專利名稱：適于在封閉系統(tǒng)中實(shí)施的溫度控制的核酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及一種可以在設(shè)備中操作以快速檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法。更具體地，其涉及與可用于在封閉系統(tǒng)設(shè)備中檢測(cè)樣品中存在的靶核酸的溫度控制檢測(cè)方法相容的核酸處理方法。
背景技術(shù)：
可以精確并且有效地檢測(cè)樣品中之核酸的便攜式設(shè)備對(duì)于醫(yī)藥、工業(yè)、環(huán)境、安全、研究和質(zhì)量控制目的是理想的。優(yōu)選地，這類設(shè)備也是快速的，能夠產(chǎn)生精確的結(jié)果并且利用封閉系統(tǒng)操作，即為了防止產(chǎn)生分解或者意外污染不期望有的核酸或核酸酶而在分析過(guò)程中無(wú)需打開(kāi)的系統(tǒng)。核酸檢測(cè)方法可以分成3個(gè)階段核酸處理、信號(hào)擴(kuò)增和信號(hào)檢測(cè)/分析。這些階段的主要難題是它們一般需要不同的設(shè)備來(lái)進(jìn)行。因此貫穿始終的自動(dòng)化設(shè)備需要用于每個(gè)階段的不同儀器以及將原料從一個(gè)內(nèi)部?jī)x器轉(zhuǎn)移至下一個(gè)的方法。將每個(gè)階段的技術(shù)組合的需求使微型化設(shè)計(jì)復(fù)雜化。對(duì)于核酸處理步驟，基于核酸的檢測(cè)步驟常常需要從天然物質(zhì)中制備核酸。其應(yīng)用范圍從法醫(yī)學(xué)的DNA指紋鑒定到醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)。核酸處理時(shí)無(wú)污染是很重要的， 特別是當(dāng)初始樣品中的核酸濃度很低或者污染可以產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果時(shí)。特別是在法醫(yī)學(xué)和證據(jù)分析中更是如此，此時(shí)初始材料的量可能是皮克級(jí)或者更少。由于在制備步驟中樣品管可能需要在各個(gè)階段打開(kāi)和關(guān)閉，此時(shí)樣品管向環(huán)境打開(kāi)或者被技術(shù)員觸碰很容易發(fā)生污染，因此標(biāo)準(zhǔn)的核酸處理技術(shù)存在問(wèn)題。由于存在樣品可以被污染的情況，因此優(yōu)選可重復(fù)的核酸處理技術(shù)利用旨在使這種污染最小化的方案。核酸經(jīng)處理以使污染最小化后，可以進(jìn)行核酸檢測(cè)方法來(lái)確定樣品中是否存在靶核酸。很多情況會(huì)出現(xiàn)，其中需要在多元混合物中檢測(cè)低水平的特定核酸序列。為此目的而設(shè)計(jì)的方法必須是高度特異的和敏感的。目前不存在可以直接檢測(cè)特定序列之單個(gè)核酸分子的簡(jiǎn)單方法，而且目前應(yīng)用的方法包括擴(kuò)增信號(hào)的一個(gè)或者多個(gè)步驟。用于達(dá)到此目的的最普遍的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。該方法通過(guò)利用熱循環(huán)和耐熱型DNA聚合酶提供靶分子的指數(shù)擴(kuò)增。目前用于擴(kuò)增信號(hào)的PCR技術(shù)通常在進(jìn)行PCR前需要過(guò)長(zhǎng)的純化步驟，包括與蛋白酶孵育、苯酚/氯仿提取和最后的乙醇鹽沉淀步驟。此外，涉及細(xì)胞的DNA純化步驟通常包括將樣品與蛋白酶K和去污劑孵育，這使得細(xì)胞在各溫度下溶解，此時(shí)有害酶從細(xì)胞中釋放出來(lái)，可以使樣品DNA降解并且干擾靶核酸序列的檢測(cè)。I^reTaq 作為蛋白酶K的耐熱型替代品市售，用以清洗DNA而不發(fā)生降解，但是I^eTaq 的溫度活性譜并不理想，因?yàn)槠浔３只钚圆⑶以诟邷叵虏灰浊宄蚨陨沓蔀橐环N污染物。因此研發(fā)一種能夠進(jìn)行簡(jiǎn)單、 關(guān)閉管的反應(yīng)的方法將是有利的，所述反應(yīng)能夠使污染的可能性最小化并且無(wú)需使用蛋白酶K和可能干擾PCR的其他物質(zhì)。該方法的一個(gè)內(nèi)在復(fù)雜性是需要在高溫和低溫之間進(jìn)行重復(fù)性循環(huán)反應(yīng)。因此， 該方法需要更難于微型化的儀器。響應(yīng)于該局限性，已經(jīng)花費(fèi)了大量的精力用于研發(fā)PCR 的單一溫度或者等溫等價(jià)物。一種方法已經(jīng)使用了同時(shí)完成鏈置換和鏈合成的聚合酶，因此無(wú)需進(jìn)行傳統(tǒng)PCR方法中的高溫步驟來(lái)產(chǎn)生單鏈DNA。顯然，需要一種精確、快速和易于操作的方法來(lái)鑒定靶核酸，特別是在多種情況中或者混合群體中之微生物的核酸。術(shù)語(yǔ)“靶區(qū)域”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”、“靶多聚核苷酸”和“靶多聚核苷酸序列”以及其語(yǔ)法等價(jià)物是指被檢測(cè)的核酸區(qū)域。因此，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”或者“靶核酸序列”包括被檢測(cè)的靶核酸，例如樣品中存在的靶核酸。實(shí)質(zhì)上，核酸檢測(cè)過(guò)程中的3個(gè)階段是核酸的制備或者處理、顯示樣品中存在靶核酸之信單一因素的擴(kuò)大、以及由樣品中靶核酸的存在而檢測(cè)單一產(chǎn)品。目前的方法在每個(gè)階段需要不同的儀器，而且必須在經(jīng)微型化的設(shè)備中加入多個(gè)元件以及必須通過(guò)流體靜力或者電動(dòng)力使材料在這些元件中轉(zhuǎn)移。優(yōu)選使每個(gè)步驟簡(jiǎn)單化并且適于在封閉系統(tǒng)中操作，此時(shí)在所述系統(tǒng)中可以在相容的緩沖條件下在相同的元件中進(jìn)行不同階段的反應(yīng)，因而限制了其復(fù)雜性、費(fèi)用、污染并且使核酸檢測(cè)簡(jiǎn)化。發(fā)明概述本文中描述了適于在溫度控制設(shè)備中使用的檢測(cè)樣品中靶核酸的方法。該方法包括i)處理樣品中的核酸，ii)產(chǎn)生顯示樣品中存在靶核酸之單一因素，和iii)檢測(cè)由樣品中靶核酸的存在而產(chǎn)生的單一因素。在第一個(gè)方面中，一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法，該方法包括a.用嗜熱蛋白酶處理樣品，以制備用于檢測(cè)的靶核酸，b.提供產(chǎn)生顯示樣品中存在靶核酸之信號(hào)的檢測(cè)試劑，和c.檢測(cè)信號(hào)，以確定靶核酸的存在，步驟i)、ii)和iii)在單個(gè)容器或者管中有利地進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，容器或者管是設(shè)備。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，設(shè)備是手持設(shè)備。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或者多個(gè)步驟i)、ii)或iii)是溫度控制的。在一個(gè)實(shí)施方案中，嗜熱蛋白酶是EA1。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)在大約65-80°C的溫度下進(jìn)行足以消化蛋白的時(shí)間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟a)進(jìn)一步包括將嗜熱蛋白酶在大約90°C或者以上的溫度下孵育足以使蛋白酶失活的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟a.用嗜溫酶處理樣品，和b.將樣品在低于大約40°C的溫度下孵育足以實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞中去除細(xì)胞壁的時(shí)間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，嗜溫酶是纖維素酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)是熒光。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，PCR檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)PCR。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)等溫檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，等溫檢測(cè)方法是通過(guò)核酸的鏈置換擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、嵌合引物起始的等溫?cái)U(kuò)增、Q-β擴(kuò)增系統(tǒng)或者OneCutEventAmplificatioN進(jìn)行。而又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 所述等溫檢測(cè)方法利用核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NCR)、RNA酶介導(dǎo)的核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RNCR)、聚合酶核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PNCR)、RNA酶介導(dǎo)的檢測(cè)(RMD)、串聯(lián)重復(fù)限制性酶促(TR-REF)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者反式反向互補(bǔ)限制性酶促(IRC-REF)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑由微流體或者固體分配器提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑由微膠囊提供。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，微膠囊預(yù)設(shè)置在容器或者管中。而又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，微膠囊是不耐熱膠囊。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，不耐熱膠囊是瓊脂糖或者蠟珠。而在又一個(gè)實(shí)施方案中，不耐熱膠囊在高于提取步驟中使用的優(yōu)選孵育溫度的溫度下釋放檢測(cè)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑抵抗處理過(guò)程，特別是檢測(cè)步驟所需的任一種酶均抵抗以從生物材料中制備核酸為目的而存在之蛋白酶的蛋白酶剪切。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸的檢測(cè)是自動(dòng)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是血液、尿液、唾液、精液、糞便、組織、拭子(swab)、淚液或者粘液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、真核生物、原生動(dòng)物或者病毒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，設(shè)備或者設(shè)備的元件是一次性的。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，設(shè)備包括進(jìn)口、出口、腔室、發(fā)射熒光檢測(cè)器和激發(fā)光源。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，設(shè)備進(jìn)一步包括微流體、微芯片、納米孔技術(shù)和微型設(shè)備。


圖1.溫度控制設(shè)備中核酸檢測(cè)方法的概述。圖2.利用液體依次遞送試劑的單個(gè)腔室核酸處理和檢測(cè)步驟。圖3.利用經(jīng)包裹試劑的單個(gè)腔室核酸處理和檢測(cè)步驟。圖4.利用經(jīng)包裹試劑的、基于管的核酸處理和檢測(cè)步驟。圖5.實(shí)時(shí)PCR軌跡，其中在相同的封閉管中進(jìn)行處理和檢測(cè)步驟。圖6.當(dāng)在單個(gè)容器中進(jìn)行DNA提取和qPCR時(shí)，對(duì)于不同細(xì)胞數(shù)量的qPCR反應(yīng)中所獲得的Ct值。發(fā)明詳述核酸檢測(cè)方法可以分成3個(gè)階段核酸處理、信號(hào)擴(kuò)增和信號(hào)檢測(cè)/分析。因此， 任何全自動(dòng)的核酸檢測(cè)設(shè)備均需要用于每個(gè)階段的不同儀器，以及將原料從一個(gè)內(nèi)部?jī)x器轉(zhuǎn)移至下一個(gè)的方法，這使得微型化設(shè)計(jì)復(fù)雜化。與所有擴(kuò)增方法(無(wú)論是等溫或者循環(huán)) 相同，本文中公開(kāi)的嗜熱蛋白酶核酸處理方法是受溫度調(diào)節(jié)的。此外，嗜熱處理所需的條件與大部分?jǐn)U增過(guò)程的條件相容。由于這些因素，可以將設(shè)備簡(jiǎn)化成帶有加熱/致冷機(jī)制的一個(gè)容器，以對(duì)原始樣品材料進(jìn)行加工并直至產(chǎn)生可檢出的信號(hào)。還可以容易地加入檢測(cè)儀。因此，本文公開(kāi)的方法使得設(shè)備不帶有泵或者不需要微流體，但是如果需要，這些可以用于更復(fù)雜的下游應(yīng)用中。本文中描述了核酸處理、信號(hào)擴(kuò)增和檢測(cè)的方法，其可用于利用熱控制反應(yīng)鏈的封閉系統(tǒng)設(shè)備中。該設(shè)備可以是便攜式的。利用熱穩(wěn)定性蛋白酶制備樣品中的核酸，并且隨后利用核酸鑒定技術(shù)，包括PCR或者等溫檢測(cè)方法。利用溫度依賴性酶混合物或者溫度控制釋放經(jīng)包裹試劑的熱控制系統(tǒng)使得目前核酸診斷設(shè)備的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單化。降低復(fù)雜性可以降低相關(guān)的失效率和費(fèi)用。這些技術(shù)具有可以進(jìn)行同時(shí)鑒定混合樣品中多個(gè)靶核酸之多重檢測(cè)的附加益處。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“處理”指使樣品中核酸的可利用度增加以進(jìn)行其他操作的過(guò)程。“處理”的隱含意義是核酸不受例如抑制劑、核酸酶、其他酶和核蛋白的干擾，以使其在其他操作方法中是有效的。應(yīng)當(dāng)理解，核酸不需要純化至沒(méi)有非干擾性化合物，因?yàn)槟壳暗脑O(shè)備達(dá)不到此目的。核酸的處理使干擾性化合物的負(fù)面影響最小化。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”、“核酸序列”、“多聚核苷酸”、“多聚核苷酸序列”和其等價(jià)物是指任意長(zhǎng)度的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核酸多聚物，其非限定性實(shí)例包括基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA.mRNA前體、 mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多聚核苷酸、經(jīng)分離和純化的天然存在之DNA或者RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物、片段、基因構(gòu)建物、載體和經(jīng)修飾的多聚核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”、“寡核苷酸”和“多聚核苷酸”之間在長(zhǎng)度上沒(méi)有預(yù)定差別，這些術(shù)語(yǔ)將會(huì)交叉使用。本文中詳細(xì)描述的方法概述于圖1中。在第一個(gè)步驟中，向樣品中加入熱穩(wěn)定性蛋白酶(例如EAl)，以在對(duì)熱穩(wěn)定性蛋白酶活性最佳的溫度下消化雜質(zhì)蛋白?？梢詮拇罅课镔|(zhì)中獲得樣品，包括臨床、食品和飲料或者環(huán)境樣品。典型地，微生物樣品可以通過(guò)提取液體或固體樣品或者通過(guò)擦拭固體表面從環(huán)境資源中獲得并用于食品檢測(cè)。臨床樣品可以便利地從組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、尿液、唾液、精液、拭子或者粘液中獲得。組織樣品可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如細(xì)胞刮取或者活檢技術(shù))收集動(dòng)物組織而獲得。類似地，通常進(jìn)行血液取樣以例如用于病原測(cè)試，并且提取血液樣品的方法是本領(lǐng)域熟知的。同樣地，用于貯存和加工生物樣品的方法也是本領(lǐng)域熟知的。例如，組織樣品可以冷凍直至進(jìn)行測(cè)試。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，一些受試樣品在分級(jí)或者純化步驟后更易于分析，例如將全血分離成血清或者血漿組分。最初還可以利用嗜溫酶降解細(xì)胞壁蛋白或者其他雜質(zhì)。隨后調(diào)整溫度以使嗜熱酶失活，而在某些實(shí)施方案中同時(shí)釋放包含于不耐熱材料中的檢測(cè)試劑。從樣品中制備核酸并且使蛋白酶失活后，核酸與為檢測(cè)已知核酸序列而定制的檢測(cè)試劑相結(jié)合?？梢岳脗鹘y(tǒng)PCR或者等溫信號(hào)擴(kuò)增方法通過(guò)熒光檢測(cè)已知核酸序列。與PCR不同，等溫信號(hào)擴(kuò)增法不需要溫度循環(huán)。PCR和等溫檢測(cè)方法均可以多重化，以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)靶序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法在設(shè)備中進(jìn)行。圖2-4描述了如何在設(shè)備中應(yīng)用該方法的多個(gè)實(shí)施例。優(yōu)選設(shè)備是便攜式的并且允許進(jìn)行封閉系統(tǒng)反應(yīng)，因而僅僅需要在樣品加入和結(jié)果產(chǎn)生之間進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理性調(diào)整。優(yōu)選地，利用溫度起始和終止依次的化學(xué)反應(yīng)，使得可以在沒(méi)有復(fù)雜的泵、閥或者微流體的情況下進(jìn)行多個(gè)步驟?？梢酝ㄟ^(guò)很多簡(jiǎn)單的設(shè)備進(jìn)行熱控制，包括微電子元件、LED、Peltier板或者白熾燈泡。這種設(shè)備的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案具有從核酸處理至信號(hào)擴(kuò)增再至信號(hào)檢測(cè)過(guò)程中所有階段的相容反應(yīng)條件。該檢測(cè)系統(tǒng)可以與專門為緩沖相容性而設(shè)計(jì)的現(xiàn)有技術(shù)相結(jié)
I=I O在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)備包括單個(gè)腔室。在另一個(gè)實(shí)施方案中所述腔室具有外部供應(yīng)的管，例如PCR管，其放置于設(shè)備內(nèi)部。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，設(shè)備包括進(jìn)口，出口，腔室，發(fā)射熒光檢測(cè)器和激發(fā)光源。在其他實(shí)施方案中，設(shè)備進(jìn)一步包括微流體、微芯片、納米孔技術(shù)和微型設(shè)備。設(shè)備或者設(shè)備的元件可以是一次性的。應(yīng)當(dāng)理解，本文所描述的設(shè)備和方法需要使用一系列核酸診斷技術(shù)，其中清洗核酸以去除雜質(zhì)尤其有益，或者需要使用診斷技術(shù)，其中可以調(diào)整本文的設(shè)備和方法以達(dá)到相似的有益效果。用于核酸處理的熱穩(wěn)定性蛋白酶本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，適用于本文描述之方法的樣品可以從環(huán)境(例如土壤、巖石、水和植物材料樣品)中或者個(gè)體(包括個(gè)體的組織或者體液)中獲得，以使樣品含有被測(cè)核酸。將熱穩(wěn)定性蛋白酶加入到樣品中。熱穩(wěn)定性蛋白酶包括在高溫下具有蛋白降解活性的蛋白酶。示例性但非限定性，申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定出EAl蛋白酶是優(yōu)選的熱穩(wěn)定蛋白酶，其在高溫下更易于去除。隨后孵育樣品并使其經(jīng)歷溫度變化。溫度變化后會(huì)發(fā)生蛋白降解。 該步驟在65-80°C下進(jìn)行，因?yàn)檫@些酶在這些溫度之間是高度活化的。在該溫度下，細(xì)胞裂解，蛋白酶使雜質(zhì)蛋白降解。例如，它們快速去除降解DNA的核酸酶，使得這些核酸酶失活， 因而使樣品中靶核酸的降解最小化。而在本文公開(kāi)的優(yōu)選實(shí)施方案中使用嗜熱蛋白酶，可以預(yù)期除蛋白酶之外還可以使用嗜熱酶。為了在說(shuō)明書(shū)中易于引用，本文中嗜熱酶是指蛋白酶。但是，這不應(yīng)當(dāng)看作是對(duì)也可以確定使用的其他酶的限制。最初可以使用在較低溫度下具有活性的嗜溫酶和上述一種蛋白酶的混合物，以從植物、真菌組織、細(xì)菌、孢子和生物膜中弱化或者去除細(xì)胞壁，隨后繼續(xù)進(jìn)行封閉系統(tǒng)的步
馬聚ο本文公開(kāi)的方法應(yīng)用于設(shè)備中依賴于在不同溫度下具有不同活性的蛋白酶和/ 或蛋白酶/細(xì)胞壁降解酶。通過(guò)可變溫度的循環(huán)，可以不需要打開(kāi)系統(tǒng)加入新的試劑而使不同的酶發(fā)揮其活性。對(duì)于需要低溫消化核酸的情況(例如DNA的限制性酶切)，在37°C時(shí)活性很低的蛋白酶不需要去除或者失活。當(dāng)需要進(jìn)行多個(gè)步驟或者多種酶的反應(yīng)時(shí)，可以在酶混合物中使用蛋白酶。由于其在40°C以下活性很低，其他酶反應(yīng)能夠在蛋白酶存在時(shí)發(fā)生。根據(jù)本文公開(kāi)的一個(gè)方面，提供了一種在封閉系統(tǒng)中處理核酸樣品的方法，包括步驟1)將至少一種嗜熱蛋白酶加入到含有測(cè)試核酸的樣品中，和2)使樣品在65-80°C下孵育所需優(yōu)選的一段時(shí)間，以產(chǎn)生裂解細(xì)胞、消化蛋白、消
8化細(xì)胞壁酶中的一種或者多種作用。其中嗜熱蛋白酶在65-80°C下是穩(wěn)定且活化的，但是當(dāng)樣品在90°C或者以上孵育時(shí)不需要加入另外的變性試劑即可失活和/或變性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶來(lái)源包括芽孢桿菌菌株的EA1，其是一種中性蛋白酶。在所提及方法中使用之嗜熱蛋白酶的優(yōu)選特性是1)其在的溫度范圍內(nèi)基本上是穩(wěn)定且活化的，和2)其能夠在90°C或者以上易于失活和/或變性，和3)可選地，其具有在40°C以下活性很低的溫度-活性譜，以使例如同時(shí)使用的嗜溫酶不被降解。通過(guò)蛋白酶的活性以產(chǎn)生裂解細(xì)胞、消化蛋白、消化細(xì)胞壁酶中的一種或者多種作用所需的優(yōu)選孵育溫度是75°C。使得蛋白酶失活和/或變性所需的優(yōu)選孵育溫度是 94°C。但是應(yīng)當(dāng)理解，這些溫度僅僅是作為示例而并不是任何限定。可以預(yù)期，蛋白酶在溫度范圍內(nèi)具有不同的酶活性和穩(wěn)定性譜，并且這種酶動(dòng)力學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。還可以預(yù)期，蛋白酶的這種酶譜可以用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)確定。根據(jù)本文公開(kāi)的另一個(gè)方面，提供了上述處理核酸樣品的方法，該方法包括起始步驟1)將至少一種嗜溫酶和至少一種非特異性嗜熱酶加入到含有被測(cè)核酸的樣品中， 和2)使樣品在40°C以下孵育所需優(yōu)選的一段時(shí)間，以通過(guò)嗜溫酶的活性去除細(xì)胞壁。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嗜溫酶是細(xì)胞壁降解酶。通過(guò)嗜溫酶的活性以去除細(xì)胞壁所需的優(yōu)選起始孵育溫度是37°C。再次地，這不應(yīng)看作是任何限定。已經(jīng)制備核酸并且蛋白酶已經(jīng)失活后，接著檢測(cè)樣品中的靶核酸。可以通過(guò)下述基于PCR的檢測(cè)方法或者基于等溫的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)已知的目標(biāo)核酸序列。靶核酸的信號(hào)產(chǎn)生和檢測(cè)在本文之應(yīng)用方法的一個(gè)方面中，基于PCR的檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)通過(guò)上面詳述的處理方法制備的目標(biāo)核酸序列。“PCR試劑”指用于PCR的任何試劑，通常是用于每個(gè)靶核酸的一組引物、DNA聚合酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)、DNA聚合酶的輔助因子和一種或者多種脫氧核酸核苷-5’ -三磷酸酯(dDTP’ s)或類似的核苷。PCR中使用的其他可選試劑和材料描述于下DNA聚合酶是在引物和模板的混合物中將脫氧核糖核苷單磷酸分子(通常是 3’_羥基)加入到引物末端的酶，但是這種加入是以模板依賴為方式。一般地，延伸產(chǎn)物的合成以新合成鏈的5’至3’方向進(jìn)行，直至合成終止?？捎玫腄NA聚合酶包括例如Taq聚合酶、大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、Klenow聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和本領(lǐng)域已知的其他酶。優(yōu)選地，DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性的，即其對(duì)加熱是穩(wěn)定的，并且優(yōu)選在較高溫度下是活化的，特別是用于使DNA鏈與引物結(jié)合并延伸的高溫。更特別地，熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶在本文中描述的聚合酶鏈反應(yīng)中使用的高溫下基本不失活。這種溫度隨一些反應(yīng)條件而變化，包括PH值、核苷酸組合物、引物長(zhǎng)度、鹽濃度和本領(lǐng)域已知的其他條件。特別地，可用的聚合酶從多種棲熱菌屬(Thermus)細(xì)菌菌種中獲得，例如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis)和黃棲熱菌(Thermus flavus)。其他可用的熱穩(wěn)定性聚合酶從多種微生物來(lái)源獲得，包括Thermococcus literalis、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、熱袍菌菌禾中 (Thermotoga sp.)。這些描述于W0-A-89/06691 (于1989年7月27日公布)中。一些可用的熱穩(wěn)定性聚合酶是市售的，例如AmpliTaq 、Tth，和Perkin Elmer的UlTma Jtratagene 的Pfu，和Vent和New England Biolabs的De印-Vent。從有機(jī)體中分離天然存在的聚合酶以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)遺傳工程酶的一些技術(shù)也是已知的。DNA聚合酶輔助因子指一種非蛋白化合物，酶依賴其發(fā)揮活性。因此，不存在輔助因子時(shí)酶不具有催化活性。一些材料是已知的輔助因子，包括但不限于錳和鎂鹽，例如氯化鹽、硫酸鹽、乙酸鹽和脂肪酸鹽。優(yōu)選是氯化鎂和硫酸鎂。PCR還需要兩種或者多種脫氧核酸核苷-5，-三磷酸酯，例如dATP、dCTP、dGTP和 dTTP中的兩種或者多種。其類似物例如dITP和7-脫氮-dGTP也是可以使用的。優(yōu)選同時(shí)使用四種常見(jiàn)的三磷酸酯(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。本文中描述的PCR試劑在PCR中以適宜的濃度提供和使用，以擴(kuò)增靶核酸。擴(kuò)增所需引物、DNA聚合酶、輔助因子和脫氧核酸核苷-5’ -三磷酸的最小劑量和各自的適宜范圍是本領(lǐng)域熟知的。DNA聚合酶的最小劑量一般是至少大約0. 5單位/100 μ 1溶液，優(yōu)選從大約2至大約25單位/100 μ 1溶液，更優(yōu)選從大約7至大約20單位/100 μ 1溶液。在特定的擴(kuò)增系統(tǒng)中可以使用其他劑量。本文中“單位”定義為74°C時(shí)在30分鐘內(nèi)將IOnmol 的總核苷酸(dNTP’ s)加入到正在延伸的核酸鏈中所需的酶活量。引物的最小劑量是至少大約0. 075 μ Mol，優(yōu)選從大約0. 1至大約2 μ Mol，但是其他劑量是本領(lǐng)域熟知的。輔助因子一般以從大約2至大約15mMol的劑量存在。每種dNTP的劑量一般是從大約0. 25至大約 3. 5mMoL·PCR試劑可以單獨(dú)提供，或者于多種組合物中，或者全部于pH值范圍從大約7至大約9的緩沖溶液中，所述溶液利用任何適宜的緩沖物，其中很多都是本領(lǐng)域已知的。PCR中可以使用的其他試劑包括例如熱穩(wěn)定性DNA聚合酶特異性抗體?？梢栽跀U(kuò)增前利用抗體抑制聚合酶。優(yōu)選地，抗體是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶特異性的，其在大約50°C以下的溫度下抑制DNA聚合酶的酶活性，并且在更高溫度下失活?？捎玫目贵w包括單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。優(yōu)選抗體是單克隆抗體?？梢岳靡阎椒ㄖ苽淇贵w，例如描述于 Harlow 等人，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988) 中的那些抗體。PCR和等溫檢測(cè)方法中可以使用發(fā)光標(biāo)記。一種化合物的發(fā)光可以被第二種化合物淬滅的機(jī)制描述于 Morrison，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques (Kricka ed.， Academic Press, Inc. San Diego，Calif.)，Chapter 13 中。一個(gè)熟知的機(jī)制是熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)、非放射性能量轉(zhuǎn)移、長(zhǎng)距離能量轉(zhuǎn)移、偶極耦合的能量轉(zhuǎn)移和Forster能量轉(zhuǎn)移。 FRET主要需要作為能量供體的一種化合物的發(fā)射光譜必須與作為能量受體的另一種化合物的吸收光譜相重疊。Styer 和 Haugland，1967，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 98 :719 (并入本文作為參考)顯示當(dāng)間距小于10埃時(shí)，一些常見(jiàn)的發(fā)光物-淬滅物對(duì)的能量轉(zhuǎn)移效率可以達(dá)到100%。能量轉(zhuǎn)移率與能量供體和能量受體分子之間距離的6次方成比例地減少。結(jié)果，間距的少量增加使得能量轉(zhuǎn)移率顯著減少，導(dǎo)致能量供體的熒光增加以及能量受體的熒光減少(如果淬滅物的生色團(tuán)也是熒光團(tuán))。在這些方法中，檢測(cè)了與探針結(jié)合之標(biāo)記(優(yōu)選熒光標(biāo)記)的信號(hào)發(fā)射。檢測(cè)序列的暴露是指使檢測(cè)序列易于檢測(cè)，例如易于與檢測(cè)探針結(jié)合。相反地，術(shù)語(yǔ)“隱藏”或者“掩蔽”和其語(yǔ)法等價(jià)物是指使用這些術(shù)語(yǔ)所涉及的元素是不可接近的。例如，當(dāng)檢測(cè)序列與核酸分子而非檢測(cè)探針結(jié)合時(shí)，其被“隱藏”或者“掩蔽”。術(shù)語(yǔ)“雜交”和其語(yǔ)法等價(jià)物是指多亞基結(jié)構(gòu)(通常是二亞基結(jié)構(gòu))的形成，其是由兩個(gè)或者多個(gè)單鏈核酸由于互補(bǔ)堿基配對(duì)作用結(jié)合形成。由于處理系統(tǒng)使用溫度控制，因此PCR可以在與處理過(guò)程相同的容器中進(jìn)行，并且利用設(shè)備中的相同儀器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PCR的緩沖條件與處理過(guò)程的緩沖條件是相容的。脫氧核糖核苷酸、二價(jià)離子和寡核苷酸引物可以與處理試劑一起提供，因?yàn)檫@些不受處理核酸時(shí)使用之酶和過(guò)程的影響。一些DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶，被處理試劑中的嗜熱蛋白酶降解。因此，必須考慮處理后遞送聚合酶的方法。可能的方法是(1)處理過(guò)程完成以后，遞送聚合酶和任何其他敏感試劑。這可以利用微流體或者固體分配器從入口遞送。( 可以將聚合酶和其他敏感試劑以被保護(hù)的形式加入到處理試劑中。(3)可以對(duì)聚合酶進(jìn)行修飾，以保護(hù)其不被蛋白酶降解，例如通過(guò)連接抗體。(4)可以使用抵抗蛋白水解切割的新型聚合酶。提供PCR試劑后，可以利用處理過(guò)程中所使用的相同加熱設(shè)備和控制器進(jìn)行溫度循環(huán)。PCR反應(yīng)可以多重化，以同時(shí)對(duì)幾個(gè)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。本文公開(kāi)的另一個(gè)方面是利用等溫檢測(cè)方法檢測(cè)靶核酸，其中該方法依賴于信號(hào)的靶核酸依賴性擴(kuò)增，所述信號(hào)來(lái)自與核酸探針結(jié)合的可檢出標(biāo)記。等溫?cái)U(kuò)增可以通過(guò)核酸的鏈置換擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、嵌合引物起始的等溫?cái)U(kuò)增、Q-β擴(kuò)增系統(tǒng)
OneCutEventAmp IificatioN。在等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中可以利用的技術(shù)是核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NCR)、RNA酶介導(dǎo)的核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RNCR)。這兩種方法均用DNA—條鏈的選擇性降解替代鏈置換。當(dāng)一條鏈含有核糖核苷酸時(shí)，可以利用限制性內(nèi)切核酸酶或者RNA酶H起始該過(guò)程。聚合酶核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PNCR)依賴于靶DNA存在時(shí)核酸酶的切割，隨后利用DNA聚合酶進(jìn)行延伸過(guò)程。RNA 酶介導(dǎo)的檢測(cè)法(RMD)是一種利用RNA酶H對(duì)DNA: RNA雜交體進(jìn)行鏈降解的方法。RMD是一種有效的線性擴(kuò)增系統(tǒng)，其有時(shí)與其他方法結(jié)合使用。串聯(lián)重復(fù)限制性酶促(TR-REF)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者反式反向互補(bǔ)限制性酶促(IRC-REF)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種方法的兩種變體，其依賴于循環(huán)產(chǎn)生含有串聯(lián)重復(fù)的檢測(cè)探針。這些重復(fù)由DNA聚合酶拷貝，這時(shí)特異性寡核苷酸引發(fā)物可以作為引物起作用。接著，限制性內(nèi)切核酸酶攻擊新形成的雙鏈DNA，使得初始引物和第二引物釋放，以便可以起始兩個(gè)新的循環(huán)。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可以多重化，以同時(shí)對(duì)幾個(gè)目標(biāo)靶核酸序列進(jìn)行檢測(cè)。還可以理解，存在一些具有“鏈侵入”性質(zhì)的核酸，這種鏈侵入導(dǎo)致靶核酸的互補(bǔ)鏈發(fā)生置換，并且形成靶探針雙鏈或者靶探針三鏈，而不需要靶序列首先是單鏈的。多肽核酸(PNAs)和其衍生物能夠進(jìn)行鏈侵入，因此本文公開(kāi)的含有靶核酸結(jié)合區(qū)域(包含PNAs) 的探針可以用于檢測(cè)未完全成為單鏈的靶核酸。環(huán)狀探針中要特別考慮使用包含PNAs的靶結(jié)合區(qū)域，此時(shí)在形成靶探針雜交體之前，探針的靶結(jié)合區(qū)域基本上是雙鏈的。本文中使用的“靶-結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和其等價(jià)物“靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指核酸分子中存在的核酸序列，其與靶核酸中存在的核酸序列完全互補(bǔ)，以允許靶結(jié)合區(qū)域和靶核酸發(fā)生雜交因而形成靶探針雜交體。在本文公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)靶核酸的方法依賴于檢測(cè)或者測(cè)定來(lái)自標(biāo)記物的信號(hào)，優(yōu)選經(jīng)發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記之探針的光發(fā)射。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”是指能夠與核酸連接并且能夠用于提供可檢出信號(hào)或者與第二標(biāo)記物相互作用以修飾第二標(biāo)記物提供之可檢出信號(hào)的任何原子、分子、化合物或者基團(tuán)。優(yōu)選的標(biāo)記物是通過(guò)熒光、化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光產(chǎn)生可檢出信號(hào)的發(fā)光化合物。更優(yōu)選的標(biāo)記物是當(dāng)與掩蔽基團(tuán)(例如淬滅生色團(tuán))足夠接近時(shí)信號(hào)消失或者不可檢出的發(fā)光化合物。還可以使用替代性標(biāo)記系統(tǒng)，其中顯示將標(biāo)記物從可以與固體基質(zhì)結(jié)合的基團(tuán)上切割下來(lái)。一個(gè)示例是生物素標(biāo)記，其可以與經(jīng)固定的抗生物素蛋白結(jié)合，因此探針的非切割部分可以與探針另一端存在的第二標(biāo)記物結(jié)合。這種方法可以用于基于試條法的檢測(cè)中。而更多的檢測(cè)系統(tǒng)可能使用能夠用納米孔技術(shù)識(shí)別的標(biāo)記物。本文中描述的方法可用于經(jīng)單個(gè)標(biāo)記物標(biāo)記之探針的檢測(cè)，盡管可能會(huì)使用多個(gè)標(biāo)記物。當(dāng)利用切割作用使標(biāo)記物(例如熒光團(tuán))從掩蔽基團(tuán)(例如淬滅基團(tuán))完全移除，或者切割作用使得發(fā)生探針變性過(guò)程時(shí)，對(duì)經(jīng)切割的探針進(jìn)行檢測(cè)。這減少了掩蔽基團(tuán)與標(biāo)記物的相互作用，因此使得信號(hào)發(fā)射。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“掩蔽基團(tuán)”是指可以與標(biāo)記物相互作用以使標(biāo)記物的信號(hào)發(fā)射減少的任何原子、分子、化合物或者基團(tuán)。標(biāo)記物和掩蔽基團(tuán)的分離(由于切割作用或者切割作用所引起的探針變性過(guò)程而造成)反過(guò)來(lái)導(dǎo)致相連標(biāo)記物之信號(hào)發(fā)射的可檢出增加。 取決于標(biāo)記物的不同，信號(hào)發(fā)射可以包括光發(fā)射、粒子發(fā)射、有色化合物的出現(xiàn)或者消失以及類似。優(yōu)選的發(fā)光標(biāo)記物和可以相互作用以對(duì)標(biāo)記物發(fā)光進(jìn)行修飾的掩蔽基團(tuán)描述于下面。術(shù)語(yǔ)“生色團(tuán)”是指吸收光能的一種非放射性化合物。一些生色團(tuán)可以經(jīng)激發(fā)而發(fā)光，或者通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，或者通過(guò)光吸收產(chǎn)生熒光。術(shù)語(yǔ)“熒光團(tuán)”是指能夠發(fā)出熒光的化合物，即在一個(gè)頻率下吸收光并且在另一個(gè)(一般較低)頻率下發(fā)射光。術(shù)語(yǔ)“生物發(fā)光”是指一種化學(xué)發(fā)光形式，其中發(fā)光化合物在活的有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)。 生物發(fā)光化合物的示例包括細(xì)菌熒光素酶和熒火蟲(chóng)熒光素酶。術(shù)語(yǔ)“淬滅”是指由第二化合物引起的第一化合物熒光減少(無(wú)論以何種機(jī)制)。淬滅典型地需要化合物緊密接近。如本文中使用，化合物或者化合物的熒光均可稱其被淬滅，并且可以理解兩種用法均指相同的現(xiàn)象。本領(lǐng)域描述的許多熒光團(tuán)和生色團(tuán)均適用于本文公開(kāi)的方法中。選擇合適的熒光團(tuán)和淬滅生色團(tuán)對(duì)，以使熒光團(tuán)的發(fā)射光譜與生色團(tuán)的吸收光譜相重疊。優(yōu)選地，熒光團(tuán)具有較高的斯托克斯位移值(Stokes shift)(最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)之間的差異較大)，以使散射之激發(fā)光的干擾最小化。本領(lǐng)域熟知的合適的標(biāo)記物包括但不限于熒光素及其衍生物例如FAM、HEX、TET 和JOE ；若丹明及其衍生物例如iTexas Red、ROX和TAMRA ；Lucifer Yellow，和香豆素及其衍生物例如7-Me2N-香豆素-4-乙酸，7-0H-4-CH. 3-香豆素-3-乙酸和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸(AMCA)。FAM，HEX，TET，J0E，ROX和 TAMRA 由 Perkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, Calif.)出售。Texas Red 和很多其他合適的化合物由 Molecular Probes (Eugene, Oreg.)出售。適于用作能量供體的化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光化合物的示例包括魯米諾(3-氨基苯二甲酰胼)及其衍生物，和Luciferases。
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而在大部分實(shí)施方案中，優(yōu)選可檢出標(biāo)記物是發(fā)光標(biāo)記物，掩蔽基團(tuán)是淬滅物例如淬滅生色團(tuán)，其他可檢出標(biāo)記物和掩蔽基團(tuán)也是可以的。例如，標(biāo)記物可以是酶，掩蔽基團(tuán)是所述酶的抑制劑。當(dāng)酶和抑制劑充分緊密接近而發(fā)生相互作用時(shí)，抑制劑能夠抑制酶的活性。一旦探針發(fā)生切割或者變性，酶和抑制物分離并且不再能夠相互作用，使得酶活化。多種能夠催化產(chǎn)生可檢出產(chǎn)物的酶和該酶活性的抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如13-半乳糖苷酶和辣根過(guò)氧化物酶。計(jì)算機(jī)相關(guān)的實(shí)施方案可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)電學(xué)方法進(jìn)行設(shè)備控制，所述方法利用溫度循環(huán)設(shè)備典型的硬件、 軟件和固件。同樣地，任何集成的檢測(cè)系統(tǒng)可以使用類似的可程序化設(shè)備。檢測(cè)設(shè)備產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以從簡(jiǎn)單的是/否檢測(cè)(當(dāng)設(shè)備用于檢測(cè)特定試劑時(shí))至實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)(此時(shí)測(cè)定信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)閾值的時(shí)間，從而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù))。類似地，可以以獲取到達(dá)檢測(cè)儀(放置于毛細(xì)管電泳設(shè)備旁某點(diǎn)處)之熒光峰值的形式產(chǎn)生電泳數(shù)據(jù)?？梢岳猛ㄟ^(guò)外部電子端口、無(wú)線技術(shù)、內(nèi)部存儲(chǔ)設(shè)備或者內(nèi)部固件向設(shè)備提供的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為了簡(jiǎn)便的目的，例如具有確定單個(gè)靶核酸是否存在之特定作用的設(shè)備，可以以任何可見(jiàn)顯示器例如光或者LCD或者LED顯示的形式進(jìn)行報(bào)告。當(dāng)數(shù)據(jù)需要更復(fù)雜的分析或者使用者輸入的水平更高時(shí)，原始數(shù)據(jù)、經(jīng)加工的數(shù)據(jù)或者部分經(jīng)加工的數(shù)據(jù)可以通過(guò)任何形式的可移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備或者通信電纜轉(zhuǎn)移至外部計(jì)算機(jī)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)果可以利用無(wú)線技術(shù)以獲取數(shù)據(jù)庫(kù)信息，或者利用存儲(chǔ)在設(shè)備中、可以輔助鑒定樣品中存在之靶核酸的數(shù)據(jù)庫(kù)信息。結(jié)果可以是二進(jìn)制的，即存在或者不存在，或者其可以是定量或者多變量的。
實(shí)施例本文公開(kāi)的方面僅以實(shí)施例的方式描述，并且應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離所附權(quán)利要求限定之范圍的前提下，可以對(duì)其進(jìn)行修飾和添加。實(shí)施例1 液體遞送試劑的單個(gè)腔室設(shè)備圖2描述了本設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案，其包含利用液體依次遞送試劑的單個(gè)腔室處理和檢測(cè)步驟。容器的形狀可以是環(huán)形、方形、三角形或者任何其他可用的形狀，如果需要， 其具有多個(gè)口。根據(jù)其應(yīng)用，該腔室還可以進(jìn)行優(yōu)化以用于微流體樣品或者更大容積。在步驟2A中，將處理試劑和底物加入到腔室中。在步驟2B中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合處理試劑。核酸釋放至溶液中。在步驟2C中，溫度進(jìn)一步升高，以使處理試劑失活。在步驟2D 中詳細(xì)描述了等溫?cái)U(kuò)增/檢測(cè)系統(tǒng)，其中使用單一溫度。將檢測(cè)加入到腔室中。調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合檢測(cè)試劑。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如步驟2E中描述，將檢測(cè)試劑加入到腔室中。在本實(shí)施例中，使反應(yīng)溫度循環(huán)以進(jìn)行定量PCR。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。實(shí)施例2 具有經(jīng)包裹試劑的單個(gè)腔室設(shè)備圖3顯示了利用經(jīng)包裹試劑的單個(gè)腔室處理和檢測(cè)設(shè)備。在步驟3A中，將處理試劑和底物以及檢測(cè)試劑加入到腔室中，但是所述檢測(cè)試劑經(jīng)包裹，以保護(hù)其不被處理過(guò)程使用的蛋白酶降解。在步驟3B中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合處理試劑。核酸釋放出來(lái)。在步驟3C中，完成后，調(diào)節(jié)溫度以使處理試劑失活，同時(shí)隨著包裹珠溶解，檢測(cè)試劑釋放出來(lái)。在步驟3D中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合檢測(cè)試劑。對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增/檢測(cè)系統(tǒng)，使用單一溫度。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。在步驟2E中，在本實(shí)施例中，使反應(yīng)溫度循環(huán)以進(jìn)行定量PCR。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。實(shí)施例3 具有經(jīng)包裹試劑的管容納設(shè)備圖4描述了利用經(jīng)包裹試劑的、基于管的處理和檢測(cè)步驟。在步驟4A中，將含有處理試劑、底物和經(jīng)包裹之檢測(cè)試劑的管置于設(shè)備中并蓋上。在步驟4B中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合處理試劑。核酸釋放出來(lái)。在步驟4C中，完成后，溫度進(jìn)一步升高以使處理試劑失活，同時(shí)隨著包裹珠溶解，檢測(cè)試劑釋放出來(lái)。在步驟4D中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使其適合檢測(cè)試劑。對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增/檢測(cè)系統(tǒng)，使用單一溫度。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。在4E中，在本實(shí)施例中，使反應(yīng)溫度循環(huán)以進(jìn)行定量PCR。在本階段進(jìn)行特定對(duì)象的檢測(cè)，在本實(shí)施例中通過(guò)熒光檢測(cè)。實(shí)施例4 來(lái)自口腔細(xì)胞之核酸的封閉管檢測(cè)圖5詳細(xì)描述了顯示在單個(gè)封閉容器中如何將嗜熱酶與擴(kuò)增和檢測(cè)試劑結(jié)合使用的實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)施例中，所有的試劑，包括未處理的口腔細(xì)胞、處理試劑、擴(kuò)增試劑和檢測(cè)試劑均密封于200 μ 1的PCR管中，并且所有過(guò)程均利用單一溫度進(jìn)行，以從全細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)。依照標(biāo)準(zhǔn)步驟從個(gè)體中獲取口腔拭子。使用標(biāo)準(zhǔn)棉簽，并指導(dǎo)參與者擦拭口腔和牙齦內(nèi)部1分鐘。將拭子上的碎片懸于Iml的5mM Tris (室溫下pH值為8. 3)中。 制備下列PCR和檢測(cè)試劑混合液。引物是，引物1 TCTCCTCCGATTTCAACAGTGA ；引物2， 5' -GGTCGTTGAGGGCAATGC. Platinum. Taq DNA Polymerase Invitrogen,San Diego,USA0
試劑1個(gè)反應(yīng) 50個(gè)反應(yīng)
水 8.9445
緩沖液 2.5125
MgCl2 (已提供) 0.7537.5
引物 1(10 μΜ) 0.525 引物 2(10 μΜ) 0.525
ROX ΙμΜ 0.420
SybrGreen ( 1/2500 ) 0.525
dNTP's ( IOmM) 0.525
Platinum Taq ( 5υ/μ1)_02_10
15750利用該主要混合物，制備下列混雜物(cocktail)。這些是多種試劑的組合物，包含處理試劑、全細(xì)胞或者對(duì)照DNA。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法，該方法包括i)用嗜熱蛋白酶處理所述樣品，以制備用于檢測(cè)的靶核酸， )提供產(chǎn)生表明所述樣品中存在所述靶核酸的信號(hào)的檢測(cè)試劑，以及 iii)檢測(cè)所述信號(hào)，以確定所述靶核酸的存在， 其中所述步驟i)、 )和iii)在單一容器或者管中進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述容器或者管是設(shè)備。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述設(shè)備是手持設(shè)備。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中一個(gè)或者多個(gè)步驟i)、ii)或iii)是溫度控制的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述嗜熱蛋白酶是EA1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟a)在大約65-80°C的溫度下進(jìn)行足以消化蛋白的時(shí)間。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述步驟a)進(jìn)一步包括將所述嗜熱蛋白酶在大約 90°C或者以上的溫度下孵育足以使所述蛋白酶失活的時(shí)間。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟 i)用嗜溫酶處理所述樣品，和 )將所述樣品在低于大約40°C的溫度下孵育足以實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞中去除細(xì)胞壁的時(shí)間。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述嗜溫酶是纖維素或溶菌酶。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述信號(hào)是熒光。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)通過(guò)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PCR檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)PCR。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)通過(guò)等溫檢測(cè)方法進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述等溫檢測(cè)方法通過(guò)核酸的鏈置換擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、嵌合引物引發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增、Q-β擴(kuò)增系統(tǒng)或者 OneCutEventAmplif icatioN 進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述等溫檢測(cè)方法利用核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(NCR)、 RNA酶介導(dǎo)的核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RNCR)、聚合酶核酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PNCR)、RNA酶介導(dǎo)的檢測(cè) (RMD)、串聯(lián)重復(fù)限制性酶促(TR-REF)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、或者反式反向互補(bǔ)限制性酶促(IRC-REF) 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)試劑由微流體或者固體分配器提供。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)試劑由微膠囊提供。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述微膠囊預(yù)設(shè)置在所述容器或者管中。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述微膠囊是不耐熱膠囊。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述不耐熱膠囊是瓊脂糖或者蠟珠。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中當(dāng)暴露于足夠溫度以使膠囊融化或者溶解時(shí)，所述不耐熱膠囊釋放所述檢測(cè)試劑。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)試劑抵抗所述嗜熱蛋白水酶的蛋白酶剪切。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的檢測(cè)是自動(dòng)的。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是血液、尿液、唾液、精液、糞便、組織、拭子、淚液或者粘液。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、真核生物、原生動(dòng)物或者病毒。
26.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述設(shè)備或者所述設(shè)備的元件是一次性的。
27.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述設(shè)備包括進(jìn)口、出口、腔室、發(fā)射熒光檢測(cè)器和激發(fā)光源。
28.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述設(shè)備進(jìn)一步包括微流體、微芯片、納米孔技術(shù)和微型設(shè)備。
全文摘要
本發(fā)明涉及在封閉系統(tǒng)中利用嗜熱蛋白酶處理核酸的方法，其與其他方法串聯(lián)使用，以快速檢測(cè)樣品中存在的靶核酸。這些組合方法使得經(jīng)簡(jiǎn)化的溫度控制設(shè)備能夠在接近關(guān)注下列廣泛應(yīng)用時(shí)進(jìn)行精確地、流線型檢測(cè)醫(yī)藥、工業(yè)、環(huán)境、質(zhì)量控制、安全和研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102203284SQ200980141329
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者D·J·紹爾, P·金能 申請(qǐng)人:賽進(jìn)有限公司