專利名稱：無細(xì)胞體液中npm1核酸的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，包括癌癥的診斷和治療。
背景技術(shù)：
下面對本發(fā)明背景的討論僅用于幫助讀者理解本發(fā)明，并非承認(rèn)描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。核磷蛋白又被稱為B23、核基質(zhì)蛋白和N038，是一種普遍表達(dá)的核仁磷酸蛋白 (nucleolar phoshoprotein)，它能連續(xù)穿梭于細(xì)胞核與胞質(zhì)之間。核磷蛋白的功能包括結(jié)合核酸，調(diào)控中心體復(fù)制和核糖體功能，以及調(diào)控ARF-p53腫瘤抑制通路。編碼核磷蛋白的基因是NPM1。NPMl基因位于染色體5q35上。由染色體相互易位造成的NPMl破壞與多種淋巴造血系統(tǒng)(hematolymphoid)惡性腫瘤有關(guān)O^alini et al. Hematologica, 2007 ；92 (4) :519-532)。這些易位導(dǎo)致多種融合蛋白的形成—— 所述融合蛋白保留了核磷蛋白的N端，并且與腫瘤病癥相關(guān)，包括間變性大細(xì)胞淋巴瘤中的NPM-間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶(NPM-ALK) (Morris et al. Science. 1994 ；263 1281-1觀4)、急性早幼粒細(xì)胞白血病中的NPM-視黃酸受體α (NPM-RAR α ) (Redner et al. Blood. 1996 ；87 :882-88)以及AML/骨髓增生異常綜合征中的NPM-脊髓發(fā)育不良/髓性白血病因子 I(NPM-MLFl) (Yoneda-Kato et al. Oncogene. 1996 ；12 :265-275)。在急性髓性白血病(AML)患者中，約有35%的成年人和6. 5%的兒童被鑒定出 NPMl 基因的雜合突變(Falini et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Cazzaniga et al. Blood. 2005 ；106 :1419-1422)。在AML患者中，迄今已有多種NPMl突變的分子變體被描述，主要集中于外顯子12 (Falini et al. Blood. 2007 ； 109 :874-85)。在AML中已被鑒定出的多種NPMl突變的特征是簡單的1-或2-四核苷酸插入，4-堿基對(bp)或5-bp缺失結(jié)合 9-bp 插入，或 9-bp 缺失結(jié)合 14-bp 插入(Falini et al. Blood. 2007 ； 109 :874-85 ；Chen et al. Arch. Pathol. Lab Med. 2006 ；130 :1687-1692)。NPMl 基因的外顯子 12 的突變通常導(dǎo)致移碼，產(chǎn)生保留在細(xì)胞質(zhì)中的延伸蛋白。NPMl突變與高水平的骨髓母細(xì)胞，高白細(xì)胞(WBC)和血小板計(jì)數(shù)，以及fms相關(guān)酪氨酸激酶 3 內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制(FLT3-ITD)相關(guān)(Thiede et al. Blood. 2006 ；107 :4011-4020)。 具有NPMl突變而沒有FLT3突變的患者在該研究中顯示了明顯較好的總存活率和無疾病存活率(Thiede et al. Blood. 2006 ；107 :4011-4020)。NPMl突變常見于具有正常核型的 AML 中(Schnittger et al. Blood. 2005 ； 106 :3733-3739)。在具有正常核型的 AML 患者群中，多項(xiàng)研究顯示，患有NPMl-突變AML的患者的完全緩解率類似于或明顯高于患有野生型 NPMl AML 患者的完全緩解率(Boissel et al. Blood. 2005 ；106 :3618-3620 ；Falini
4et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Suzuki et al. Blood. 2005 ；106 :2854-2861 ； Dohner et al.Blood. 2005 ；106 :3740-6)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了檢測無細(xì)胞體液中NPMl核酸的方法。在某些方面，本發(fā)明包括確定 NPMl核酸是否包含一個或多個突變。本發(fā)明還提供了基于確定NPMl基因突變(一個或多個)是否存在，確定被診斷為患有AML的個體的診斷和預(yù)后的方法。一方面，本發(fā)明提供了檢測個體無細(xì)胞體液中NPMl核酸是否存在的方法。該個體可以被診斷為患有惡性疾病(例如AML或MDS)，或可以被懷疑患有惡性疾病。另一方面，本發(fā)明提供了確定診斷有血液學(xué)疾病(如AML或MDS)的個體的預(yù)后的方法，包括確定NPMl核酸中是否存在一個或多個突變，其中該NPMl核酸得自該個體的無細(xì)胞體液，以及為所述個體提供預(yù)后，其中NPMl基因中存在一個或多個突變表明該患者的預(yù)后相對于診斷有AML而沒有所述一個或多個突變的患者較好。適合的無細(xì)胞體液包括，例如，血清和血漿。被分離和/或評價的適合的NPMl核酸包括，例如，基因組DNA和RNA (例如，mRNA)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，NPMl突變是相對于SEQ ID NO :1的NPMl序列確定的。在一些實(shí)施方式中，被評價的一個或多個NPMl突變選自圖2A或2B中的突變。在其他實(shí)施方式中，該NPMl突變是插入突變，包括，例如在對應(yīng)于SEQ ID NO 1的1018位的核苷酸之后的插入。在其他實(shí)施方式中，該插入是CTCT或CTCG插入。NPMl突變——包括插入突變—— 的存在與改善的預(yù)后有關(guān)(即，比診斷有血液學(xué)疾病而沒有NPMl突變的個體預(yù)后好)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該改善的預(yù)后是相對于診斷有血液學(xué)疾病而沒有NPMl突變的個體，改善的緩解率或改善的總存活率。在其他實(shí)施方式中，得自無細(xì)胞體液的核酸被進(jìn)一步評價是否存在FLT3基因的一個或多個突變。在一些實(shí)施方式中，該FLT3基因突變是內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)的復(fù)制。在一種解釋下，沒有FLT3突變而進(jìn)一步含有NPMl突變的個體相對于診斷有血液學(xué)疾病并有NPMl突變和FLT3突變之一或兩者的個體，具有改善的預(yù)后。在其他實(shí)施方式中，該方法還包括確定該個體的細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics)。在一種解釋下，具有中等細(xì)胞遺傳學(xué)(intermediate cytogenetics)并進(jìn)一步包含NPMl突變的個體相對于沒有NPMl突變并具有中等、正?；虿罴?xì)胞遺傳學(xué)(poor cytogenetics)的個體，具有改善的預(yù)后。在另一種解釋下，具有正常細(xì)胞遺傳學(xué)并進(jìn)一步包含NPMl突變的個體相對于具有正常細(xì)胞遺傳學(xué)而沒有NPMl突變的個體，具有改善的預(yù)后。在其他實(shí)施方式中，NPMl突變是否存在是通過確定至少部分NPMl核酸的核苷酸序列來評價的。在另一種實(shí)施方式中，NPMl突變是否存在是通過確定至少部分NPMl核酸的大小來評價的。任選地，NPMl核酸被擴(kuò)增。擴(kuò)增可以使用SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :4的寡核苷酸擴(kuò)增引物進(jìn)行。任選地，個體的接合性(zygosity)狀態(tài)被確定。在另一方面，本發(fā)明提供通過確定從無細(xì)胞體液獲得的NPMl核酸中是否存在移位來診斷個體患有血液學(xué)疾病并在檢測到NPMl核酸中的移位時診斷所述個體患有血液學(xué)疾病的方法。在某些實(shí)施方式中，該血液學(xué)疾病是間變性大細(xì)胞淋巴瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病或急性髓性白血病。在其他實(shí)施方式中，移位發(fā)生在NPMl基因和間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶基因、視黃酸受體α基因或脊髓發(fā)育不良/髓性白血病因子1基因其中一個之間。任
5選地，還可以評價個體的NPMl基因和/或FLT3基因中的一個或多個突變，如上述方面所述。本文所用的術(shù)語“樣品”或“患者樣品”包括生物樣品，如組織和體液。“體液”包括但不限于血液、血清、血漿、唾液、腦脊液、胸膜液、淚液、乳管液(lactal duct fluid)、淋巴、痰、尿液、羊水和精液。樣品包括“無細(xì)胞”的體液?！盁o細(xì)胞體液”包括少于約(w/ w)的全細(xì)胞物質(zhì)。血漿或血清是無細(xì)胞體液的例子。樣品可以包括天然或合成來源(即將細(xì)胞樣品制成無細(xì)胞樣品)的樣品。本文所用的“血漿”是指發(fā)現(xiàn)于血液中的無細(xì)胞液體。“血漿”可通過用本領(lǐng)域已知的方法(例如離心，過濾及類似方法)從血液中除去全細(xì)胞物質(zhì)而得到。如本文所用，“外周血漿”是指從外周血液樣品中得到的血漿。本文所用的“血清”包括在使血漿或血液凝固并除去凝固部分后得到的血漿部分。術(shù)語“核酸”意在包含多聚形式的任意長度的核苷酸，其含有任意組合的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及類似物。核酸可以具有三維結(jié)構(gòu)，并可以執(zhí)行任意已知或未知的功能。術(shù)語核酸包括雙鏈、單鏈、部分雙鏈、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和三螺旋的分子。除非另有說明或要求， 本文所述的本發(fā)明的任意實(shí)施方式中，核酸包括雙鏈形式和已知或預(yù)測構(gòu)成雙鏈形式DNA、 RNA或雜交分子的兩種互補(bǔ)形式中的每一種。核酸可被擴(kuò)增、重組，或可以直接從天然來源分離。核酸包括已被擴(kuò)增(例如使用聚合酶鏈反應(yīng))的核酸。核酸的具體例子包括基因或基因片段；基因組DNA ；RNA,包括mRNA、tRNA和rRNA ；核酶；cDNA ；重組核酸；分支核酸；質(zhì)粒和載體。核酸可以是天然的或合成的。本文所用的術(shù)語“基因組核酸”指細(xì)胞中的核酸，該核酸存在于生物體的細(xì)胞染色體(一條或多條)中，該細(xì)胞染色體含有編碼該生物體細(xì)胞的各種蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選的基因組核酸類型是存在于真核細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的基因組核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因組核酸是DNA?；蚪M核酸可以是雙鏈或單鏈，或部分雙鏈，或部分單鏈，或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分子。 基因組核酸可以是完整的或片段的(例如，用限制性內(nèi)切核酸酶消化過的或經(jīng)過超聲處理或通過用本領(lǐng)域已知的方法施加剪切力)。在一些情況下，基因組核酸可以包括來自一個基因的全部或部分，或來自多個基因的序列；來自一個或多個染色體的序列；或來自細(xì)胞全部染色體的序列。眾所周知，基因組核酸包含基因編碼區(qū)、內(nèi)含子、5’和3’非翻譯區(qū)、5’和 3，側(cè)翼DNA和結(jié)構(gòu)區(qū)段，如端粒和中心粒DNA、復(fù)制起點(diǎn)和基因間DNA。表示基因組總核酸的基因組核酸被稱為“總基因組核酸”。如本領(lǐng)域所熟知，基因組核酸可通過提取/純化的方法從無細(xì)胞體液中得到?；蚪M核酸的最終來源可以是正常細(xì)胞或可以是含有基因組核酸中一個或多個突變——例如復(fù)制、缺失、移位或顛換——的細(xì)胞。在基因組核酸的含義中包括經(jīng)過擴(kuò)增步驟的基因組核酸，該擴(kuò)增步驟增加所要檢測的感興趣目標(biāo)序列相對于該基因組核酸中其他核酸序列的含量。如本文所用，術(shù)語“cDNA”是指通過RNA依賴性DNA聚合酶活性(例如逆轉(zhuǎn)錄酶) 的作用從RNA模板產(chǎn)生的互補(bǔ)或拷貝多核苷酸。cDNA可以是單鏈、雙鏈或部分雙鏈。cDNA 可含有非天然核苷酸。cDNA能在合成后被修飾。cDNA可包含可檢測標(biāo)記。如本文所用，在多核苷酸或多肽背景下，術(shù)語“分離的”是指與其天然相關(guān)的細(xì)胞大分子基本分離的分子。如果分子在組成上占與其天然相關(guān)的細(xì)胞大分子的至少25%、50 %、75 %、90 %、95 %或99 %，則該分子是分離的?！盎颉笔侵赴a(chǎn)生RNA所需的調(diào)控和編碼序列的DNA序列，該RNA可以具有非編碼功能(例如，核糖體RNA或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)，或可以包含多肽或多肽前體。只要保留期望的活性或功能，該RNA或多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任意部分編碼。術(shù)語“野生型”是指與天然存在的來源分離時具有基因或基因產(chǎn)物特征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是在群體中最頻繁地觀察到的基因，因此被專門稱為基因的“正?！?或“野生型”形式?！耙吧汀币仓冈谔囟ê塑账嵛恢?一個或多個)處的序列、在特定密碼子位置(一個或多個)處的序列，或在特定氨基酸位置(一個或多個)處的序列。如本文所用，“突變的”、“修飾的”或“多態(tài)的”是指與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時，在序列和或功能性質(zhì)上顯示改變(即，特征改變)的基因或基因產(chǎn)物。“突變的”、“修飾的”或“多態(tài)的” 也指在特定核苷酸位置(一個或多個)處的序列、在特定密碼子位置(一個或多個)處的序列，或在特定氨基酸位置(一個或多個)處的序列?！巴蛔儭币庠诎鄬τ谡Ｐ蛄泻塑账嵝蛄兄兄辽俸塑账岬母淖?。突變可以包括替換、缺失、倒置或插入。對于編碼多肽，突變可以是“沉默的”并且不導(dǎo)致編碼多肽序列發(fā)生改變，或者突變可以導(dǎo)致編碼多肽序列發(fā)生改變。例如，突變可以導(dǎo)致編碼多肽序列發(fā)生替換。對于編碼多肽序列，突變可以導(dǎo)致移碼。術(shù)語“同源性”或“同源的”指同一性的程度。可以有部分同一性或完全同一性。 部分同源的序列是與另一序列相比具有小于100%序列同一性的序列?！半s合的”指在同源染色體片段中一個或多個基因座具有不同的等位基因。如本文所用，“雜合的”也指可在其中一個或多個基因座檢測到不同等位基因的樣品、細(xì)胞、細(xì)胞群或生物體。雜合的樣品也可用本領(lǐng)域已知的方法——例如核酸測序——進(jìn)行確定。例如， 如果測序電泳圖在單個基因座顯示兩個峰，而且這兩個峰大小大致相同，則該樣品可被表征為雜合的?；蛘?，如果一個峰小于另一個峰，但它是較大峰大小的至少約25%，則該樣品可被表征為雜合的。在一些實(shí)施方式中，較小峰是較大峰的至少約15%。在其他實(shí)施方式中，較小峰是較大峰的至少約10%。在其他實(shí)施方式中，較小的峰是較大峰的至少約5%。 在其他實(shí)施方式中，檢測到最小量的較小峰。本文所用的“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，其可以是單鏈或雙鏈，并且呈現(xiàn)有義鏈或反義鏈。核酸可以包括DNA或RNA，并且可以來自天然或合成來源，可以含有任意組合的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物。多核苷酸的非限定性實(shí)例包括基因或基因片段、基因組DNA、外顯子、內(nèi)含子、 mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸，分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離 DNA、任意序列的分離RNA、合成核酸、核酸探針和引物。多核苷酸可以是天然的或合成的。 多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物；尿嘧啶(uracyl)； 其他糖和連接基團(tuán)，如氟核糖(fluororibose)和硫醇鹽；以及核苷酸分支(nucleotide branches)。核酸可被修飾，例如通過與標(biāo)記組分軛合。本定義包含的其他類型的修飾有加帽；用類似物替換一個或多個天然存在的核苷酸；以及引入化學(xué)實(shí)體將該多核苷酸與其他分子如蛋白質(zhì)、金屬離子、標(biāo)記組分、其他多核苷酸或固體載體連接。核酸可以包括已被擴(kuò)增的核酸(例如使用聚合酶鏈反應(yīng))。核酸片段通常包含至少約15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、500、1000
7個核苷酸或更多。較大的片段是可能的，并且可以包含約2000、2500、3000、3500、4000、 5000,7500 或 10000 個堿基。術(shù)語“特異性雜交”指兩個享有高度互補(bǔ)性核酸序列之間的雜交反應(yīng)，其中該雜交將感興趣核酸和其他相關(guān)核酸之間的雜交排除在外。特異性雜交復(fù)合物在允許的退火條件下形成并在任意隨后的洗滌步驟后保持雜交。核酸序列退火的允許條件通?？捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，并且可以，例如，在約6XSSC存在的情況下在65°C下發(fā)生。雜交的嚴(yán)格性可部分地參考進(jìn)行洗滌步驟的溫度表示。這些溫度通常被選定為比特定序列在限定離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C至20°C。Tm是(在限定離子強(qiáng)度和pH下)50%的目標(biāo)序列與完全配對的探針雜交的溫度。本領(lǐng)域已知計(jì)算Tm和核酸雜交條件的等式。本文所用的術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”是指至少與下述雜交條件一樣嚴(yán)格的雜交條件 在 50% 甲酰胺、5xSSC、50mM NaH2PO4, pH 6. 8、0· 5% SDS、0. lmg/mL 超聲波處理的鮭魚精子 DNA以及切Denhart溶液中在42°C下雜交過夜；用h SSC、0. 1 % SDS在45°C下洗滌；以及用0. 2x SSC、0. 1% SDS在45°C下洗滌。在另一個實(shí)例中，嚴(yán)格雜交條件應(yīng)當(dāng)不允許在一段 20個連續(xù)核苷酸上有兩個以上堿基不同的兩個核酸雜交。用作特異性擴(kuò)增(即擴(kuò)增特定目標(biāo)核酸序列)或特異性檢測(即檢測特定目標(biāo)核酸序列)目標(biāo)核酸的引物或探針的寡核苷酸通常能與目標(biāo)核酸特異性雜交。如本文所用，用于擴(kuò)增的“引物”是與目標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸，該目標(biāo)核苷酸序列在處于引物延伸啟動(例如，與應(yīng)用——如PCR——相關(guān)的引物延伸)的條件下時能作為合成的啟動點(diǎn)，并在DNA或RNA聚合酶存在的情況下使核苷酸添加到引物的3’末端。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，引物的3’核苷酸與對應(yīng)核苷酸位置的目標(biāo)序列互補(bǔ)，以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)表達(dá)和擴(kuò)增。“引物”可以天然存在于如純化的限制性消化產(chǎn)物中，或可以合成產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語“引物”包含全部形式的可被合成的引物，包括肽核酸引物、鎖定核酸引物、 硫代磷酸修飾的引物、標(biāo)記的引物，以及類似物。引物長度通常是至少約10、15、20、25、30、 35、40、45、50或更多個核苷酸。具體引物應(yīng)用的最優(yōu)長度可用H. Erlich，PCR Technology, Principles and Application for DNA Amplification(1989)中所述的方法容易地確定?！疤结槨敝竿ㄟ^雜交與目標(biāo)核酸相互作用的核酸。探針可以是寡核苷酸、人工染色體、人工染色體片段、基因組核酸、基因組核酸片段、RNA、重組核酸、重組核酸片段、肽核酸 (PNA)、鎖定核酸、環(huán)狀的雜環(huán)寡聚體、或核酸的軛合物。探針可包含修飾的核苷堿基和修飾的糖部分。探針可以與目標(biāo)核酸序列完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。探針可用于檢測目標(biāo)核酸的存在與否。探針(一個或多個)能用于例如根據(jù)目標(biāo)的序列特征檢測核酸序列中是否存在突變。探針可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的，或用本領(lǐng)域熟知的多種方式中任意一種進(jìn)行修飾。探針可以與目標(biāo)核酸特異性地雜交。探針的長度通常為至少約10、15、20、25、30、35、40、50個核苷酸或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，NPMl探針與核酸特異性地雜交，該核酸包含與包含核苷酸位點(diǎn)1018和1019的SEQ ID NO 1的區(qū)域基本上同一的至少20個核苷酸。優(yōu)選地， 探針與野生型NPMl序列或包含插入突變的NPMl序列特異性地雜交。本文所用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記”是指用于鑒定感興趣目標(biāo)分子的分子、化合物或分子組(例如檢測系統(tǒng))。典型地，可檢測標(biāo)記代表檢測系統(tǒng)的組分，并與另一分子相連，該分子與目標(biāo)分子特異性地結(jié)合。在一些情況下，可檢測標(biāo)記可以直接被檢測。在其他情況下， 可檢測標(biāo)記可以是結(jié)合對的部分，其隨后能被檢測到。來自可檢測標(biāo)記的信號能通過多種手段檢測到，并且取決于可檢測標(biāo)記的性質(zhì)。檢測可檢測標(biāo)記的手段的實(shí)例包括但不限于光譜學(xué)手段；光化學(xué)手段；生物化學(xué)手段；免疫化學(xué)手段；電磁學(xué)手段；放射化學(xué)手段或化學(xué)手段，如熒光、化學(xué)熒光或化學(xué)發(fā)光；或任意其他適合的手段。術(shù)語“目標(biāo)核酸”和“目標(biāo)序列”在本文中可互換地使用，并且指擬被鑒定的核酸序列。目標(biāo)序列可以是DNA或RNA?！澳繕?biāo)序列”可以是基因組核酸。目標(biāo)序列可以包括野生型序列；含有點(diǎn)突變、缺失或復(fù)制的核酸序列；來自單個基因的全部或部分，或來自多個基因的序列；來自一個或多個染色體的序列；或任意其他感興趣序列。目標(biāo)序列可以呈現(xiàn)特定基因的可選序列或等位基因。目標(biāo)序列可以是雙鏈或單鏈，或部分雙鏈，或部分單鏈， 或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分子。目標(biāo)序列可以是約1-5個堿基、約10個堿基、約20個堿基、約50個堿基、約100個堿基、約500個堿基或更多。本文所用的術(shù)語“擴(kuò)增(amplification/amplify) ”包括拷貝目標(biāo)核酸從而增加所選核酸序列的拷貝數(shù)的方法。擴(kuò)增可以是指數(shù)的或線性的。目標(biāo)核酸可以是DNA或RNA。 用該方式擴(kuò)增的序列形成“擴(kuò)增子”或“擴(kuò)增產(chǎn)物”。盡管后文所述的示例性方法涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的擴(kuò)增，但本領(lǐng)域熟知許多其他擴(kuò)增核酸的方法(例如，等溫方法、滾環(huán)方法等等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這些其他方法可以代替PCR方法或與PCR方法一起使用。參見，例如，Saiki，“Amplification of Genomic DNA"in PCR Protocols (1990), Innis et al. , Eds. , Academic Press,San Diego,CA,pp 13-20 ；ffharam,et al. , Nucleic Acids Res. (2001), Jun 1 ；29(11) :E54-E54 ； Hafner, et al. ， Biotechniques (2001), 4 852-6，858，860。如本文所用，術(shù)語“約”就定量而言是加或減10%。如本文所用，術(shù)語“正常核型”指沒有染色體畸變的細(xì)胞，染色體畸變包括但不限于移位、倒置以及染色體外成分如微衛(wèi)星DNA的存在。本文所用的術(shù)語“接合性狀態(tài)”指如通過本領(lǐng)域已知的和本文所述的測試方法所確定表現(xiàn)為雜合、純合或半合的樣品、細(xì)胞群或生物體。術(shù)語“核酸的接合性狀態(tài)”指確定核酸來源是否表現(xiàn)為雜合、純合或半合?！敖雍闲誀顟B(tài)”可以指序列中單個核苷酸的差異。在一些方法中，單個突變的樣品的接合性狀態(tài)可分為純合野生型、雜合型(即一個野生型等位基因和一個突變等位基因)、純合突變型或半合型(即野生型或突變型等位基因單個拷貝)。由于臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)進(jìn)行的對血漿或細(xì)胞樣品的直接測序不能可靠地區(qū)分半合性和純合性，所以在一些實(shí)施方式中這兩類被分為一組。例如，沒有或最小量野生型核酸被檢測到的樣品被稱為“半合/純合突變型”。本文所用的短語“確定預(yù)后”指預(yù)測患者病癥的病程或結(jié)果的過程。術(shù)語“預(yù)后” 不是指100%準(zhǔn)確地預(yù)測病癥的病程或結(jié)果的能力，而是指確定表現(xiàn)出給定病癥/標(biāo)記的患者與沒有表現(xiàn)出該病癥的那些個體相比發(fā)生某一病程或結(jié)果的可能性的增加或減少。預(yù)后的性質(zhì)取決于具體的疾病和被評價的病癥/標(biāo)記。例如，預(yù)后可表示為患者預(yù)期存活的時間量、疾病緩解的可能性或疾病預(yù)期維持緩解的時間量。附圖簡述

圖1是核磷蛋白(NPMl)基因及NPMl基因的產(chǎn)物核磷蛋白的示意圖。術(shù)語“NES”、 “NLS”和“NoLS”分別表示核磷蛋白的核輸出信號、核定位信號和核仁定位信號?！?*”表示 NPMl基因和核磷蛋白中的突變位點(diǎn)。
9圖2A顯示了在AML患者中鑒定出的外顯子12中的多種NPMl突變的核苷酸序列。 NPMl突變體序列相對于野生型(“WT”)NPM1序列被顯示。圖2B顯示了由圖2A所示的突變產(chǎn)生的核磷蛋白的部分核仁定位信號(以SEQ ID NO 2的氨基酸觀6開始)。圖3顯示了骨髓細(xì)胞、血漿和外周血細(xì)胞中存在的NPMl突變的檢測結(jié)果。A部分表示來自單個AML患者的外周血細(xì)胞(PB細(xì)胞；上)、骨髓細(xì)胞(BM細(xì)胞；中)和外周血漿 (下)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析。WT NPMl(212bp)存在于每個樣品類型中，而含有4bp插入的突變型NPMl(216bp)僅在骨髓和血漿中被檢測到。最左側(cè)的峰代表200bp的標(biāo)準(zhǔn)品。 B部分表示與WT患者相比雜合患者中NPMl突變的序列分析。插入位點(diǎn)用黑框畫出，表明產(chǎn)生的RNA中移碼的起始(自插入位點(diǎn)從右向左閱讀)。圖4顯示了 NPMl突變的大小分析的結(jié)果。分析是在AML患者血漿上進(jìn)行的。結(jié)果揭示了新的4bp缺失突變。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析區(qū)分出WTNPMl (212bp ；下)、上文所述的4bp插入突變Ql6bp沖)和新的NPMl的4bp缺失突變Q08bp ；上)。最左側(cè)的峰代表200bp的標(biāo)準(zhǔn)品。圖5顯示了 NPMl插入突變的存在與AML患者改善的臨床結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)。NPMl 突變給對治療反應(yīng)緩慢的AML患者帶來了顯著的存活優(yōu)勢。Kaplan-Meier圖將數(shù)周內(nèi)的患者存活率作為花費(fèi)35天以上的AML患者群體的比例給出，以證明對治療的反應(yīng)。顯示患者存活周數(shù)與花費(fèi)35天以上證明對治療反應(yīng)的AML患者群體的比例。該圖比較了 NPMl突變陽性和突變陰性患者，顯示攜帶NPMl突變的患者具有顯著的存活優(yōu)勢(P = 0. 027)。(E，總事件；N，死亡數(shù))。圖 6 提供了人 NPMl 基因的 cDNA 序列(SEQ ID NO :1)。圖7提供了核磷蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。圖 8 提供了 FLT3 的 cDNA 序列(SEQ ID NO :5)。發(fā)明詳述本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn)能使用從患者的無細(xì)胞體液(例如血清或血漿)中分離的核酸可靠地檢測NPMl基因的突變，該突變導(dǎo)致多種血液學(xué)惡性腫瘤。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外周血血漿是檢測AML患者中NPMl突變的可靠樣品類型。同時檢測骨髓細(xì)胞和血漿時，在成對的樣品中存在完全一致性。此外，血漿分析顯示了比用外周血細(xì)胞進(jìn)行NPMl突變分析更高的靈敏度。不欲受任何理論的約束，認(rèn)為癌細(xì)胞高于正常細(xì)胞的周轉(zhuǎn)率導(dǎo)致了從血漿中檢測 NPMl突變比從外周血細(xì)胞檢測有更高的靈敏度。由于該周轉(zhuǎn)，癌細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入循環(huán)，它們都可以作為檢測的底物。在血液學(xué)惡性腫瘤——例如AML和MDS中，大量腫瘤細(xì)胞在骨髓中。然而，只有相對少的白血病細(xì)胞在一些患者的外周血中循環(huán)，因此，在一些患者中外周血分析對于檢測NPMl突變是不可靠的。血漿和/或血清檢測具有優(yōu)勢，因?yàn)槠浜性醋怨撬枘[瘤細(xì)胞的核酸。而且，檢測血漿/血清最小化了殘留正常細(xì)胞對所得測量值的影響，從而有助于避免有時由于殘留正常細(xì)胞“稀釋”惡性骨髓樣品引起的低估。認(rèn)為這是由于這樣的事實(shí)在血漿中正常細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡產(chǎn)生的碎片被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)迅速清除，而白血病細(xì)胞周轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的碎片則很少被有效地清除。如本文所述，血漿被證明比外周血細(xì)胞更靈敏，有8 %的基于細(xì)胞的檢測產(chǎn)生假陰性結(jié)果。外周血細(xì)胞中的假陰性結(jié)果可能主要?dú)w因于骨髓疾病沒有循環(huán)的白血病細(xì)胞，而血漿中含有來自已在骨髓中死去的惡性腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而給出陽性結(jié)果。此外，血漿與外周血細(xì)胞同樣采集便利，避免對痛苦性和創(chuàng)傷性獲取骨髓樣品的需要。為了進(jìn)一步確認(rèn)檢測血漿的臨床價值，將突變結(jié)果與臨床觀察關(guān)聯(lián)，該臨床觀察與進(jìn)行骨髓檢測時所報(bào)告的類似。具有中等細(xì)胞遺傳學(xué)的NPMl突變-陽性患者較好的存活與實(shí)現(xiàn)緩解需要35天以上的治療存在顯著關(guān)聯(lián)。這一觀察說明，在35天治療中存活而沒有顯示緩解跡象的AML患者，如果他們具有NPMl突變，則不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是高危的。核磷蛋白基因(NPMl)核磷蛋白基因(NPMl)的雜合突變最近被描述為急性髓性白血病(AML)中最頻繁的基因損害之一。NPMl基因位于人染色體5q35上。其包含12個外顯子。圖1顯示了 NPMl 基因的示意圖。包含NPMl基因的基因組DNA的示例性序列可以在NCBI GenBank登錄號 NW_001838954中找到，該序列通過弓|用并入本文。NPMl mRNA的幾種變體在本領(lǐng)域中是已知的。許多已知序列是全長cDNA序列， 而有些是部分cDNA序列。示例性NPMl cDNA序列包括但不限于NCBI GenBank登錄號NM_002520、NM_199185、NM_001037738、BC002398、BC050628、BC021983、BC021668、 BC016824、BC016768、BC016716、BC014349、BC012566、BC008495、DQ303464、BC009623、 BC003670、AY740640、AY740639、AY740638、AY740637、AY740636、AY740635、AY740634、 M286990上述全部NPMl變體的序列通過引用并入本文。SEQ ID N0:1(圖6)中提供了 NPMl 基因的一個示例性cDNA序列。AML中已鑒定出的最常見的NPMl突變是1_或2_四核苷酸插入、4_堿基對(bp) 或5-bp缺失結(jié)合9-bp插入以及9-bp缺失結(jié)合14-bp插入。這些突變大部分位于外顯子 12中，并且顯示于圖2A中。NPMl存在于兩個可變剪接的同種型中。普遍存在的同種型B23. 1存在于所有組織中，并且包含294個氨基酸，而截短的蛋白B23. 2缺少B23. 1的最后35個C端氨基酸，并且以非常低的水平表達(dá)。NPMl分子(圖1中示意性地示出)包含不同的功能結(jié)構(gòu)域，包括形成NPM 二聚體或六聚體所需的N端同型寡聚(homo-oligomerization)結(jié)構(gòu)域；在靶向其他蛋白質(zhì)中涉及的異型二聚結(jié)構(gòu)域，如核仁蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P14/ 另起讀框(P14ARF，以下簡稱ARF)；以及對于與核糖體RNA加工相關(guān)的RNA締合至關(guān)重要的 C端核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SEQ ID NO :2(圖7)中提供了 B23. 1 NPMl同種型的氨基酸序列。盡管大部分NPMl位于核仁內(nèi)，但其能從核內(nèi)穿梭到胞質(zhì)內(nèi)。核定位信號(NLS)驅(qū)使NPMl從胞質(zhì)進(jìn)入核漿，其中NPMl通過其核仁定位信號(NoLQ移位至核仁。NoLS中特別重要的殘基是SEQ ID NO 2的色氨酸288和色氨酸290殘基。NPMl保持在核仁內(nèi)，即使其在SEQ ID NO 2的殘基94-102和42-49中含有高度保守的疏水性富含亮氨酸的核輸出信號(NES)基序，該基序驅(qū)動NPMl離開細(xì)胞核。NPMl突變體最獨(dú)特的特征之一是其在白血病細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的異常定位。這與白血病突變體C端的兩個改變有因果關(guān)系(i)產(chǎn)生了額外的富含亮氨酸的NES基序；和(ii)喪失了在SEQ ID NO 2的288和290位之一或兩者處的色氨酸殘基，該殘基對NPMl的核仁定位是至關(guān)重要的。兩個色氨酸的突變與非常常見的NES基序L-XXX-V-XX-V-X-L有關(guān)；色氨酸觀8的保留與稀有NES變體有關(guān)，其中第二位的纈氨酸被亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸代替(Falini et al. Blood. 2006 ； 107 :4514-23)。大部分NPMl突變體共有最后 5個氨基酸殘基VSLRK。AML中的NPMl突變通常與正常細(xì)胞遺傳學(xué)和FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制(FLT3-ITD) 相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，在具有正常核型的AML患者組中，具有NPMl突變的患者具有類似或顯著高于具有野生型NPMl AML患者的完全緩解率(Boissel et al. Blood. 2005 ； 106 3618-3620 ；Falini et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Suzuki et al. Blood. 2005 ； 106 :2854-2861 ；Dohner et al. Blood. 2005 ；106 :3740-6)。多數(shù)研究顯示了在無事件(event-free)存活率和總存活率中向有利結(jié)果的統(tǒng)計(jì)趨勢。在其他分子異常背景下的進(jìn)一步分析顯示，具有NPMl突變而沒有伴隨的fms相關(guān)酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制(FLT3-ITD)的患者比具有FLT3-ITD的AML患者具有更有利的預(yù)后，并與年輕患者中5年約60%的存活概率相關(guān)(Dohner et al. Blood. 2005 ；106 3740-6)。FLT3 基因FLT3基因位于人染色體13上。NCBI GenBank登錄號NG_007066中公開了人染色體中FLT3基因的示例性序列，其通過引用并入本文。圖8中示出了 FLT3基因的示例性 cDNA序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在無細(xì)胞體液中單獨(dú)檢測FLT3基因或同時檢測 FLT3基因與NPMl的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供單獨(dú)檢測FLT3基因中一個或多個突變或同時檢測FLT3基因中一個或多個突變與NPMl基因中一個或多個突變的方法。生物樣品采集和制備本發(fā)明的方法和組合物可用來使用從個體獲得的生物樣品檢測NPMl核酸(例如， 基因組DNA和/或RNA)中的突變。核酸可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意方法從樣品中分離。如果必要，樣品可用離心或類似方法收集或濃縮。樣品中的細(xì)胞可被裂解，如用酶、 加熱、表面活性劑、超聲波或其組合進(jìn)行處理，以便制備無細(xì)胞液體?？蛇x地，NPMl基因中的突變可根據(jù)美國專利公開US 2007/0248961所述的方法用無細(xì)胞體液進(jìn)行檢測，其通過引用并入本文。血漿或血清制備方法本領(lǐng)域熟知血漿或血清的制備方法?？梢允褂谩靶迈r”血漿或血液，或冷凍(儲存) 并隨后融化的血漿或血清。冷凍(儲存)的血漿或血清應(yīng)當(dāng)最佳地保持在-20至-70攝氏度的儲存條件下，直到被融化和使用?！靶迈r”血漿或血液應(yīng)放入冰箱或保持在在冰上直到被使用，核酸(例如，RNA，DNA或總核酸)提取應(yīng)盡快進(jìn)行。下文描述了示例性方法。血液可用標(biāo)準(zhǔn)方法抽入采集管，優(yōu)選硅化處理的玻璃管中，其中不含有制備血漿用抗凝劑或含有EDTA、檸檬酸鈉、肝素或制備血漿用類似抗凝劑。如果制備血漿或血清用于儲存，優(yōu)選的方法——盡管不是絕對要求——是將血漿或血清在冷凍前首先從全血中分離。這樣能減少冷凍和融化的細(xì)胞裂解釋放出的額外的胞內(nèi)RNA的負(fù)擔(dān)，該細(xì)胞能通過釋放PCR抑制劑如卟啉和血色素，降低擴(kuò)增分析的靈敏度或干擾擴(kuò)增分析?！靶迈r”血漿或血清可通過離心從全血中分離，其優(yōu)選使用在300-800倍重力下溫和離心5至10分鐘，或用其他標(biāo)準(zhǔn)方法分離。應(yīng)該避免能分離出凋亡小體的高離心速率。由于肝素可以干擾RT-PCR，使用肝素化的血液需要用肝素酶預(yù)處理，隨后在逆轉(zhuǎn)錄前除去鈣。Imai，H. ,et al. ,J.Virol.
12Methods36 =181-184, (1992)。因此，EDTA對于計(jì)劃PCR擴(kuò)增的血液樣品是優(yōu)選的抗凝劑。核酸提取和擴(kuò)增任選地，無細(xì)胞液體中的核酸可被擴(kuò)增以便易于突變分析。多種提取方法適于分離DNA或RNA。適合的方法包括酚和氯仿提取。參見ke Maniatis et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press,page 16. M(1989)。多種商業(yè)試劑盒也能得到適合的DNA和RNA，其包括但不限于 QIAamp 微型血液試劑盒、Agencourt Genf ind 、Roche Cobas Roche MagNA Rire 或使用Eppendorf Phase Lock Gels 的酚氯仿提取以及NucliSens提取試劑盒 (Biomerieux, Marcy 1' EtoiIe， France)。胃砠^^去巾，^Tffi MagNAPure LC mRNA HSi^ 劑盒禾口 Mag NA Pure LC Instrument (Roche Diagnostics Corporation, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)從患者血液/骨髓樣品中提取mRNA。從組織、細(xì)胞、血漿或血清中提取的核酸可用本領(lǐng)域熟知的核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增。這些擴(kuò)增方法中有許多也可以通過設(shè)計(jì)以特定方式與具體目標(biāo)序列相互作用或雜交的寡核苷酸引物或探針，用于簡單地檢測突變的存在。這些技術(shù)的實(shí)例而非限制包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)；嵌套式PCR;連接酶鏈反應(yīng)。參見Abravaya， K.，et al.，Nucleic Acids Research 23 :675-682, (1995)；分支 DNA 信號擴(kuò)增，Urdea, M. S.，et al.，AIDS 7(suppl 2) =Sll-S 14，(1993)；可擴(kuò)增 RNA 報(bào)道分子；Q-β 復(fù)制；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增；回旋式DNA擴(kuò)增；鏈移位活化；成環(huán)探針技術(shù)；基于核酸序列的等溫?cái)U(kuò)增 (NASBA)。參見 Kievits，Τ. et al.，JVirological Methods 35:273-286，(1991)；侵染技術(shù)；或其他序列復(fù)制分析或信號擴(kuò)增分析。血清和血漿RNA靈敏、特異且豐富，可用于替代基于(基因組)DNA的檢測。RNA 可以根據(jù) Boom，R.，et al.，J. Clin. Micro. 28 :495-503, (1990)的方法或改進(jìn)，用硅顆粒、 玻璃珠或硅藻從血漿或血清中提取。描述了由Cheung，R. C.，et al.，J. Clin Micro. 32 2593-2597，(1994)改進(jìn)的方法的應(yīng)用。例如，按大小分離的硅顆粒是按以下方法制備的將60克二氧化硅(Si02，Sigma Chemical Co.，St. Louis,Mo.)懸浮在500毫升脫礦物質(zhì)的滅菌雙蒸水中。然后將懸浮液在室溫下靜置M小時。吸去430毫升上清液，加入脫礦物質(zhì)的滅菌雙蒸水至體積為500毫升， 將顆粒物重懸浮在其中。在又靜置5小時后，吸去440毫升上清液，加入600微升HCl (32% wt/vol)以調(diào)整懸浮液的pH至2。分裝懸浮液并遮光保存。裂解緩沖液制備方法為將120克硫氰酸胍(GuSCN，F(xiàn)luka Chemical, Buchs，
Switzerland)溶解在 100 毫升 0. IM Tris 鹽酸(Tris-HCl) (pH6. 4)、22 毫升 0. 2MEDTA-
用 NaOH 調(diào)整 pH 至 8. O-禾口 2. 6 克 Triton X-100 (Packard Instrument Co.，Downers
Grove, 111.)中。然后，將溶液混勻。洗滌緩沖液制備方法為將120克硫氰酸胍(GuSCN) 溶解在 100 毫升 0. IM Tris-HCl (pH6. 4)中。100至250微升(在微小疾病(minimal disease)的情況下需要更多量)血漿或血清與40微升如上制備的硅懸浮液和900微升如上制備的裂解緩沖液混合，用Eppendorf 5432混合器在室溫混合超過10分鐘。然后將混合物以12000Xg離心1分鐘，吸出并棄去上清液。然后用450微升如上制備的洗滌緩沖液將硅-RNA沉淀洗滌兩次。再將該沉淀用 1毫升70% (vol/vol)乙醇洗滌兩次。最后將該沉淀用1毫升丙酮洗滌，并在56攝氏度的加熱塊(heat block)上干燥10分鐘。將該沉淀在56攝氏度下重懸浮于20至50微升二乙基焦碳酸酯處理的水中10分鐘，以洗脫RNA。該樣品也能可選地用TE緩沖液在56攝氏度下洗脫10分鐘，TE緩沖液由以下組成10毫摩爾Tris-HClU毫摩爾EDTA(pH 8.0)以及 RNA 酶抑制劑(RNAsin, 0. 5U/微升，Promega)，有或無蛋白酶 K (100ng/ml)，如 Boom, R.，et al.，J. Clin. Micro. 29 :1804-1811, (1991)所述。在洗脫后，將樣品以 12000Xg 離心 3 分鐘，回收含有RNA的上清液。作為可選的方法，RNA可以用 Chomczynski，P. and Sacchi，N.，Analytical Biochemistry 162:156-159，(1987)描述的酸性硫氰酸胍鹽-酚-氯仿提取方法，或 Chomczynski，P.，Biotech 15:532-537，(1993)描述的改進(jìn)的方法從血漿或血清中進(jìn)行提取，其中每一個通過引用并入本文。循環(huán)的胞外DNA，包括源自腫瘤的胞外DNA，也存在于血漿和血清中。由于在上述的RNA提取方法中，該DNA會另外不同程度地被提取，因此在進(jìn)行進(jìn)一步的RNA分析之前， 期望或有必要(取決于臨床目的)進(jìn)一步純化該RNA提取物并除去痕量DNA。這可以用DNA 酶,例如通過 Rashtchian，A.，PCR Methods Applic. 4 :S83_S91，(1994)所述的方法實(shí)現(xiàn)?？蛇x地，進(jìn)一步RNA分析用引物可被構(gòu)建，其有利于RNA產(chǎn)物的擴(kuò)增，而不利于雜質(zhì)DNA的擴(kuò)增，如通過使用跨過RNA中剪接點(diǎn)的引物或跨過內(nèi)含子的引物進(jìn)行。擴(kuò)增RNA 而非雜質(zhì) DNA 的可選方法包括 Moore，R. E.，et al.，Nucleic Acids Res. 18 :1921, (1991) 和 Buchman，G. W. , et al. ,PCR Methods Applic. 3 :28-31，(1993)所述的方法，這些方法使用含有dU的寡核苷酸作為接頭引物(adaptor primer)。由于RNA在常規(guī)處理和分析中的不穩(wěn)定性，可以期望提取RNA而分析DNA。分離的RNA序列可利用逆轉(zhuǎn)錄重新生成為DNA，這可以根據(jù)先前公開的程序進(jìn)行。可以使用多種逆轉(zhuǎn)錄酶，其包括但不限于MMLV RT ；MMLV RT的RNA酶H突變體，如Superscript和 SuperscriptlKLife Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) ；AMV RT;以及來自嗜熱棲熱菌(Thermus Thermophilus)的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶。例如，可用于將從血漿或血清中提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的一種但不唯一的方法是由Superscript II Preamplification system (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md. ；catalog no. 18089—011)改進(jìn)的方案，如 Rashtchian，Α.，PCR Methods Applic. 4 :S83_S91，(1994)所述。突變檢測核酸(例如總核酸)可以用適當(dāng)?shù)姆椒◤幕颊叩纳飿悠分刑崛〔U(kuò)增。然后可以例如通過凝膠純化來純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并且所得純化產(chǎn)物可被測序。核酸測序方法是本領(lǐng)域已知的；示例性測序方法包括ABI Prism BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City，CA)。然后可分析測序數(shù)據(jù)，目標(biāo)核酸(例如，NPMl 或FLT3核酸)中是否存在一個或多個突變。測序數(shù)據(jù)也可被分析來確定樣品中存在的野生型核酸與突變型核酸的比例。擴(kuò)增或突變檢測的可選方法是等位基因特異性PCR(ASPCR)。ASPCR利用模板和引物3’端堿基之間的配對或錯配，這是本領(lǐng)域所熟知的。參見，例如美國專利5639611。另一種突變探測的方法是核酸測序。測序能夠用任意數(shù)目的本領(lǐng)域已知的方法、 試劑盒或系統(tǒng)進(jìn)行。一個實(shí)例是使用染料終止子化學(xué)和ABI測序儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)。測序也可涉及單堿基測定方法，如單核苷酸引物延伸(“SNapShot”測
14序法)或等位基因或突變特異性PCR。在其他實(shí)施方式中，目標(biāo)核酸突變可通過任選包含可檢測標(biāo)記的多核苷酸探針雜交進(jìn)行評價。該探針可用本領(lǐng)域已知的方法被可檢測地標(biāo)記。有用的標(biāo)記包括，例如熒光染料(例如075 、073@、？11^、羅丹明、lanthamide phosphors、德克薩斯紅、FAM、JOE、Cal Fluor Red 610 , Quasar 670 )；放射性同位素(WhH131I)；電子致密試劑 (例如，金)；酶(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)；比色標(biāo)記(例如膠體金)；磁性標(biāo)記(例如Dynabeads )；生物素；dioxigenin ；或抗血清或單克隆抗體可用的半抗原和蛋白質(zhì)。其他標(biāo)記包括能夠分別與相應(yīng)受體或互補(bǔ)寡核苷酸形成復(fù)合物的配體或寡核苷酸。標(biāo)記可以直接引入待檢測的核酸中，或其可以連接到與待檢測的核酸雜交或結(jié)合的探針(例如寡核苷酸)或抗體上。在其他實(shí)施方式中，探針是TaqMan 探針、分子信標(biāo)和Scorpions (例如 Scorpion 探針)。這些種類的探針基于熒光淬滅的原理，并且包括供體熒光團(tuán)和淬滅部分。本文所用的術(shù)語“熒光團(tuán)”指吸收特定波長(激發(fā)頻率)的光并隨后發(fā)射較長波長(發(fā)射波長)的光的分子。本文所用的術(shù)語“供體熒光團(tuán)”指當(dāng)接近淬滅劑部分時將發(fā)射能量供給或轉(zhuǎn)移到淬滅劑上的熒光團(tuán)。由于將能量供給到淬滅劑上，供體熒光團(tuán)自身將發(fā)射很少特定發(fā)射頻率的光——其是供體熒光團(tuán)沒有接近淬滅劑部分時所具有的光。本文所用的術(shù)語“淬滅劑部分”是指這樣的分子在接近供體熒光團(tuán)時吸收供體產(chǎn)生的發(fā)射能量，并且以熱的形式耗散該能量或發(fā)射波長比供體發(fā)射波長長的光。在后者情況下，淬滅劑被認(rèn)為是受體熒光團(tuán)。淬滅劑部分可通過近端(即碰撞)淬滅或通過FSrster 或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(“FRET”)起作用。通過FRET的淬滅通常用于TaqMan 探針中，而近端淬滅(proximal quenching)用于分子信標(biāo)和korpion 型探針中。適當(dāng)?shù)拇銣鐒┗谔囟晒鈭F(tuán)的熒光光譜進(jìn)行選擇。有用的淬滅劑包括，例如Black Hole 淬滅劑BHQ-I、 BHQ-2 和 BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.)以及 ATTO 系列淬滅劑(ΑΤΤ0 540Q、ATT0 580Q和 ATTO 612Q ；Atto-Tec GmbH)。TaqMan 探針(Heid，et al.，Genome Res 6 :986-994,1996)利用 Taq聚合酶的熒光的5’外切核酸酶活性測量cDNA樣品中目標(biāo)序列的量。TaqMan 探針是含有通常在5’堿基處或其附近的供體熒光團(tuán)和通常在3’堿基處或其附近的淬滅部分的寡核苷酸。淬滅劑部分可以是諸如TAMRA的染料或可以是諸如4-4-(二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL) 的非熒光分子。參見 Tyagi，et al.，16 NatureBiotechnology 49-53(1998)。當(dāng)被照射時， 被激發(fā)的熒光供體通過FRET將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的淬滅部分，而不是發(fā)出熒光。因此，在探針完整時，供體和淬滅劑的緊密接近阻止了供體熒光團(tuán)的發(fā)射。TaqMan 探針被設(shè)計(jì)成與PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域退火。當(dāng)聚合酶(例如逆轉(zhuǎn)錄酶) 復(fù)制結(jié)合了 TaqMan 探針的模板時，其5’外切核酸酶活性裂解探針。這終止了淬滅劑的活性(無FRET)，而供體熒光團(tuán)開始發(fā)射熒光，該熒光在每個循環(huán)中與探針裂解的速率成比例增強(qiáng)。通過監(jiān)測報(bào)道分子染料熒光的增加來檢測PCR產(chǎn)物的累積(注意引物沒有被標(biāo)記)。如果淬滅劑是受體熒光團(tuán)，則可以通過監(jiān)測受體熒光團(tuán)熒光的減少來檢測PCR產(chǎn)物的累積。對于korpion引物，序列特異性引發(fā)(priming)和PCR產(chǎn)物檢測用單個分子來實(shí)現(xiàn)。korpion引物在未雜交狀態(tài)維持莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。熒光團(tuán)被連接到5’端，并且通過與3’
15端相連的部分淬滅，盡管在適當(dāng)?shù)膶?shí)施方式中，這種排列可以轉(zhuǎn)換。莖的3’部分也包含與引物的延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。該序列通過不可擴(kuò)增單體與特異性引物的5’端相連。在引物部分延伸后，特異性探針序列能夠與延伸的擴(kuò)增子中其互補(bǔ)序列結(jié)合，從而打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)。這阻止了熒光被淬滅，并且觀察到信號。特異性目標(biāo)通a^orpion引物的反向引物部分和引物部分進(jìn)行擴(kuò)增，形成延伸產(chǎn)物。由于&011^011引物的探針成分(例如JAK2探針)與延伸產(chǎn)物結(jié)合造成熒光團(tuán)和淬滅劑分離，而產(chǎn)生熒光信號。樣品中接合性狀態(tài)和野生型與突變型核酸的比率可通過本領(lǐng)域已知的方法包括序列特異性、定量檢測方法進(jìn)行確定。其他方法可以包括確定標(biāo)準(zhǔn)測序電泳圖——如用ABI 測序系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City CA)生成的標(biāo)準(zhǔn)測序電泳圖——的測序峰曲線下的面積。例如，電泳圖上代表特定核苷酸的位置只有單個峰例如“G”表明樣品中的核酸在該位置只有一種核苷酸“G”。然后，該樣品可被歸類為純合的，因?yàn)橹粰z測到一個等位基因。電泳圖上同一位置有兩個峰，例如“G”峰和“T”峰表明，該樣品含有兩種核酸；一種核酸在所述核苷酸位置出攜帶“G”，另一種核酸在所述核苷酸位置處攜帶“T”。然后，該樣品可被歸類為雜合的，因?yàn)闄z測到一個以上等位基因。所述兩個峰的大小可被確定(例如，通過確定每個曲線下的面積)，并且可以計(jì)算出兩種不同種類核酸的比率。野生型核酸與突變型核酸的比率可用于監(jiān)測疾病進(jìn)展、確定治療或進(jìn)行診斷。例如，攜帶特定突變的癌細(xì)胞數(shù)目可能在疾病或治療的過程中發(fā)生改變。 如果在疾病早期建立了基線比率，之后確定的突變型核酸與野生型核酸的較高比率可以表明疾病正在惡化或治療無效；攜帶突變的細(xì)胞數(shù)目在患者體內(nèi)可以漸增。突變型核酸與野生型核酸的較低比率可以表明治療有效或疾病沒有進(jìn)展；攜帶突變的細(xì)胞數(shù)目在患者體內(nèi)漸少。在某些實(shí)施方式中，NPMl核酸包括插入或缺失突變。通過確定至少一部分從患者分離的NPMl核酸的大小，可以方便地鑒定這些突變。本領(lǐng)域熟知檢測不同大小的多核苷酸存在或量的方法，并且其中每種方法都可以用于本文所述的方法中。只要核酸彼此之間有至少一個核苷酸不同，所采用的大小分離/檢測技術(shù)就應(yīng)當(dāng)允許分辨核酸。分離可在變性或非變性或天然條件下進(jìn)行——即，分離可在單鏈或雙鏈核酸上進(jìn)行。優(yōu)選分離和檢測允許檢測少至1個核苷酸的長度差異。進(jìn)一步優(yōu)選分離和檢測能以高通量形式進(jìn)行，這允許實(shí)時或同時確定循環(huán)反應(yīng)過程中獲取的多個反應(yīng)整分試樣中的核酸豐度。有用的分離和分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法包括但不限于電泳(例如瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳(CE)，層析 (HPLC)和質(zhì)譜。在一個實(shí)施方式中，CE是優(yōu)選的分離手段，因?yàn)樗鼘χ辽?0-1000個堿基對范圍內(nèi)的多核苷酸提供了分辨率為單個堿基對的優(yōu)異分離。CE可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如，如美國專利號6217731、6001230和5963456中所公開的，其通過引用并入本文。高通量 CE 裝置可以商購，例如，Spectrumedix Corporation (State College, Pa.)的 HTS9610 高通量分析系統(tǒng)和SCE9610全自動96-毛細(xì)管電泳基因分析系統(tǒng)；Beckman Instruments Inc (Fullerton, Calif.)的 P/ACE5000 系列和 CEQ 系列；以及 ABI PRISM 3100 基因分析儀 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)。在這些裝置中，在CE柱末端附近，擴(kuò)增的 DNA片段通過測量熒光標(biāo)記信號的熒光檢測器。這些儀器為熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物提供自動高通量檢測。
16本文所述的方法中CE的采用允許與傳統(tǒng)平板凝膠電泳相比更高的生產(chǎn)率。通過使用毛細(xì)管凝膠，分離速度比傳統(tǒng)平板凝膠系統(tǒng)提高了約10倍。技術(shù)人員使用CE也能同時分析多個樣品，這對高通量很重要。這是通過例如使用多毛細(xì)管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。在一些情況下，檢測來自DNA堿基的熒光可以因來自多孔基質(zhì)和毛細(xì)管壁的光散射而復(fù)雜化。然而，可以使用共聚焦熒光掃描儀來避免由于光散射帶來的問題(Quesada et al. , Biotechniques(1991), 10 :616-25)。在一些實(shí)施方式中，可以使用瓊脂糖凝膠電泳分析和檢測核酸的大小。本領(lǐng)域熟知進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的方法。參見Sambrook et al. ,Molecular Cloning =A Laboratory Manual(2nd Ed.)(1989)，Cold Spring Harbor Press, N. Y。在一種實(shí)施方式中，檢測是通過DNA印跡法和與標(biāo)記探針雜交進(jìn)行的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知DNA印跡法涉及的技術(shù)，這些技術(shù)可以在關(guān)于分子方案的許多標(biāo)準(zhǔn)書籍中找到。參見Sambrook et al.，(1989)。簡要而言，用凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。然后將凝膠與膜如硝基纖維膜接觸，以允許核酸和非共價結(jié)合物轉(zhuǎn)移。隨后，將該膜與軛合發(fā)色團(tuán)的探針溫育，該探針能與目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。通過將膜暴露于X線膠片或用離子發(fā)射檢測裝置進(jìn)行檢測。
實(shí)施例實(shí)施例1 源自血漿的核酸中NPMl突變的檢測為評價血漿作為突變分析的遺傳物質(zhì)的來源的可行性，來自31位新診斷的AML患者的骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞和外周血血漿被同時進(jìn)行NPMl突變分析，并且在三種樣品類型之間進(jìn)行結(jié)果比較。用BioRobot EZl Blood DNA 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)從患者骨髓或全血樣品提取基因組DNA。用NucliSens提取試劑盒在fesyMag系統(tǒng)(bioMerieux，Durham, NC)上從血漿中提取總核酸。用與NPMl內(nèi)含子11雜交的正向引物和與NPMl外顯子12雜交的反向引物進(jìn)行所有樣品類型的NPMl基因PCR擴(kuò)增。正向和反向引物用6-羧基熒光素(6-FAM ;Eurogentec，San Diego, CA)標(biāo)記。NPMl突變型或野生型等位基因通過使用 ABI3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)測定 PCR 產(chǎn)物的大小來進(jìn)行確證。正向和反向引物的序列在下面給出。正向弓丨物5，-tta act ctc tgg tgg tag aat gaa_3，(SEQ ID NO :3)反向弓丨物5，-tgt tac aga aat gaa ata aga cgg_3，(SEQ ID NO :4)使用這些擴(kuò)增引物，野生型(WT)NPMl核酸顯示212bp的峰，而NPMl插入突變體除 NPMl WT峰外還顯示額外的216bp的峰(參見例如圖3A)。圖證明，4堿基插入/移碼突變也能夠在與野生型相比雜合的患者中鑒定到，并且該突變是由CTCT插入引起的。這些結(jié)果證明，上述方法穩(wěn)定(robust)并且能區(qū)分從所有測試來源包括骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞和血漿分離的野生型和4bp插入NPMl突變型核酸。來自上述31位患者的血漿顯示與骨髓細(xì)胞完全一致，但觀測到與外周血細(xì)胞的差異。在31對外周血血漿和骨髓細(xì)胞樣品中有6對檢測到了突變的NPMl核酸。然而，在評價外周血細(xì)胞時，應(yīng)用外周血細(xì)胞分析，6個含有突變的NPMl核酸的樣品中一個(如在骨髓細(xì)胞和血漿中所評價的那樣)被錯誤地鑒定為含有野生型NPM-I (圖3A)。在該單個患者
17中，外周血細(xì)胞的NPMl核酸突變評價被證明不準(zhǔn)確，但是使用骨髓細(xì)胞和血漿樣品的評價顯示了無誤的經(jīng)由插入的突變。在NPMl突變基于血漿的測試的準(zhǔn)確性的進(jìn)一步支持中，當(dāng)測定血漿時，沒有突變陽性的外周血或骨髓細(xì)胞樣品給出假陰性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了，基于血漿的測定用于檢測血漿核酸樣品中NPMl突變。實(shí)施例2 =AML和MDS患者中的NPMl突變和新突變的鑒定^ ^ ^ University of Texas> MD Anderson Cancer Center ^ ! 的AML患者(98個樣品)和骨髓增生異常綜合征(MDQ患者Q8個樣品)的成對血漿和外周血細(xì)胞樣品進(jìn)行NPMl核酸分析。所有樣品采集自在開始治療前先前未治療過的患者。在獲得分析用樣品時，所有MDS患者都沒有接受任何種類的治療。所有樣品用經(jīng)倫理審查委員會(Institutional Review Board)批準(zhǔn)的方法采集，所有患者提供了知情許可， 并且該研究符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(World Medical Association)的倫理規(guī)定(赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki))。臨床數(shù)據(jù)通過病歷審查(chart review)收集，并且是 MD Anderson Cancer Center的部分白血病數(shù)據(jù)庫。診斷基于完整的形態(tài)學(xué)分析、免疫表型分析、細(xì)胞遺傳學(xué)分析和分子分析，并且分類是根據(jù)法美英(French American British) (FA^分類法進(jìn)行的。所有MDS患者需要至少兩個譜系的發(fā)育異常證據(jù)。細(xì)胞遺傳學(xué)狀態(tài)被分為有利的(t(15;17)、t(8，21)或invl6)、不利的(_5，-7或復(fù)雜(彡3)異常)或中等的(所有其他的)。表現(xiàn)狀態(tài)(PQ，用^ibrod打分系統(tǒng)確定，分為好(O或1)或壞(2-4)。 有效者(responder)是根據(jù)完全有效(CR)的國際工作組標(biāo)準(zhǔn)(International Working group criteria)達(dá)到完全有效(CR)的患者。本研究中包括的AML和MDS患者的特征列于表1中。AML患者的年齡中位數(shù)是 62 (范圍，18至82)，而MDS患者年齡中位數(shù)是68 (范圍，43至81)。大部分AML患者具有中等(34% )或差(59% )的細(xì)胞遺傳學(xué)狀態(tài)。根據(jù)法美英(FAB)分類法，一半MDS患者被分類為患有難治性貧血伴原始細(xì)胞過多轉(zhuǎn)變型(RAEB-T)，46%患有難治性貧血伴原始細(xì)胞過多(RAEB)。只有3%的患者患有急性前骨髓細(xì)胞性白血病，而24%患有白血病伴單核細(xì)胞分化(leukemia with monocytoid differentiation)(表 1)。AML 和 MDS 患者的分類基于 FAB分類法，而不是世界衛(wèi)生組織(WHO)分類法。表1AML和MDS患者的特征
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權(quán)利要求
1.確定診斷有急性髓性白血病(AML)的個體的預(yù)后的方法，所述方法包括確定NPMl核酸中是否存在一個或多個突變，其中所述NPMl核酸從所述個體的無細(xì)胞體液獲得，以及提供所述個體的預(yù)后，其中NPMl基因中存在一個或多個突變表明所述個體相對于診斷有AML而沒有所述一個或多個突變的個體預(yù)后較好。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無細(xì)胞體液是血清或血漿。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述是否存在一個或多個突變是相對于 SEQ ID NO 1 確定的。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸是mRNA。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突變之一包含 CTCT插入。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述插入是在對應(yīng)于SEQID NO 1的1018位的核苷酸之后。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突變至少一個選自圖2A或圖2B。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，還包含檢測FLT3基因中是否存在一個或多個突變。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述FLT3基因中的一個或多個突變是內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)的復(fù)制。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中NPMl基因中存在一個或多個突變和FLT3基因中不存在一個或多個突變表明所述診斷有AML的個體預(yù)后較好。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，還包含確定所述個體的細(xì)胞遺傳學(xué)。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包含擴(kuò)增從所述AML患者的無細(xì)胞體液中獲得的NPMl核酸，以及將所述擴(kuò)增的NPMl核酸與寡核苷酸探針雜交，所述寡核苷酸探針能夠在雜交條件下特異性地檢測至少NPMl核酸突變的存在。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包含確定至少部分所述NPMl核酸的大小，其中大小增大表明存在插入突變。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述預(yù)后與緩解率有關(guān)。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述AML患者的所述預(yù)后與總存活率有關(guān)。
17.確定診斷有AML的個體的預(yù)后的方法，所述方法包括確定NPMl核酸中是否存在插入突變，其中所述NPMl核酸從所述個體的無細(xì)胞體液獲得，以及提供所述個體的預(yù)后，其中存在所述插入突變表明所述個體相對于診斷有AML而沒有所述插入突變的個體預(yù)后較好。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述插入突變包含在對應(yīng)于SEQID NO :1的1018位的核苷酸之后的CTCT插入。
19.權(quán)利要求17-18中任一項(xiàng)所述的方法，還包括檢測FLT3基因中是否存在一個或多個突變。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中FLT3基因中的所述一個或多個突變是內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)的復(fù)制。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中存在所述插入突變和所述FLT3基因中不存在突變表明所述診斷有AML的個體預(yù)后較好。
22.權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述預(yù)后與緩解率或總存活率有關(guān)。
23.權(quán)利要求17-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定至少部分所述NPMl 核酸的大小，其中大小增大表明存在插入突變。
24.權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括使用包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4序列的擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述NPMl核酸。
25.權(quán)利要求17-M中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括使用包含SEQID NO :3和 SEQ ID NO 4序列的擴(kuò)增引物對擴(kuò)增所述NPMl核酸。
26.診斷患有血液學(xué)疾病的個體的方法，所述方法包括確定NPMl核酸中是否存在移位，其中所述NPMl核酸從所述個體的無細(xì)胞體液獲得，以及在檢測到NPMl核酸中的移位時診斷所述個體患有血液學(xué)疾病。
27.權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述血液學(xué)疾病選自間變性大細(xì)胞淋巴瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病和急性髓性白血病。
28.權(quán)利要求沈-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述移位在NPMl基因和第二基因之間， 所述第二基因選自間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶、視黃酸受體α和脊髓發(fā)育不良/髓性白血病因子1。
29.權(quán)利要求沈-28中任一項(xiàng)所述的方法，包括進(jìn)一步確定NPMl核酸中是否存在一個或多個突變。
30.權(quán)利要求四所述的方法，其中是否存在一個或多個突變是相對于SEQID Ν0:1確定的。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突變之一包含CTCT插入。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述插入在對應(yīng)于SEQID NO=I的1018位的核苷酸之后。
33.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突變至少一個選自圖2Α或圖2Β。
34.權(quán)利要求沈-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸是基因組DNA。
35.權(quán)利要求沈-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述NPMl核酸是mRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測無細(xì)胞體液樣品中NPM1核酸并確定該核酸是否含有一個或多個包括插入和缺失在內(nèi)的突變的方法。該方法可用于預(yù)測具有NPM1基因突變的細(xì)胞的AML患者預(yù)后。
文檔編號C12Q1/68GK102186995SQ200980141251
公開日2011年9月14日 申請日期2009年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者M·阿爾比塔 申請人:奎斯特診斷投資公司