施例中，該聚腺苷酸化信號(hào)經(jīng)分離。在一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ IDNO 9至少75% —致的序列。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :9至少95%—致的序列。在又一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含SEQ ID NO :9。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :8至少75% —致的序列。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含與SEQ ID NO :8至少95%—致的序列。在又一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明系關(guān)于一種包含核酸之經(jīng)分離聚腺苷酸化信號(hào)，該核酸包含SEQ ID NO :8。較佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種經(jīng)分離核酸，其序列包含SEQ ID NO :9。更佳地，本發(fā)明系關(guān)于一種經(jīng)分離核酸，其序列包含SEQ ID NO :8。
在一較佳實(shí)施例中，該聚腺苷酸化信號(hào)操作性連接至異源編碼序列。在一特別較佳實(shí)施例中，該聚腺苷酸化信號(hào)之特征在于，用該聚腺苷酸化信號(hào)所得之效價(jià)/表達(dá)量比針對(duì)BGH聚腺苷酸化信號(hào)所得之彼等效價(jià)/表達(dá)量高至少10%、較佳20%且最佳30%。在一最佳實(shí)施例中，用該聚腺苷酸化信號(hào)所得之效價(jià)/表達(dá)量比針對(duì)BGH聚腺苷酸化信號(hào)所得之彼等效價(jià)/表達(dá)量至少且/或平均高35%。本發(fā)明尤其系關(guān)于一種核酸，其序列包含操作性連接至異源編碼序列之SEQ ID NO :9。或者，其序列基本上由操作性連接至異源編碼序列之SEQ IDNO :9組成。較佳地，其序列由操作性連接至異源編碼序列之SEQ ID N0:9組成。本發(fā)明另外系關(guān)于一種核酸，其序列包含操作性連接至異源編碼序列之SEQ ID NO :8?；蛘撸湫蛄谢旧嫌刹僮餍赃B接至異源編碼序列之SEQ IDNO :8組成。較佳地，其序列由操作性連接至異源編碼序列之SEQ ID N0:8組成。一種核酸，其序列包含SEQ ID NO :9或8且具有終止子功能。較佳地，該核酸具有終止子功能，且操作性連接至異源編碼序列。本發(fā)明另外系關(guān)于一種載體或多核苷酸序列，其包含上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸序列。在一特定實(shí)施例中，該等聚腺苷酸化信號(hào)或核酸序列操作性連接至表達(dá)單元 /表達(dá)盒。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，該載體包含選擇及/或擴(kuò)增標(biāo)記二氫葉酸還原酶 (DHFR)、谷氨酰胺合成酶或新霉素磷酸酶(neo)。在本發(fā)明之一較佳實(shí)施例中，該載體或多核苷酸序列包含編碼目標(biāo)異源產(chǎn)物的目標(biāo)異源基因。較佳地，該產(chǎn)物為多肽。較佳地，該多肽為抗體、抗體片段或融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明另外系關(guān)于一種包含上述任一種載體或多核苷酸序列的細(xì)胞。較佳地，該細(xì)胞包含操作性連接至編碼目標(biāo)產(chǎn)物之轉(zhuǎn)錄單元、上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸序列。較佳地，該目標(biāo)產(chǎn)物為目標(biāo)核苷酸/核酸。在該細(xì)胞之另一實(shí)施例中，該目標(biāo)產(chǎn)物為藉由目標(biāo)基因編碼的目標(biāo)多肽。較佳地，該多肽為抗體、抗體片段或融合蛋白質(zhì)。在一特定實(shí)施例中，該細(xì)胞為真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞或鼠類細(xì)胞。較佳地，該細(xì)胞為倉鼠細(xì)胞。更佳地，該細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。最佳地，該細(xì)胞為 CHO DG44、CHO-Kl或DUKX-Bll細(xì)胞。在另一較佳實(shí)施例中，該細(xì)胞為NSO細(xì)胞。在一較佳實(shí)施例中，所述該等細(xì)胞為經(jīng)培養(yǎng)之細(xì)胞。較佳地，在無血清之培養(yǎng)基中培養(yǎng)該等細(xì)胞。較佳地，該等細(xì)胞生長(zhǎng)于懸浮培養(yǎng)物中。在本發(fā)明之另一較佳實(shí)施例中，該細(xì)胞之特征在于， 用該聚腺苷酸化信號(hào)或核酸序列所得之效價(jià)/表達(dá)量比針對(duì)BGH聚腺苷酸化信號(hào)所得之彼等效價(jià)/表達(dá)量高至少10%、較佳20%且最佳30%。在一最佳實(shí)施例中，用該聚腺苷酸化信號(hào)或核酸序列所得之效價(jià)/表達(dá)量比針對(duì)BGH聚腺苷酸化信號(hào)所得之彼等效價(jià)/表達(dá)量至少且/或平均高35%。較佳地，該細(xì)胞具有高出35%的表達(dá)量。本發(fā)明另外系關(guān)于一種制備由目標(biāo)基因所編碼之目標(biāo)多肽的方法，該方法包含(a)提供包含如上所述之載體或多核苷酸序列的宿主細(xì)胞，或提供如上所述的細(xì)胞，(b)在允許細(xì)胞增殖及表達(dá)目標(biāo)基因的條件下培養(yǎng)該等細(xì)胞，(C)收集目標(biāo)多肽，及(d)純化目標(biāo)多肽。在該方法之一特定實(shí)施例中，該細(xì)胞為真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞或鼠類細(xì)胞。該細(xì)胞較佳為CHO細(xì)胞，最佳為CHO DG44、CHO-Kl或DUKX-Bll細(xì)胞。此外，NSO細(xì)
胞較佳。在該方法之一較佳實(shí)施例中，目標(biāo)多肽為重組蛋白質(zhì)，較佳為分泌多肽，更佳為治療性蛋白質(zhì)。最佳地，目標(biāo)多肽為抗體，諸如單克隆、多克隆、多特異性或單鏈抗體，或其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc及Fc'片段免疫球蛋白重鏈及輕鏈及其恒定區(qū)、可變區(qū)或超變區(qū)，以及Fv片段及Fd片段。在該方法之另一較佳實(shí)施例中，目標(biāo)多肽為融合蛋白質(zhì)或支架蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于上述細(xì)胞用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的用途。本發(fā)明另外系關(guān)于上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸用作絕緣子(insulator) 之用途。另外，本發(fā)明系關(guān)于上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸用于產(chǎn)生經(jīng)改良之宿主細(xì)胞系的用途。本發(fā)明尤其系關(guān)于上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸用于基因治療之用途。本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于一種試劑盒，其包含上述任一種聚腺苷酸化信號(hào)或核酸、載體、細(xì)胞及用于培養(yǎng)該細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng)基。


圖1 基本表達(dá)載體圖1示意性展示用于轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞的表達(dá)載體設(shè)計(jì)。“P/E”意謂含有CMV增強(qiáng)子與啟動(dòng)子組件兩者之復(fù)合物單元，“P”為啟動(dòng)子組件且“T”為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，這是經(jīng)轉(zhuǎn)錄的信使RNA發(fā)生聚腺苷酸化時(shí)所需。聚腺苷酸化信號(hào)“BGH”、“SV40L”及“HGH”分別為來源于牛生長(zhǎng)激素之3'非翻譯區(qū)(SEQ ID N0:12)、SV40晚期基因區(qū)(SEQ ID NO 11)及中國倉鼠生長(zhǎng)激素之3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO 8)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。此等聚腺苷酸化信號(hào)與 “Sfil”及“)(bal”之限制性酶切位點(diǎn)側(cè)接。各轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)之轉(zhuǎn)錄起始的位置及方向藉由箭頭指示?？寺∧繕?biāo)基因時(shí)，將帶有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)-“mcs”)的序列區(qū)插在啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組件之后?？蓴U(kuò)增的可選標(biāo)記二氫葉酸還原酶縮寫為“dhfr”， 可選標(biāo)記新霉素磷酸酶縮寫為“npt”。圖2 分離的灰倉鼠生長(zhǎng)激素基因區(qū)圖2展示使用巢式PCR、自基因組CH0_DG44(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系灰倉鼠)DNA擴(kuò)增之具有總共362bp之生長(zhǎng)激素基因區(qū)之核苷酸序列(SEQID NO :7)。箭頭指示擴(kuò)增反應(yīng)中所用之基因特異性引物GH for2的方向、長(zhǎng)度及位置，引物序列自身以斜體醒目顯示(SEQ ID NO :2)。生長(zhǎng)激素基因序列之終止密碼子TAG藉由加下劃線之粗體字母醒目顯示，且后續(xù)為3Mbp之3'非翻譯區(qū)。圖3:生長(zhǎng)激素基因之3'非翻譯區(qū)之比對(duì)在此比對(duì)中，比較灰倉鼠經(jīng)分離之3'非翻譯生長(zhǎng)激素區(qū)(SEQ ID NO :8)與敘禾丨J亞(Syrian)倉鼠金黃地鼠(Mesocricetus auratus) (Genbank S66299)、家鼴鼠(Mus musculus) (Genbank Z46663)、褐鼠(Rattus norvegicus) (GenbankV01239)及溫帶牛(Bos taurus) (Genbank J00008)的3'非翻譯生長(zhǎng)激素區(qū)。陰影指示不同于灰倉鼠序列的核苷酸。
圖4 灰倉鼠生長(zhǎng)激素之3 ‘非翻譯區(qū)的HGH缺失衍生物在此比對(duì)中，展示僅含有3'非翻譯區(qū)之362個(gè)核苷酸之灰倉鼠生長(zhǎng)激素(HGH)序列(SEQ ID NO 7)的缺失衍生物。所有衍生物具有相同5'端及不同3'端。具有SEQ ID NO :8之最長(zhǎng)衍生物由3 個(gè)核苷酸組成。SEQ ID NO :9由189個(gè)核苷酸組成，且SEQ ID N0:10僅由113個(gè)核苷酸組成。生長(zhǎng)激素基因序列之終止密碼子TAG藉由加下劃線之粗體字母醒目顯示，且聚腺苷酸化蛋白質(zhì)復(fù)合物AATAAA之潛在結(jié)合位點(diǎn)以斜體醒目顯示。圖5 用于評(píng)估HGH效能的重組表達(dá)載體所有重組表達(dá)載體皆在CMV增強(qiáng)子及啟動(dòng)子組件(“P/E”)之控制下編碼目標(biāo)基因“sICAM”。sICAM轉(zhuǎn)錄終止于牛生長(zhǎng)激素“BGH”之3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO 12), SV40 晚期基因區(qū)“SV40L” (SEQ ID NO=Il)或中國倉鼠生長(zhǎng)激素“HGH”之3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10)。后者之大小用堿基對(duì)示出。此等聚腺苷酸化信號(hào)與 “Sfil”及Ibal”之限制性酶切位點(diǎn)側(cè)接。“P”指示啟動(dòng)子組件，“T”指示轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 各轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)之轉(zhuǎn)錄起始位置及方向藉由箭頭指示?？蓴U(kuò)增之可選標(biāo)記二氫葉酸還原酶縮寫為 “dhfr”。圖6 評(píng)估瞬間轉(zhuǎn)染中之HGH效能在兩個(gè)獨(dú)立系列中，用表達(dá)載體pJR106、pJRllO及pJR131轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞， 該等載體皆在CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子下編碼sICAM。使用SV40晚期聚腺苷酸化信號(hào)(SEQ ID NO :11)、牛生長(zhǎng)激素BGH之3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO 12)或中國倉鼠生長(zhǎng)激素HGH之3‘ 非翻譯區(qū)(SEQ ID NOd)終止轉(zhuǎn)錄。48小時(shí)后，使用ELISA測(cè)定上清液中的sICAM效價(jià)。 為校正轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞被質(zhì)粒pCMV-SEAP共轉(zhuǎn)染，量測(cè)SEAP活性。用HGH作為聚腺苷酸化信號(hào)時(shí)的效價(jià)與用BGH終止時(shí)的相比增加高達(dá)21%，與用SV40晚期終止時(shí)的相比增加高達(dá) 40%。圖7 評(píng)估IGG4/KAPPA抗體之瞬間表達(dá)中之HGH效能用載體組合pBID/IgG4與pBIN/kappa共轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞(n = 6)，其中抗體之重鏈(IgG4)及輕鏈(kappa)之轉(zhuǎn)錄終止于中國倉鼠生長(zhǎng)激素HGH之324bp 3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO :8)。作為對(duì)照，用含有BGH聚腺苷酸化信號(hào)(SEQ ID NO 12)的載體組合 pBID-B/IgG4與pBIN-B/kappa共轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞(n = 6)。除聚腺苷酸化序列不同外， 不同載體之遺傳構(gòu)成相同。48小時(shí)后，使用ELISA測(cè)定上清液中的抗體效價(jià)。為校正轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞被質(zhì)粒pCMV-SEAP共轉(zhuǎn)染，量測(cè)SEAP活性。用HGH作為聚腺苷酸化信號(hào)，效價(jià)相對(duì)于BGH聚腺苷酸化信號(hào)平均高35%。圖8 測(cè)試瞬間轉(zhuǎn)染中之不同HGH缺失變體在兩個(gè)獨(dú)立系列中，用在CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子下編碼sICAM的表達(dá)載體pJR131、 PJR134及pJR135轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞。使用中國倉鼠生長(zhǎng)激素HGH之324bp (SEQ ID NO: 8)、189bp(SEQ ID NO :9)或113bp(SEQID NO :10)3'非翻譯區(qū)終止轉(zhuǎn)錄。所有變體具有相同5'端、但不同3'端。除聚腺苷酸化序列不同外，不同載體之遺傳構(gòu)成相同。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，使用ELISA測(cè)定上清液中之sICAM效價(jià)。為校正轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞被質(zhì)粒pCMV-SEAP共轉(zhuǎn)染，量測(cè)SEAP活性。與經(jīng)含有324bp HGH序列之載體轉(zhuǎn)染之細(xì)胞相比，經(jīng)含有189bp及 113bp HGH缺失變體之載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別展示sICAM表達(dá)量減少23%及78%。圖9 在使用HGH之穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高水平表達(dá)蛋白質(zhì)
圖9總結(jié)了生物反應(yīng)器或搖瓶中進(jìn)行的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，表達(dá)IgGl、IgG2及IgG4 抗體或IgGl與IgG2Fc融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0-DG44細(xì)胞克隆或細(xì)胞池的比生產(chǎn)力及效價(jià)。比生產(chǎn)力為10-45pg/細(xì)胞/天，效價(jià)為2. l-6.3g/L。用于表達(dá)不同蛋白質(zhì)之載體之遺傳構(gòu)成相同。所有載體含有中國倉鼠生長(zhǎng)激素之324bp 3'非翻譯區(qū)(SEQ ID NO 8)作為聚腺苷酸化信號(hào)以終止目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染后2天，使用基于DHFR及基于NPT之選擇術(shù)選擇穩(wěn)定細(xì)胞池，接著藉由向培養(yǎng)基中添加IOOnM及SOOnM MTX來進(jìn)行2個(gè)連續(xù)的 DHFR介導(dǎo)基因擴(kuò)增步驟。藉由稀釋克隆或?qū)渭?xì)胞基于FACS沉積于96孔板的孔中來獲得單細(xì)胞克隆。發(fā)明詳述通用實(shí)施例“包含”涵蓋更特定實(shí)施例“由...組成”。此外，單數(shù)及復(fù)數(shù)形式不以限制方式使用。本發(fā)明提供新穎調(diào)控組件及制備并選擇允許高量表達(dá)異源基因產(chǎn)物(較佳生物藥物相關(guān)多肽或蛋白質(zhì))之哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的方法。本發(fā)明之方法主要基于使用自中國倉鼠(灰倉鼠)生長(zhǎng)激素所分離的新穎聚腺苷酸化信號(hào)。驚人地，已發(fā)現(xiàn)命名為HGH(SEQ ID NO 8)之此新鑒別聚腺苷酸化信號(hào)優(yōu)于BGH及SV40晚期強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)，從而提高生產(chǎn)細(xì)胞之生產(chǎn)力。本發(fā)明過程中所使用之術(shù)語具有以下含義。術(shù)語“聚腺苷酸化信號(hào)”、“聚腺苷酸化位點(diǎn)”、“polyA信號(hào)”、“polyA位點(diǎn)”或“終止信號(hào)”或“終止子”系指3' UTR內(nèi)之核苷酸序列，其導(dǎo)引聚腺苷酸化蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合至信號(hào)序列內(nèi)之AAUAAA序列。該復(fù)合物含有核酸內(nèi)切酶，其在AAUAAA序列之下游約14至 30個(gè)核苷酸處剪切mRNA ；及聚合酶，其將一連串約100至200個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyA尾) 轉(zhuǎn)錄后合并至裂解之3'端。據(jù)信polyA尾影響mRNA代謝之多個(gè)方面，包括穩(wěn)定性、翻譯效率及自核至細(xì)胞質(zhì)之轉(zhuǎn)運(yùn)。通常，聚腺苷酸化信號(hào)由側(cè)接裂解及聚腺苷酸化位點(diǎn)的兩個(gè)識(shí)別組件組成位于裂解位點(diǎn)上游約14至30個(gè)核苷酸的高保守AAUAAA序列，及位于AAUAAA 序列下游約20至50個(gè)核苷酸的低保守G/U富集區(qū)或U富集區(qū)。此等兩個(gè)組件之間的裂解通常位于A殘基之3'側(cè)。已知各種聚腺苷酸化信號(hào)，諸如tk polyA (Cole等人，Mol. Cell Biol.，5，2104-2113，1985)、SV40 晚期(Schek 等人，Mol. Cell Biol. 12，5386-5393，1992) 及早期PolyA或BGHpolyA(例如美國專利第5，122，458號(hào)中所述)。在聚腺苷酸化信號(hào)中，雖然上述AAUAAA序列較佳，但其可用與AAUAAA同源的其它六多核苷酸序列取代，只要此等六多核苷酸序列能夠傳導(dǎo)mRNA之聚腺苷酸化信號(hào)。同源六多核苷酸序列之實(shí)例包括 AAAAAA、AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA、GAUAAA、AAUGAA、AAUAGA、AAGAAA、ACUAAA、CAUAAA、AAUCAA、AACAAA、AAUCAA 及 AAUAAC0因此，在一實(shí)施例中，HGH聚腺苷酸化信號(hào)包含選自由以下組成之群的六多核苷酸序列而非本發(fā)明之 AAUAAA =AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA、GAUAAA、AAUGAA、AAUAGA、AAGAAA、ACUAAA、CAUAAA、AAUCAA、AACAAA、AAUCAA 及 AAUAAC，只要此等六體多核苷酸能夠傳導(dǎo)mRNA之聚腺苷酸化信號(hào)。聚腺苷酸化信號(hào)亦可用作“絕緣子(insulator)”或“絕緣序列 (insulatingsequence) ”。絕緣序列為阻斷相鄰基因序列之相互作用或干擾的DNA區(qū)段。 舉例而言，絕緣子可減少自相鄰基因之啟動(dòng)子或鄰近核苷酸序列中之偽啟動(dòng)子(spuriouspromoter)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄通讀?；蚱渥钄辔挥诮^緣序列一側(cè)上之增強(qiáng)子與位于絕緣序列另一側(cè)上之相鄰基因之啟動(dòng)子的相互作用。本發(fā)明之含義內(nèi)之絕緣序列的定義特性為其能夠?qū)⒉僮餍赃B接至調(diào)控組件的限定轉(zhuǎn)錄單元絕緣或保護(hù)而不受上游或下游干擾基因組件之影響。 為此目的，絕緣序列系置放于(潛在)干擾基因序列與待絕緣之轉(zhuǎn)錄單元的調(diào)控序列之間。 絕緣序列可能以一或多個(gè)復(fù)本置放于轉(zhuǎn)錄單元的任一側(cè)或兩側(cè)上。在本發(fā)明之一較佳實(shí)施例中，絕緣序列為聚腺苷酸化信號(hào)。在本發(fā)明之一較佳實(shí)施例中，聚腺苷酸化序列為HGH聚腺苷酸化序列。亦可使用HGH聚腺苷酸化序列之功能衍生物(諸如次片段或次序列)以及其完整序列或次片段之經(jīng)修飾(例如藉由取代、插入、添加及/或缺失加以修飾)的功能突變體/ 變體。相應(yīng)次片段或次序列、突變體或變體在下文中亦稱為“經(jīng)修飾之終止子”或“衍生物”?！敖?jīng)修飾之終止子”或“衍生物”為SEQ ID NO 8之功能衍生物，其包括次片段或次序列及功能突變體/變體，且較佳產(chǎn)生表達(dá)量與用SEQ ID NO :8中所指定之核苷酸序列所得之表達(dá)量相當(dāng)?shù)哪繕?biāo)產(chǎn)物。若在比較性報(bào)導(dǎo)基因檢定中，操作性連接之報(bào)導(dǎo)基因之表達(dá)量為用SEQ ID NO 8所得之表達(dá)量的至少60%、較佳至少75%、更佳至少90%且最佳至少 100%，則經(jīng)修飾之終止子證明適用于本發(fā)明之目的。尤其較佳為與倉鼠生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)之野生類型序列SEQ ID NO :8或其互補(bǔ)序列具有至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%、更佳至少95%且最佳至少97%之最小序列同源性且在比較性報(bào)導(dǎo)基因檢定中產(chǎn)生相應(yīng)表達(dá)量的經(jīng)修飾之終止子。在相應(yīng)比較性“報(bào)導(dǎo)基因檢定”中，將待測(cè)試之終止子片段(包括參考序列SEQ ID NO 8)克隆于報(bào)導(dǎo)基因下游。此報(bào)導(dǎo)基因編碼例如熒光素酶、分泌之堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)?；蛘撸墒褂闷渌嚯幕虻鞍踪|(zhì)(例如抗體或sICAM)作為報(bào)導(dǎo)基因。隨后藉由轉(zhuǎn)染將此等構(gòu)建體引入測(cè)試細(xì)胞(例如CH0-DG44)中，且例如藉由量測(cè)報(bào)導(dǎo)基因之蛋白質(zhì)含量來測(cè)定所述之經(jīng)修飾終止子對(duì)報(bào)導(dǎo)基因之表達(dá)量的影響。相應(yīng)測(cè)試描述于本發(fā)明之實(shí)施例2、3及4中。較佳HGH聚腺苷酸化信號(hào)為包含包括SEQ ID NO 9序列之SEQ IDNO 8序列或其次序列的核苷酸序列。在其它實(shí)施例中，聚腺苷酸化信號(hào)為核苷酸序列，其包含以下或由以下組成與 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8、SEQ. ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 具有同源性或序列一致性的核苷酸序列。如本文中所使用，當(dāng)核苷酸序列至少75%、較佳80%、較佳85%、更佳90%且甚至更佳95%或高于95%同源或一致時(shí)，兩個(gè)序列具有序列一致性或同源性。當(dāng)核酸序列在嚴(yán)格條件下與該股之補(bǔ)體雜交時(shí)，亦存在大體一致性。如本文中所使用，術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”描述熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之雜交及洗滌條件。通常，選擇在指定離子強(qiáng)度及PH下比特定序列之熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C的嚴(yán)格條件。Tm為與標(biāo)靶互補(bǔ)之探針之50%與標(biāo)靶序列雜交平衡時(shí)的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH 及核酸濃度下)。嚴(yán)格條件將為在PH7. 0至8. 3鹽濃度小于約1. OM鈉離子，通常約0. 01至 1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，且溫度對(duì)于短探針(例如10至約50個(gè)核苷酸)為至少約 30°C且對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于約50個(gè)核苷酸)為至少約60°C。例示性嚴(yán)格條件包括在使用5 X SSC之雜交緩沖液中在60至65°C雜交及使用0. 2XSSC/0. 1% SDS在42°C洗滌。陽性雜交信號(hào)比背景雜交高至少2倍。倉鼠生長(zhǎng)激素之聚腺苷酸化序列及經(jīng)修飾之終止子(亦可包括例如SEQID NO 7之分離HGH序列之上游或下游天然存在之核苷酸序列或其選擇片段)可藉由了解該序列或同源序列的熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者使用此項(xiàng)技術(shù)中已知之各種標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，適合方法亦描述于本發(fā)明實(shí)施例1中。例如，可自SEQID NO :7中所述之序列開始選擇適合片段，含有此部分序列的寡核苷酸探針可以化學(xué)合成。此種探針可用于例如藉由雜交自倉鼠基因組庫克隆倉鼠生長(zhǎng)激素基因或其3'非翻譯區(qū)或其它片段。使用上述報(bào)導(dǎo)基因檢定，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可不費(fèi)力地鑒別功能終止子片段，且將其用于本發(fā)明之目的。使用來自基因組DNA或基因組庫之相應(yīng)引物藉由PCR擴(kuò)增可以容易地獲得3'非翻譯區(qū)或其特殊片段。3'非翻譯區(qū)之片段亦可由較大DNA片段經(jīng)限制之外切核酸酶III消化獲得。此等DNA分子亦可化學(xué)合成， 或藉由連接、自化學(xué)合成之片段產(chǎn)生。缺失、插入、添加及取代突變體可藉由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之定點(diǎn)誘發(fā)突變、基于PCR之誘發(fā)突變技術(shù)及/或化學(xué)合成法來產(chǎn)生。較佳地，突變體在多達(dá)3、6、10、20或50bp位置變異。較佳地，突變體在6bp位置變異。如本發(fā)明實(shí)施例1中所述之類似方法可用以分離例如小鼠、大鼠或敘利亞倉鼠生長(zhǎng)激素或其它物種之生長(zhǎng)激素之聚腺苷酸化信號(hào)。其效能可在如本發(fā)明之實(shí)施例2、3或4 中所述之報(bào)導(dǎo)基因檢定中進(jìn)行測(cè)試。藉由與來源于倉鼠生長(zhǎng)激素序列(較佳來源于3'非翻譯區(qū))之探針交叉雜交，亦可自經(jīng)鑒別之合適終止子序列并自其它物種(較佳哺乳動(dòng)物) 之相應(yīng)同源基因中分離合適終止子序列。合適技術(shù)為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知。術(shù)語“同源性”、“同源”、“一致性”、“一致”、“序列一致性”或“同源序列”可互換使用。用于計(jì)算“同源性”或“一致性”之方法熟知于此項(xiàng)技術(shù)中。序列比較時(shí)，通常一個(gè)序列充當(dāng)測(cè)試序列所比較之參考序列。將序列對(duì)準(zhǔn)以達(dá)成最大一致性。在比較中可將間隙引入任一核酸序列中以達(dá)成最佳對(duì)準(zhǔn)。兩個(gè)序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之一致位置數(shù)的函數(shù)(考慮需要引入以達(dá)成兩個(gè)序列最佳對(duì)準(zhǔn)的間隙數(shù)及每個(gè)間隙之長(zhǎng)度)。 可使用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間的序列比較及一致性百分比之測(cè)定。可使用預(yù)設(shè)程序參數(shù)，或可指定替代性參數(shù)。接著，序列比較算法基于所指定或預(yù)設(shè)之程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列之一致性百分比。適于測(cè)定一致性之一算法實(shí)例為BLAST算法(Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215，403-410，1990 ;Gish 等人，Nature Genetics 3，266-272，1993 ； Madden 等人，Meth. Enzymol. 266，131-141，1996 ；Zhang 等人，Genome Res. 7，649-656， 1997 ;Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25，3389-3402，1997)。比對(duì)算法之其它計(jì)算機(jī)化實(shí)施例為 Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、PILEUP、BESTFIT、FASTA 及 TFASTA。然而，亦可藉由人工比對(duì)及目視檢查及計(jì)算來測(cè)定一致性百分比。如本文中所使用之術(shù)語“載體”系關(guān)于用于捕捉、增殖、表達(dá)或傳遞細(xì)胞中之核酸的天然存在或合成產(chǎn)生之構(gòu)建體，例如質(zhì)粒、小環(huán)、噬菌質(zhì)粒、黏質(zhì)粒、人造染色體/小染色體、噬菌體、病毒(諸如桿狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹單純型病毒、 噬菌體)。用以建構(gòu)載體之方法為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知，且描述于各種出版物中。詳言之，用于建構(gòu)合適載體之特定技術(shù)(包括對(duì)諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止及聚腺苷酸化信號(hào)、 選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)及剪接信號(hào)之功能及調(diào)控組份的描述)為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。真核表達(dá)載體通常亦含有便于在細(xì)菌中傳播載體之原核序列(諸如復(fù)制起點(diǎn))及選用于細(xì)菌中之抗生素抗性基因。含有多核苷酸可操作性連接于其中之克隆位點(diǎn)的多種真核表達(dá)載體在此項(xiàng)技術(shù)中為熟知的，且一些真核表達(dá)載體可自以下公司購得諸如La Jolla, CA; Invitrogen，Carlsbad，CA ;Promega，Madison，WI 或BD Biosciences ClontechiPalo Alto,CA. ο本發(fā)明之一較佳實(shí)施例為含有一或多個(gè)編碼目標(biāo)基因之轉(zhuǎn)錄單元的載體或多核苷酸序列，該等載體或多核苷酸序列包含至少一個(gè)HGH聚腺苷酸化信號(hào)用于轉(zhuǎn)錄終止及穩(wěn)定化及/或作為絕緣序列。根據(jù)本發(fā)明，亦較佳為包含用于轉(zhuǎn)錄終止及穩(wěn)定化及/或作為絕緣序列之HGH聚腺苷酸化信號(hào)的載體或多核苷酸序列，該等載體或多核苷酸序列僅具有一個(gè)多克隆位點(diǎn)而非目標(biāo)基因，該多克隆位點(diǎn)允許經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶之識(shí)別序列克隆目標(biāo)基因。術(shù)語“啟動(dòng)子”指示多核苷酸序列，其允許并控制與其操作性連接之基因或序列之轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子含有用于結(jié)合RNA聚合酶的識(shí)別序列與用于轉(zhuǎn)錄之起始位點(diǎn)(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。為在特定細(xì)胞類型或宿主細(xì)胞中表達(dá)所要序列，必須選定合適功能啟動(dòng)子。大量啟動(dòng)子(包括多種不同來源之組成性、可誘導(dǎo)性及可抑制性啟動(dòng)子)在此項(xiàng)技術(shù)中為熟知的 (且已鑒別于諸如GenBank之?dāng)?shù)據(jù)庫中)，且可以獨(dú)立組件或克隆于多核苷酸序列內(nèi)之組件、自商業(yè)來源(例如寄存中心，諸如ATCC，以及其它商業(yè)來源)或個(gè)別來源獲得。在可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子中，可響應(yīng)信號(hào)增加或減少啟動(dòng)子之活性。舉例而言，含有四環(huán)素(tetracycline) 操縱序列(tetO)之四環(huán)素(tet)啟動(dòng)子可藉由四環(huán)素調(diào)控之反式激活蛋白(tTA)來誘導(dǎo)。 tTA與tetO之結(jié)合在tet存在下被抑制。其它可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子之實(shí)例為jun、fos、金屬硫蛋白及熱休克啟動(dòng)子。尤其適于高表達(dá)于真核細(xì)胞中之啟動(dòng)子例如為倉鼠之泛素/S27a啟動(dòng)子(W0 97/15664)、SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)、人類細(xì)胞巨大病毒之早期啟動(dòng)子(CMV)。其它異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子之實(shí)例為肌動(dòng)蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動(dòng)子。前述啟動(dòng)子在此項(xiàng)技術(shù)中為熟知的。相應(yīng)異源啟動(dòng)子可功能性連接至其它調(diào)控序列以便在表達(dá)盒中增強(qiáng)/調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。舉例而言，啟動(dòng)子可功能性連接至增強(qiáng)子序列以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。為此，可使用一或多個(gè)增強(qiáng)子及/或增強(qiáng)子序列之多個(gè)復(fù)本，例如CMV或 SV40增強(qiáng)子。因此，在另一實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明之表達(dá)載體含有一或多個(gè)增強(qiáng)子/增強(qiáng)子序列，較佳為CMV或SV40增強(qiáng)子。術(shù)語“增強(qiáng)子”指示以順式位置對(duì)啟動(dòng)子之活性起作用且因此刺激功能性連接至此啟動(dòng)子之基因或編碼序列之轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。不同于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子之作用獨(dú)立于位置及取向，且其可因此定位于轉(zhuǎn)錄單元之前或之后、內(nèi)含子內(nèi)或甚至編碼區(qū)內(nèi)。增強(qiáng)子可緊鄰轉(zhuǎn)錄單元且遠(yuǎn)離啟動(dòng)子定位。亦可與啟動(dòng)子具有實(shí)體及功能重迭。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知各種來源之多種增強(qiáng)子(及寄存于諸如Genbank之?dāng)?shù)據(jù)庫中之多種增強(qiáng)子，例如SV40增強(qiáng)子、CMV增強(qiáng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子、腺病毒增強(qiáng)子)，該等增強(qiáng)子可以獨(dú)立組件或克隆于多核苷酸序列內(nèi)的組件(例如保藏在ATCC或商業(yè)及個(gè)別來源之組件)獲得。多種啟動(dòng)子序列亦含有增強(qiáng)子序列，諸如常用CMV啟動(dòng)子。人類CMV增強(qiáng)子為迄今所鑒別之最強(qiáng)增強(qiáng)子之一?？烧T導(dǎo)性增強(qiáng)子之一實(shí)例為金屬硫蛋白增強(qiáng)子，其可藉由糖皮質(zhì)激素或重金屬刺激。“轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件”通常包含位于待表達(dá)之基因序列上游的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始及終止位點(diǎn)以及聚腺苷酸化信號(hào)。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)”系指構(gòu)建體內(nèi)對(duì)應(yīng)于第一核酸且并入初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(亦即 mRNA前驅(qū)物)中的核酸。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可與啟動(dòng)子序列重迭。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)”系指通常描繪于目標(biāo)基因之3'端或待轉(zhuǎn)錄之序列段之3'端、促使RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。“轉(zhuǎn)錄單元”、“表達(dá)單元”或“表達(dá)盒”系定義含有一或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄基因之載體、構(gòu)建體或多核苷酸序列內(nèi)之區(qū)，其中該區(qū)段內(nèi)所含之基因彼此操作性連接。其自單一激活子轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄終止于至少一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)。從而將不同基因至少以轉(zhuǎn)錄方式連接。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元(多順反子轉(zhuǎn)錄單元)可轉(zhuǎn)錄并表達(dá)一種以上蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元包含為轉(zhuǎn)錄及翻譯該單元內(nèi)所含之任何選定序列所需的調(diào)控組件。且每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可含有相同或不同之調(diào)控組件。舉例而言，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可含有相同終止子。IRES組件或內(nèi)含子可用于轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)基因之功能連接。載體或多核苷酸序列可含有一個(gè)以上轉(zhuǎn)錄單元?！胺g調(diào)控組件”包含待表達(dá)之每個(gè)個(gè)別多肽之翻譯起始位點(diǎn)(AUG)、終止密碼子及PolyA信號(hào)。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)可包括于一些構(gòu)建體中。IRES定義如下。為優(yōu)化表達(dá)，宜移除、添加或修改待表達(dá)之核酸序列之5'非翻譯區(qū)及/或3'非翻譯區(qū)以排除任何潛在多余的不當(dāng)替代性翻譯起始密碼子或在轉(zhuǎn)錄或翻譯層面上可能干擾或減少表達(dá)的其它序列。共同核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Kozak序列GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO :13) ；AUG構(gòu)成起始密碼子)可緊鄰起始密碼子上游插入以增強(qiáng)翻譯且因此增強(qiáng)表達(dá)。此核糖體結(jié)合位點(diǎn)周圍之A/U含量增大進(jìn)一步引起更有效之核糖體結(jié)合。為產(chǎn)生分泌多肽，目標(biāo)基因通常包括編碼前導(dǎo)肽或信號(hào)肽之信號(hào)序列，其將新合成之多肽導(dǎo)引至ER膜且通過ER膜，ER膜為多肽為分泌而途經(jīng)之處。前導(dǎo)肽或信號(hào)肽通常(但非絕對(duì))位于所分泌蛋白質(zhì)之胺基末端，且在蛋白質(zhì)跨越ER膜之后藉由信號(hào)肽酶裂解?；蛐蛄型ǔ?但非必定)含有其自身信號(hào)肽序列。在缺乏天然信號(hào)肽序列之情況下，可將異源信號(hào)肽序列與選定序列融合?；蚩蓪⑻烊恍盘?hào)肽序列置換為異源信號(hào)肽序列。多種信號(hào)肽序列已知于熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者，且寄存于諸如Genbank及EMBL的序列數(shù)據(jù)庫中。“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”或“IRES”描述不依賴于IRES之基因5'而功能性促進(jìn)翻譯起始且允許在動(dòng)物細(xì)胞中自單一轉(zhuǎn)錄物翻譯兩個(gè)順反子(開放閱讀框架)的序列。IRES 提供獨(dú)立核糖體進(jìn)入位點(diǎn)以便翻譯其下游緊鄰的開放閱讀框架。不同于可呈多順反子性 (亦即，編碼自mRNA依序翻譯之多個(gè)不同多肽)之細(xì)菌性mRNA，動(dòng)物細(xì)胞之大部分mRNA呈單順反子性且編碼合成僅一種多肽。使用真核細(xì)胞中之多順反子性轉(zhuǎn)錄物，翻譯可起始于 5'多數(shù)翻譯起始位點(diǎn)，終止于第一終止密碼子，且轉(zhuǎn)錄物自核糖體釋放，從而僅翻譯mRNA 中之第一編碼多肽。在真核細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄物中具有操作性連接至第二或后續(xù)開放閱讀框架之IRES的多順反子性轉(zhuǎn)錄物允許依序翻譯彼下游開放閱讀框架以產(chǎn)生藉由同一轉(zhuǎn)錄物所編碼的兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽。IRES可長(zhǎng)度不一，且來源于多種來源，例如腦心肌炎病毒 (EMCV)、小核糖核酸病毒(例如FMDV)、脊髓灰白質(zhì)炎病毒(PV)或C型肝炎病毒(HCV)。各種IRES序列及其用于載體建構(gòu)之用途已描述且熟知于此項(xiàng)技術(shù)中。下游編碼序列系在不消極影響下游基因之表達(dá)的任何距離處操作性連接至IRES的3'端。IRES與下游基因之起始端之間的最佳或可容許距離可藉由改變距離并量測(cè)隨距離而變之表達(dá)而容易地測(cè)定。如本文中所使用之術(shù)語“內(nèi)含子”系指通常存在于多種真核基因內(nèi)、長(zhǎng)度不一的非編碼核酸序列，該非編碼核酸序列系藉由剪接方法、自新轉(zhuǎn)錄之mRNA前驅(qū)物中移除，內(nèi)含子之任一端處或附近必需存在高度保守序列以便剪接。一般而言，剪接方法需要使內(nèi)含子之5'及3'端正確裂解且將mRNA之所得端準(zhǔn)確接合，以便產(chǎn)生具有用于蛋白質(zhì)合成之適當(dāng)閱讀框架的成熟mRNA。多種剪接供體及剪接受體位點(diǎn)(意謂緊緊圍繞外顯子-內(nèi)含子邊界及內(nèi)含子-外顯子邊界之序列)已表征并描述，且對(duì)于熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者為已知的。如本文中所使用之術(shù)語“目標(biāo)基因”、“所要序列”、“目標(biāo)多核苷酸”或“所要基因” 具有相同含義，且系指編碼目標(biāo)產(chǎn)物之具有任何長(zhǎng)度的多核苷酸序列。選定序列可為全長(zhǎng)或截短基因、融合或標(biāo)記基因，且可為cDNA、基因組DNA或DNA片段。其可為天然序列(亦即天然存在之形式)，或可突變或視需要以其它方式修飾。此等修飾包括密碼子優(yōu)化(以優(yōu)化用于選定宿主細(xì)胞中之密碼子)、人源化或標(biāo)記。此外，為僅列舉幾個(gè)非限制性實(shí)例，其可包括移除或添加順式作用位點(diǎn)(諸如(隱蔽)剪接供體、受體位點(diǎn)及分支點(diǎn))、聚腺苷酸化信號(hào)、TATA盒、chi位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、重復(fù)序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如莖環(huán))、轉(zhuǎn)錄因子或其它調(diào)控因子之結(jié)合位點(diǎn)、限制性酶切位點(diǎn)等。選定序列可編碼分泌多肽、細(xì)胞質(zhì)多肽、細(xì)胞核多肽、膜結(jié)合多肽或細(xì)胞表面多肽。在本說明書之范疇內(nèi)，術(shù)語“功能性連接”或“操作性連接”意謂兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸序列或序列組件以容許其以其預(yù)定方式起作用之方式定位。舉例而言，若啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或終止子能夠控制或調(diào)節(jié)所連接之基因序列以順式位置轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或終止子功能性連接至編碼基因序列。通常(但非必定)，功能性連接之DNA序列為鄰接的， 且在需要接合兩個(gè)多肽編碼區(qū)時(shí)或在分泌信號(hào)肽之狀況下為鄰接的且位于閱讀框架中。然而，盡管操作性連接之啟動(dòng)子通常定位于編碼序列的上游或操作性連接之終止子通常定位于編碼序列的下游，但啟動(dòng)子與編碼序列并非必定鄰接。增強(qiáng)子不一定鄰接，只要其增強(qiáng)編碼序列之轉(zhuǎn)錄。為此，其可定位于編碼序列之上游或下游，且甚至可保持某些距離。若聚腺苷酸化位點(diǎn)以使得轉(zhuǎn)錄經(jīng)由編碼序列行進(jìn)至聚腺苷酸化信號(hào)中之方式定位于編碼序列的 3'端，則聚腺苷酸化位點(diǎn)操作性連接至編碼序列。連接系藉由此項(xiàng)技術(shù)中已知之重組方法 (例如使用PCR方法)、藉由連接于合適限制位點(diǎn)或藉由黏接來實(shí)現(xiàn)。若合適限制性位點(diǎn)不存在，則可根據(jù)常規(guī)實(shí)務(wù)使用合成寡核苷酸連接子或轉(zhuǎn)接子(adaptors)。如本文中所使用之術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”或“DNA序列”系指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段及部分，且系指染色體組或合成來源之DNA或RNA，其可為單股或雙股且表示有義或反義股。序列可為非編碼序列、編碼序列或兩者之混合物。本發(fā)明之核酸序列可使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟知之標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。術(shù)語“編碼”系指核酸中之特定核苷酸序列(諸如染色體中之基因或mRNA)在生物程序中充當(dāng)用于合成具有指定核苷酸(亦即rRNA、tRNA、其它RNA分子)或氨基酸序列之其它聚合物及巨分子之模板的固有特性及由其所獲得之生物特性。因此，若在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中藉由轉(zhuǎn)錄并隨后翻譯mRNA來產(chǎn)生所要蛋白質(zhì)，則基因編碼蛋白質(zhì)?；蚧騝DNA 之編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供于例如EMBL或Genbank之?dāng)?shù)據(jù)庫的序列表中)與非編碼股(用作轉(zhuǎn)錄模板)可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。 編碼蛋白質(zhì)之核酸包括具有不同核苷酸序列、但因基因密碼簡(jiǎn)并而編碼蛋白質(zhì)之相同氨基酸序列的任何核酸。編碼蛋白質(zhì)之核酸及核苷酸序列可包括內(nèi)含子。在序列表中，序列以 DNA而非RNA序列呈現(xiàn)。舉例而言，當(dāng)以DNA呈現(xiàn)時(shí)，起始密碼子系以ATG而非AUG呈現(xiàn)。在本發(fā)明之上下文中，術(shù)語“cDNA”系指藉由逆轉(zhuǎn)錄且通常藉由對(duì)基因所產(chǎn)生之 mRNA或其它RNA進(jìn)行第二股合成所產(chǎn)生的脫氧核酸。若cDNA分子為雙股，則其具有編碼股或有義股與非編碼股或反義股。
如本文中所使用之術(shù)語“表達(dá)”系指在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄及/或翻譯異源核酸序列。 所要產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中之表達(dá)量可基于存在于細(xì)胞中之相應(yīng)RNA或mRNA之量或藉由選定序列所編碼之所要多肽的量來測(cè)定。舉例而言，自選定序列轉(zhuǎn)錄之mRNA可藉由北方墨點(diǎn)雜交(Northern blot hybridization)、核糖核酸酶RNA保護(hù)、與細(xì)胞RNA原位雜交或藉由PCR來定量。選定序列所編碼之蛋白質(zhì)可藉由各種方法來定量，例如ELISA、西方墨點(diǎn)法 (Wetsern blotting)、放射性免疫檢定、免疫沉淀法、檢定蛋白質(zhì)之生物活性，或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行免疫抑制、繼之進(jìn)行FACS分析及PCR。術(shù)語“多肽”與“氨基酸殘基序列”或術(shù)語“蛋白質(zhì)”可互換使用，且系指具有任何長(zhǎng)度之氨基酸多聚物。此等術(shù)語亦包括翻譯后經(jīng)由反應(yīng)被修飾之蛋白質(zhì)，該等反應(yīng)包括(但不限于)糖基化、糖化、乙?；⒘姿峄⒀趸?、酰胺化或蛋白質(zhì)加工。可在維持分子生物功能活性的同時(shí)，在多肽結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾及改變，例如與其它蛋白質(zhì)融合、氨基酸序列取代、 缺失或插入。舉例而言，可在多肽或其潛在核酸編碼序列中進(jìn)行某些氨基酸序列取代且可獲得具有類似特性之蛋白質(zhì)。氨基酸修飾可(例如)藉由對(duì)其潛在核酸序列進(jìn)行定點(diǎn)誘發(fā)突變或聚合酶鏈反應(yīng)介導(dǎo)誘發(fā)突變而來制備。術(shù)語“多肽”因此亦包括例如由免疫球蛋白組份(例如Fc組份)及生長(zhǎng)因子(例如白介素)組成的融合蛋白質(zhì)。如本文中所使用，術(shù)語“抗體”包括多克隆、單克隆、雙特異性、多特異性、人類、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗體之抗原結(jié)合片段(例如Fab或F(ab' )2片段)、二硫鍵鍵接之Fv等。此等抗體可經(jīng)由化學(xué)合成、經(jīng)由重組或轉(zhuǎn)基因方式、經(jīng)由細(xì)胞(例如雜交瘤) 培養(yǎng)或藉由其它方式產(chǎn)生。Fab片段(抗原結(jié)合片段=Fab)由兩條鏈之可變區(qū)組成，該兩條鏈藉由相鄰恒定區(qū)維系在一起。此等Fab片段不僅可藉由蛋白酶消化(例如用木瓜蛋白酶)、自常規(guī)抗體形成，而且類似Fab片段可同時(shí)藉由基因工程產(chǎn)生。其它抗體片段包括F(ab' )2片段，其可藉由胃蛋白酶進(jìn)行蛋白水解分裂來制備。使用基因工程方法可產(chǎn)生縮短之抗體片段，其僅由重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區(qū)組成。此等片段稱為FV片段(可變片段=可變部分之片段)。因?yàn)榇说菷v片段在兩條鏈中缺乏恒定鏈之半胱氨酸之共價(jià)鍵結(jié)，所以Fv片段常為穩(wěn)定的。藉由短肽片段(例如10 至30個(gè)氨基酸，較佳15個(gè)氨基酸)連接重鏈與輕鏈之可變區(qū)為有利的。以此方式，獲得由肽連接子所連接之VH及VL組成的單肽鏈。此種抗體蛋白質(zhì)稱為單鏈Fv(SCFV)。此種scFv 抗體蛋白質(zhì)之實(shí)例獲知于先前技術(shù)。近年來，已開發(fā)用于制備呈多聚體衍生物形式之scFv的多種策略。此目的尤其為產(chǎn)生藥物動(dòng)力學(xué)及生物分布特性改良以及結(jié)合親和力增強(qiáng)的重組抗體。為達(dá)成scFv之多聚，以具有多聚域之融合蛋白質(zhì)形式制備scFv。多聚域可為例如IgG之CH3區(qū)或卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(螺旋結(jié)構(gòu))，諸如亮氨酸拉鏈域(Leucin-zipper domain) 0然而，亦存在利用scFv 之VH/VL區(qū)之間相互作用進(jìn)行多聚化(例如雙功能抗體、三功能抗體及五功能抗體)之策略。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者了解，雙功能抗體意謂二價(jià)同二聚scFv衍生物。將scFv分子中之連接子縮短至5-10個(gè)氨基酸可形成同二聚體，其中發(fā)生鏈間VH/VL重達(dá)。雙功能抗體另外可藉由合并二硫鍵橋來穩(wěn)定化。雙功能抗體-抗體蛋白質(zhì)之實(shí)例獲知于現(xiàn)有技術(shù)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者了解，微型抗體(minibody)意謂二價(jià)同二聚scFv衍生物。其由含有免疫球蛋白(較佳為IgG，最佳為IgGl)之CH3區(qū)作為二聚合區(qū)的融合蛋白質(zhì)組成，此二聚合區(qū)經(jīng)由鉸鏈區(qū)(例如亦來自IgGl)及連接子區(qū)連接至scFv。微型抗體-抗體蛋白質(zhì)之實(shí)例獲知于先前技術(shù)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者了解，三功能抗體(triabody)意謂三價(jià)同三聚scFv衍生物。其中VH-VL不經(jīng)由連接子序列而直接融合之kFv衍生物可形成三聚體。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者亦熟知具有二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)結(jié)構(gòu)且自SCFv所衍生之所謂微型抗體。二聚合、三聚合或四聚合卷曲螺旋結(jié)構(gòu)可進(jìn)行多聚化。在本發(fā)明之一較佳實(shí)施例中， 目標(biāo)基因編碼上述任何彼等所要多肽，較佳編碼單克隆抗體、其衍生物或片段?！澳繕?biāo)多肽”、“目標(biāo)蛋白質(zhì)”或“目標(biāo)產(chǎn)物”包括蛋白質(zhì)、多肽、其片段、肽、融合蛋白質(zhì)，其皆可表達(dá)于選定宿主細(xì)胞中。所要蛋白可為例如抗體、酶類、細(xì)胞因子、淋巴激素、粘附分子、受體及其衍生物或片段，及可充當(dāng)激動(dòng)劑或拮抗劑且/或具有治療或診斷用途之任何其它多肽。尤其，所要蛋白質(zhì)/多肽或目標(biāo)蛋白質(zhì)為例如(但不限于)胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、hGH、tPA、細(xì)胞因子(諸如白介素(IL)，例如 IL-1、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素(IFN) α、IFN β、IFN γ、IFNomega 或 IFNtau、腫瘤壞死因子(TNF)(諸如 TNF α 及 TNF β、 TNF y、TRAIL)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1、VEGF 及納米抗體(nanobody)。亦包括生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素或可充當(dāng)激動(dòng)劑或拮抗劑且/或具有治療或診斷用途之任何其它激素生長(zhǎng)因子及任何其它多肽。根據(jù)本發(fā)明之方法亦可有利地用于生產(chǎn)抗體，諸如單克隆、多克隆、多特異性及單鏈抗體或其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc及Fc'片段)；免疫球蛋白重鏈及輕鏈及其恒定區(qū)、可變區(qū)或超變區(qū)以及Fv及Fd片段?！澳繕?biāo)產(chǎn)物”亦可為反義RNA、tRNA、rRNA、作為核糖蛋白質(zhì)之一部分的其它RNA，或其它調(diào)控RNA。本發(fā)明之方法可在所有真核細(xì)胞中進(jìn)行。細(xì)胞及細(xì)胞系可存在于例如細(xì)胞培養(yǎng)物中，且包括(但不限于)真核細(xì)胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。舉例而言，細(xì)胞可為卵母細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞或任何類型之分化細(xì)胞。其中真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞之方法較佳。其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類、猿、鼠類、大鼠、兔、倉鼠、山羊、牛、綿羊或豬細(xì)胞的方法更佳。用于生產(chǎn)生物藥物的較佳細(xì)胞系或“宿主細(xì)胞”為人類、小鼠、大鼠、猴或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系。更佳為倉鼠細(xì)胞，較佳為BHK21、BHKTK_、CHO、CHO-Kl、CHO-DUKX、CHO-DUKX Bi、CHO-S及CH0-DG44細(xì)胞或任何此等細(xì)胞系之衍生物/后代。尤其較佳為CH0-DG44、 CHO-DUKX, CHO-Kl、CHO-S 及 BHK21，且甚至更佳為 CH0-DG44 及 CH0-DUKX 細(xì)胞。此外，鼠類骨髓瘤細(xì)胞(較佳NSO及Sp2/0細(xì)胞或任何此等細(xì)胞系之衍生物/后代)亦已知可用作生物藥物蛋白質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞系。可在本發(fā)明之含義內(nèi)使用之鼠類及倉鼠細(xì)胞之實(shí)例亦總結(jié)于表1中。表1 真核生產(chǎn)細(xì)胞系
權(quán)利要求
1.聚腺苷酸化信號(hào)，包含核酸，該核酸包含與SEQID NO :9至少75%—致的序列。
2.權(quán)利要求1之聚腺苷酸化信號(hào)，其包含與SEQID NO :8至少75%—致的序列。
3.權(quán)利要求1或2之聚腺苷酸化信號(hào)，其包含與SEQID NO 9或SEQID NO 8至少 80%、85%、90%、95%或 98%—致的序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)，其包含SEQID NO :8。
5.核酸，其序列包含SEQID NO :9ο
6.核酸，其序列包含SEQID NO :8ο
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)或核酸，其中該聚腺苷酸化信號(hào)或該核酸可操作地連接至異源性編碼序列。
8.載體或多核苷酸序列，包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)或核酸。
9.權(quán)利要求8之載體或多核苷酸序列，其包含編碼目標(biāo)異源產(chǎn)物之目標(biāo)異源基因。
10.權(quán)利要求9之載體或多核苷酸序列，其中該目標(biāo)產(chǎn)物為目標(biāo)多肽，且該目標(biāo)多肽為抗體、抗體片段或融合蛋白質(zhì)。
11.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)之載體或多核苷酸序列。
12.權(quán)利要求11之細(xì)胞，其中權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)或核酸可操作地連接至編碼目標(biāo)產(chǎn)物之轉(zhuǎn)錄單元，其中該目標(biāo)產(chǎn)物為由目標(biāo)基因所編碼的目標(biāo)多肽。
13.權(quán)利要求11或12之細(xì)胞，其中該細(xì)胞為倉鼠細(xì)胞。
14.制備由目標(biāo)基因所編碼之目標(biāo)多肽的方法，該方法包含(a)提供含權(quán)利要求9或10之載體或多核苷酸序列的宿主細(xì)胞，或提供權(quán)利要求12或 13之細(xì)胞(b)在允許該等細(xì)胞增殖及表達(dá)該目標(biāo)基因的條件下培養(yǎng)該等細(xì)胞；(c)收集該目標(biāo)多肽，及(d)純化該目標(biāo)多肽。
15.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)或核酸用作絕緣子(insulator)的用途。
16.試劑盒，其包含，權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)之聚腺苷酸化信號(hào)或核酸，載體，細(xì)胞及用于培養(yǎng)該細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于新穎調(diào)控組件以及相關(guān)載體及細(xì)胞。此外，本發(fā)明系關(guān)于自諸如克隆化基因等核酸改良多肽表達(dá)的方法，及在使用該等新穎調(diào)控組件的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)各種多肽。另外，本發(fā)明系關(guān)于該等新穎調(diào)控組件作為絕緣子，用在基因療法中或用于改良宿主細(xì)胞系的用途。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102165060SQ200980137165
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者芭芭拉.埃南克爾 申請(qǐng)人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司