專利名稱：腈水合酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腈水合酶突變體、編碼該腈水合酶突變體的基因、含有該基因的 DNA、含有該基因的質(zhì)粒、由該質(zhì)粒形成的轉(zhuǎn)化體以及使用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)腈水合酶突變體的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作為具有腈水合活性的酶的腈水合酶，該酶能夠通過(guò)水合作用將各種化合物的腈基轉(zhuǎn)變成酰胺基，并且公開(kāi)了多種生產(chǎn)該酶的微生物株。為了在工業(yè)上使用腈水合酶從腈化合物制造酰胺化合物，降低酰胺化合物的制造成本中所占的該酶的制造成本是重要的。更具體而言，必須提高酶制備物的每單位重量的活性值。作為通過(guò)增加酶制備物中的酶量提高活性值的方法，已嘗試對(duì)編碼該酶的基因進(jìn)行克隆，利用基因工程方法使該酶大量表達(dá)。例如，已制備出可使來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶在轉(zhuǎn)化體內(nèi)大量表達(dá)的質(zhì)粒及通過(guò)該質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞株。此外，可以利用該細(xì)胞株來(lái)生產(chǎn)該腈水合酶，以及可以通過(guò)將該細(xì)胞株或由該細(xì)胞株得到的該腈水合酶與腈化合物接觸來(lái)制造對(duì)應(yīng)的酰胺化合物(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)1)。另一方面，如果能實(shí)現(xiàn)酶分子自身的高活化，則可以進(jìn)一步提高酶制備物的活性值。到目前為止，正嘗試探索下述腈水合酶突變體，該突變體通過(guò)在不破壞其活性的情況下對(duì)腈水合酶的氨基酸序列中的特定氨基酸殘基導(dǎo)入突變，而使基質(zhì)特異性、酶穩(wěn)定性等得到改良(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)2 4)。需要說(shuō)明的是，作為來(lái)源于紫紅紅球菌的腈水合酶突變體，有專利文獻(xiàn)5、6中所記載的腈水合酶突變體。專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)平9-275978號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2004-194588號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2005-160403號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 國(guó)際公開(kāi)第2004/056990號(hào)說(shuō)明書專利文獻(xiàn)5 日本特開(kāi)2007-143409號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 日本特開(kāi)2008-253182號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
但是，與專利文獻(xiàn)1中記載的野生型腈水合酶相比、其反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性同時(shí)提高的具體突變體尚屬未知。期待可以通過(guò)使反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性同時(shí)提高來(lái)削減酰胺化合物的制造成本。本發(fā)明的目的在于提供一種具有高的反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性的腈水合酶。S卩，本發(fā)明如下所述。
[1] 一種腈水合酶突變體，其特征在于，包含至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代，所述取代通過(guò)3個(gè)以下1個(gè)以上氨基酸取代而改善腈水合酶的2個(gè)以上的性質(zhì)。[2]如[1]所述的腈水合酶突變體，其特征在于，所述被改善的性質(zhì)為反應(yīng)初速度及熱穩(wěn)定性。[3]如[1]或[2]所述的腈水合酶突變體，其特征在于，含有序列表的序列號(hào)1表示的α亞單位和序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位，并且含有選自由下述(a) (1)組成的氨基酸取代位置中的至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代(a) α亞單位的第92位；(b) α亞單位的第94位；(c) α亞單位的第197位；(d) β亞單位的第4位；(Θ)β亞單位的第對(duì)位；(f) β亞單位的第79位；(g) β亞單位的第96位；(h) β亞單位的第107位；⑴β亞單位的第2 位；(j) β亞單位的第110位及β亞單位的第231位；(k) β亞單位的第206位及β亞單位的第230位；(1) α亞單位的第13位、α亞單位的第27位、及β亞單位的第110位。[4]如[3]所述的腈水合酶突變體，其特征在于，進(jìn)一步包含選自由下述(m) (u)組成的氨基酸取代位置中的至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代(m)為(b)或(g)時(shí)，α亞單位的第13位；(η)為(b)或(h)時(shí)，α亞單位的第27位；(ο) (d)及(f)；(ρ)為(f)時(shí)，β亞單位的第230位；(q) (a)及(i)；(r)為(i)時(shí)，α亞單位的第13號(hào)及β亞單位的第206位；(s)為(a)及(d)時(shí)，β亞單位的第206位；(t)為(c)及(h)時(shí)，β亞單位的第230位；(u)為(f)時(shí)，β亞單位的第230位及β亞單位的第231位。[5]如[3]所述的腈水合酶突變體，其特征在于，為(e)時(shí)，進(jìn)一步包含選自由 (a)、(c)、(f)、⑴、(h)、β亞單位的第230位、及β亞單位的第231位組成的組中的至少 1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代。[6]如[1] [5]中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體，其特征在于α亞單位的第13位氨基酸被取代時(shí)，Ile被取代為L(zhǎng)eu ；α亞單位的第27位氨基酸被取代時(shí)，Met被取代為Ile ；α亞單位的第92位氨基酸被取代時(shí)，Asp被取代為Glu ；α亞單位的第94位氨基酸被取代時(shí)，Met被取代為Ile ；α亞單位的第197位氨基酸被取代時(shí)，Gly被取代為Cys ；
β亞單位的第4位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Met ；β亞單位的第M位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Ile ；β亞單位的第79位氨基酸被取代時(shí)，His被取代為Asn ；β亞單位的第96位氨基酸被取代時(shí)，Gln被取代為Arg ；β亞單位的第107位氨基酸被取代時(shí)，Pro被取代為Met ；β亞單位的第110位氨基酸被取代時(shí)，Glu被取代為Asn ；β亞單位的第206位氨基酸被取代時(shí)，Pro被取代為L(zhǎng)eu ；β亞單位的第2 位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Ile ；β亞單位的第230位氨基酸被取代時(shí)，Ala被取代為Glu ；β亞單位的第231位氨基酸被取代時(shí)，Ala被取代為Val。[7]如[3] [6]中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體，其特征在于，進(jìn)一步包含選自由下述(aa) (br)組成的氨基酸取代中的至少1個(gè)氨基酸取代(aa)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、及將α亞單位的第1 位的Phe 取代為Tyr ；(ab)將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、及將α亞單位的第204位的Val 取代為Arg ；(ac)將β亞單位的第51位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第108位的Glu 取代為Asp ；(ad)將β亞單位的第118位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第200位的Ala 取代為Glu ；(ae)將β亞單位的第160位的Arg取代為Trp、及將β亞單位的第186位的Leu 取代為Arg ；(af)將α亞單位的第6位的Leu取代為Ilirjf α亞單位的第36位的Thr取代為Met、及將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyr ；(ag)將α亞單位的第19位的Ala取代為Valjf α亞單位的第71位的Arg取代為His、及將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyr ；(ah)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、及將α亞單位的第204位的Val取代為Arg ；(ai)將β亞單位的第10位的Ilir取代為Asp、將β亞單位的第118位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(aj)將β亞單位的第37位的Phe取代為L(zhǎng)eu、將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(ak)將β亞單位的第37位的Phe取代為Valjf β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(al)將β亞單位的第41位的Phe取代為lie、將β亞單位的第51位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp ；(am)將β亞單位的第46位的Met取代為L(zhǎng)ysjf β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ；(an)將β亞單位的第48位的Leu取代為Valjf β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ；(ao)將β亞單位的第127位的Leu取代為kr、將β亞單位的第160位的Arg 取代為iTrp、及將β亞單位的第186位的Leu取代為Arg ；(ap)將α亞單位的第6位的Leu取代為Thrjf α亞單位的第19位的Ala取代為Valdf α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第46位的Met取代為 Lysjf β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為 Tyr ；(aq)將α亞單位的第6位的Leu取代為Ilirjf α亞單位的第19位的Ala取代為Val、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第48位的Leu取代為 ValJf β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為 Tyr ；(ar)將α亞單位的第6位的Leu取代為Ala、將α亞單位的第19位的Ala取代為Valjf α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第127位的Leu取代為 kr、將β亞單位的第160位的Arg取代為Trp、及將β亞單位的第186位的Leu取代為 Arg ；(as)將α亞單位的第6位的Leu取代為Ilirjf α亞單位的第36位的Thr取代為Met、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第10位的Thr取代為 Asp、將β亞單位的第118位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第200位的Ala取代為 Glu ；(at)將α亞單位的第19位的Ala取代為Val、將α亞單位的第71位的Arg取代為His、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第37位的Phe取代為 Leu、將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為 Glu ；(au)將α亞單位的第19位的Ala取代為Val、將α亞單位的第71位的Arg取代為His、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第37位的Phe取代為 Val、將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為 Glu ；(av)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、將α亞單位的第204位的Val取代為Arg、將β亞單位的第41位的Phe取代為lie、將β亞單位的第51位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第108位的Glu取代為 Asp ；(aw)將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、將α亞單位的第204位的Val取代為Arg、將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(ax)將α亞單位的第36位的Thr取代為Gly、及將α亞單位的第188位的Thr 取代為Gly ；(ay)將α亞單位的第36位的Thr取代為Ala、及將α亞單位的第48位的Asn 取代為Gln ；(az)將α亞單位的第48位的Asn取代為Glu、及將β亞單位的第146位的Arg
14取代為Gly ；(ba)將α亞單位的第36位的Thr取代為Trp、及將β亞單位的第176位的Tyr 取代為Cys ；(bb)將β亞單位的第176位的Tyr取代為Met、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為Gly ；(be)將α亞單位的第36位的Thr取代為kr、及將β亞單位的第33位的Ala 取代為Val ；(bd)將β亞單位的第176位的Tyr取代為Ala、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為Val ；(be)將β亞單位的第40位的Thr取代為Val、及將β亞單位的第218位的Cys 取代為Met ；(bf)將β亞單位的第33位的Ala取代為Met、及將β亞單位的第176位的Tyr 取代為iThr ；(bg)將β亞單位的第40位的Thr取代為L(zhǎng)eu、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為L(zhǎng)eu ；(bh)將β亞單位的第40位的Thr取代為lie、及將β亞單位的第61位的Ala 取代為Val ；(bi)將β亞單位的第61位的Ala取代為Thr、及將β亞單位的第218位的Cys 取代為；(bj)將β亞單位的第112位的Lys取代為Val、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為Met ；(bk)將β亞單位的第61位的Ala取代為Trp、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為His ；(bl)將β亞單位的第61位的Ala取代為L(zhǎng)eu、及將β亞單位的第112位的Lys 取代為Ile ；(bm)將β亞單位的第146位的Arg取代為Gly、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為；(bn)將β亞單位的第171位的Lys取代為Ala、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為iThr ；(bo)將β亞單位的第150位的Ala取代為kr、及將β亞單位的第217位的Asp 取代為Cys ；(bp)將β亞單位的第61位的Ala取代為Gly、及將β亞單位的第150位的Ala 取代為Asn ；(bq)將β亞單位的第61位的Ala取代為kr、及將β亞單位的第160位的Arg 取代為Met ；(br)將β亞單位的第160位的Arg取代為Cys、及將β亞單位的第168位的Thr 取代為Glu。[8] 一種編碼[1] [7]中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體的基因。[9] 一種編碼腈水合酶突變體的基因，其包含序列表的序列號(hào)3表示的編碼α亞單位的基因和序列表的序列號(hào)4表示的編碼β亞單位的基因，其特征在于，包含選自由下
述(a) (1)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)的堿基取代，
(a)序列號(hào):3的堿基序列的第274位-、第276位；
(b)序列號(hào)3的堿基序列的第280位-、第282位；
(C)序列號(hào):3的堿基序列的第589位-、第591位；
(d)序列號(hào):4的堿基序列的第10位 第12位；
(e)序列號(hào)4的堿基序列的第69位 第71位；
(f)序列號(hào):4的堿基序列的第235位-、第M7位；
(g)序列號(hào)4的堿基序列的第286位-、第觀8位；
(h)序列號(hào):4的堿基序列的第319位-、第321位；
⑴序列號(hào)4的堿基序列的第676位-、第678位；
(J)序列號(hào)4的堿基序列的第3 位 第330位、及序列號(hào)693位
(k)序列號(hào)4的堿基序列的第616位 第618位、及序列號(hào)688 位- 第690位；
(1)序列號(hào):3的堿基序列的第37位 第39位、及序列號(hào)3
,第
-步包含選自由
位 第81位、及序列號(hào)4的堿基序列的第3 位 第330位。[10]如[9]所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于，進(jìn)-下述(m) (u)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代(m)為(b)或(g)時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第37位 第39位；(η)為(b)或(h)時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第79位 第81位；(ο) (d)及(f)；(ρ)為(f)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 690位；(q) (a)及⑴；(r)為⑴時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第37 39位及序列號(hào)4的堿基序列的第 616位 第618位；(s)為(a)及(d)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第616位 第618位；(t)為(c)及(h)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位；(u)為(f)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位、及序列號(hào)4的堿基序列的第691位 第693位。[11]如[9]所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于，為(e)時(shí)，進(jìn)一步包含選自由(a)、(c)、(f)、⑴、(h)、序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位、及序列號(hào) 4的堿基序列的第691位 第693位組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代為其他堿基的取代。[12]如[9] [11]中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于序列號(hào)3的堿基序列的第37位 第39位被堿基取代時(shí)，ATC被取代為CTC ；序列號(hào)3的堿基序列的第79位 第81位被堿基取代時(shí)，ATG被取代為ATC ；序列號(hào)3的堿基序列的第274位 第276位被堿基取代時(shí)，GAC被取代為GAG ；序列號(hào)3的堿基序列的第280位 第282位被堿基取代時(shí)，ATG被取代為ATC ；
序列號(hào)3的堿基序列的第589位 第591位被堿基取代吋，GGC被取代為TGC ；序列號(hào)4的堿基序列的第10位 第12位被堿基取代吋，GTG被取代為ATG ；序列號(hào)4的堿基序列的第69位 第71位被堿基取代吋，GTC被取代為ATC ；序列號(hào)4的堿基序列的第235位 第237位被堿基取代吋，CAC被取代為AAC ；序列號(hào)4的堿基序列的第286位 第288位被堿基取代吋，CAG被取代為CGT ；序列號(hào)4的堿基序列的第319位 第321位被堿基取代吋，CCC被取代為ATG ；序列號(hào)4的堿基序列的第3 位 第330位被堿基取代吋，GAG被取代為AAC ；序列號(hào)4的堿基序列的第616位 第618位被堿基取代吋，CCG被取代為CTG ；序列號(hào)4的堿基序列的第676位 第678位被堿基取代吋，GTC被取代為ATC ；序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位被堿基取代吋，GCG被取代為GAG ；序列號(hào)4的堿基序列的第691位 第693位被堿基取代吋，GCC被取代為GTC。[13]如[9] [12]中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在干，包 含選自由下述(aa) (br)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代，且具有腈水合酶 活性(aa)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、及將序列 號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC ；(ab)將序列號(hào)3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、及將序列 號(hào)3的堿基序列的第610位 第612位的GTC取代為CGC ；(ac)將序列號(hào)4的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列 號(hào)4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT ；(ad)將序列號(hào)4的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列 號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(ae)將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列 號(hào)4的堿基序列的第556位 第558位的CTG取代為CGG ；(af)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3 的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、及將序列號(hào)3的堿基序列的第376 位 第378位的TTC取代為TAC ；(ag)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3 的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、及將序列號(hào)3的堿基序列的第376 位 第378位的TTC取代為TAC ；(ah)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、及將序列號(hào)3的堿基序列的第610 位 第612位的GTC取代為CGC ；(ai)將序列號(hào)4的堿基序列的第28位 第30位的ACC取代為GAC、將序列號(hào)4 的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598 位 第600位的GCC取代為GAG ；(aj)將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為CTC、將序列號(hào) 4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598 位 第600位的GCC取代為GAG ；
(ak)將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為GTC、將序列號(hào) 4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598 位 第600位的GCC取代為GAG ；(al)將序列號(hào)4的堿基序列的第121位 第123位的TTC取代為ATC、將序列號(hào) 4的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第322 位 第3 位的GAG取代為GAT ；(am)將序列號(hào)4的堿基序列的第136位 第138位的ATG取代為AAG、將序列號(hào) 4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634 位 第636位的TCC取代為TAC ；(an)將序列號(hào)4的堿基序列的第142位 第144位的CTG取代為GTG、將序列號(hào) 4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634 位 第636位的TCC取代為TAC ；(ao)將序列號(hào)4的堿基序列的第379位 第381位的CTG取代為TCG、將序列號(hào) 4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第556 位 第558位的CTG取代為CGG ；(ap)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第136位 第138位的ATG取代為 AAG、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634位 第636位的TCC取代為TAC ；(aq)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3 的堿基序列的第陽(yáng)位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第142位 第144位的CTG取代為 GTG、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634位 第636位的TCC取代為TAC ；(ar)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為GCG、將序列號(hào)3 的堿基序列的第陽(yáng)位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第379位 第381位的CTG取代為 TCG、將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第556位 第558位的CTG取代為CGG ；(as)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376 位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第28位 第30位的ACC取代為GAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(at)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、將序列號(hào)3的堿基序列的第376 位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為CTC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(au)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、將序列號(hào)3的堿基序列的第376 位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為GTC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(av)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào) 3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、將序列號(hào)3的堿基序列的第610 位 第612位的GTC取代為CGC、將序列號(hào)4的堿基序列的第121位 第123位的TTC取代為ATC、將序列號(hào)4的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT ；(aw)將序列號(hào)3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、將序列號(hào) 3的堿基序列的第610位 第612位的GTC取代為CGC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322 位 第3M位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC 取代為GAG ；(ax)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為號(hào)3的堿基序列的第562位 第564位的ACC取代為GGC ；(ay)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為號(hào)3的堿基序列的第142位 第144位的AAC取代為CAA ；(az)將序列號(hào)3的堿基序列的第142位 第144位的AAC取代為號(hào)4的堿基序列的第436位 第438位的CGG取代為GGG ；(ba)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為號(hào)4的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為TGC ；(bb)將序列號(hào)4的堿基序列的第526位 第5 位的TAC取代為號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為GGC ；(be)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為號(hào)4的堿基序列的第97位 第99位的GCG取代為GTG ；(bd)將序列號(hào)4的堿基序列的第526位 第5 位的TAC取代為號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為GTC ；(be)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為號(hào)4的堿基序列的第652位 第6M位的TGC取代為ATG ；(bf)將序列號(hào)4的堿基序列的第97位 第99位的GCG取代為ATG、及將序列號(hào) 4的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為ACC ；(bg)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為CTG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為CTC ；(bh)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為ATT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為GTC ；(bi)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為ACG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第652位 第6M位的TGC取代為TCC ；
GGG、及將序列 GCG、及將序列 GAA、及將序列 TGG、及將序列 ATG、及將序列 TCG、及將序列 GCC、及將序列 GTG、及將序列
(bj)將序列號(hào)4的堿基序列的第334位 第336位的AAG取代為GTG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為ATG ；(bk)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為TGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為CAC ；(bl)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為CTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第334位 第336位的AAG取代為ATT ；(bm)將序列號(hào)4的堿基序列的第436位 第438位的CGG取代為GGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為AGC ；(bn)將序列號(hào)4的堿基序列的第511位 第513位的AAG取代為GCG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為ACC ；(bo)將序列號(hào)4的堿基序列的第448位 第450位的GCG取代為TCG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為TGT ；(bp)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為GGC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第448位 第450位的GCG取代為AAT ；(bq)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為TCG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為ATG ；(br)將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第502位 第504位的ACG取代為GAG。[14] 一種被連接的DNA，所述DNA在[9] [13]中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因的5’末端上游進(jìn)一步包含含有基因表達(dá)所必需的啟動(dòng)子序列的DNA，并且在該啟動(dòng)子的3’末端的下游包含序列號(hào)7中所包含的核糖體結(jié)合序列。[15] 一種質(zhì)粒，含有[14]所述的DNA0[16] 一種轉(zhuǎn)化體，是利用[15]所述的質(zhì)粒將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的。[17] 一種腈水合酶突變體的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括下述步驟將[16]中所述的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在該轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)基于質(zhì)粒所含有的腈水合酶基因的腈水合酶突變體。根據(jù)本發(fā)明，在含有序列表的序列號(hào)1表示的α亞單位和序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位的腈水合酶中，包含選自由上述(a) (1)組成的氨基酸取代位置中的至少一個(gè)氨基酸被取代為其他氨基酸的取代。由此，可以同時(shí)提高腈水合酶的反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性，提高酶制備物的每單位重量的活性值，同時(shí)可降低在工業(yè)利用中由溫度變化等引起的酶失活的風(fēng)險(xiǎn)。因此，能夠以更少的酶量穩(wěn)定地生產(chǎn)酰胺化合物，由此可以降低酰胺化合物的制造成本。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種與野生型腈水合酶相比反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性得以提高的新型腈水合酶突變體，能夠降低酰胺化合物的制造成本中所占的該酶的制造成本。
具體實(shí)施例方式上述目的、及其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)通過(guò)以下所述的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)一步明確。以下，更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的腈水合酶突變體包含至少1個(gè)氨基酸被取代為其他氨基酸的取代，所述
20取代通過(guò)3個(gè)以下1個(gè)以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2個(gè)以上的性質(zhì)。所謂本發(fā)明的腈水合酶突變體所改善的性質(zhì)有與將腈基水合、轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊姆磻?yīng)本身相關(guān)的物性和酶穩(wěn)定性。所謂與反應(yīng)本身相關(guān)的物性有酶的活性、基質(zhì)特異性、 Vmax, Km及反應(yīng)初速度。酶穩(wěn)定性中包括熱穩(wěn)定性、對(duì)基質(zhì)的穩(wěn)定性、對(duì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本發(fā)明的腈水合酶突變體優(yōu)選包含改善來(lái)源于嗜熱菌的腈水合酶的性質(zhì)的至少1個(gè)的氨基酸被取代為其他氨基酸的取代。作為嗜熱菌的例子，可以優(yōu)選使用屬于假諾卡氏菌(Pseudonocardia)屬的菌，具體可以舉出嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)。更具體而言，本發(fā)明的腈水合酶突變體是在含有序列表的序列號(hào)1表示的α亞單位和序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位的腈水合酶中，如表I所示，選自(a) (1)中至少1個(gè)的氨基酸取代位置被取代為其他氨基酸。由此，本發(fā)明的腈水合酶突變體能夠具有比專利文獻(xiàn)1記載的野生型腈水合酶高的反應(yīng)初速度及酶穩(wěn)定性。(表I)
權(quán)利要求
1.一種腈水合酶突變體，其特征在于，包含至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代， 所述取代通過(guò)3個(gè)以下1個(gè)以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2個(gè)以上的性質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于，所述被改善的性質(zhì)為反應(yīng)初速度及熱穩(wěn)定性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的腈水合酶突變體，其特征在于，含有序列表的序列號(hào)1表示的α亞單位和序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位，并且含有選自由下述(a) (1)組成的氨基酸取代位置中的、至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代(a)α亞單位的第92位；(b)α亞單位的第94位；(c)α亞單位的第197位；(d)β亞單位的第4位；(e)β亞單位的第M位；(f)β亞單位的第79位；(g)β亞單位的第96位；(h)β亞單位的第107位；(i)β亞單位的第2 位；(j) β亞單位的第110位及β亞單位的第231位； (k) β亞單位的第206位及β亞單位的第230位； (1) α亞單位的第13位、α亞單位的第27位、及β亞單位的第110位。
4.如權(quán)利要求3所述的腈水合酶突變體，其特征在于，進(jìn)一步包含選自由下述(m) (u)組成的氨基酸取代位置中的、至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代(m)為(b)或(g)時(shí)，α亞單位的第13位； (η)為(b)或(h)時(shí)，α亞單位的第27位； (ο) (d)及(f)；(P)為(f)時(shí)，β亞單位的第230位； (q) (a)及⑴；(r)為(i)時(shí)，α亞單位的第13號(hào)及β亞單位的第206位；(s)為(a)及(d)時(shí)，β亞單位的第206位；(t)為(c)及(h)時(shí)，β亞單位的第230位；(u)為(f)時(shí)，β亞單位的第230位及β亞單位的第231位。
5.如權(quán)利要求3所述的腈水合酶突變體，其特征在于，為(e)時(shí)，進(jìn)一步包含選自由 (a)、(c)、(f)、⑴、(h)、β亞單位的第230位、及β亞單位的第231位組成的組中的至少 1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體，其特征在于 α亞單位的第13位氨基酸被取代時(shí)，Ile被取代為L(zhǎng)eu ；α亞單位的第27位氨基酸被取代時(shí)，Met被取代為Ile ； α亞單位的第92位氨基酸被取代時(shí)，Asp被取代為Glu ； α亞單位的第94位氨基酸被取代時(shí)，Met被取代為Ile ； α亞單位的第197位氨基酸被取代時(shí)，Gly被取代為Cys ；β亞單位的第4位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Met ； β亞單位的第M位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Ile ； β亞單位的第79位氨基酸被取代時(shí)，His被取代為Asn ； β亞單位的第96位氨基酸被取代時(shí)，Gln被取代為Arg ； β亞單位的第107位氨基酸被取代時(shí)，Pro被取代為Met ； β亞單位的第110位氨基酸被取代時(shí)，Glu被取代為Asn ； β亞單位的第206位氨基酸被取代時(shí)，Pro被取代為L(zhǎng)eu ； β亞單位的第2 位氨基酸被取代時(shí)，Val被取代為Ile ； β亞單位的第230位氨基酸被取代時(shí)，Ala被取代為Glu ； β亞單位的第231位氨基酸被取代時(shí)，Ala被取代為Val。
7.如權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體，其特征在于，進(jìn)一步包含選自由下述(aa) (br)組成的氨基酸取代中的至少1個(gè)氨基酸的取代(aa)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、及將α亞單位的第1 位的Phe取代為 Tyr ；(ab)將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、及將α亞單位的第204位的Val取代為Arg ；(ac)將β亞單位的第51位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第108位的Glu取代為 Asp ；(ad)將β亞單位的第118位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(ae)將β亞單位的第160位的Arg取代為Trp、及將β亞單位的第186位的Leu取代為Arg ；(af)將α亞單位的第6位的Leu取代為Thr、將α亞單位的第36位的Thr取代為 Met、及將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyr ；(ag)將α亞單位的第19位的Ala取代為Valjfα亞單位的第71位的Arg取代為 His、及將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyr ；(ah)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、將α亞單位的第148位的Gly取代為 Asp、及將α亞單位的第204位的Val取代為Arg ；(ai)將β亞單位的第10位的Thr取代為Asp、將β亞單位的第118位的Phe取代為 Val、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(aj)將β亞單位的第37位的Phe取代為L(zhǎng)eu、將β亞單位的第108位的Glu取代為 Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(ak)將β亞單位的第37位的Phe取代為Valjf β亞單位的第108位的Glu取代為 Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ；(al)將β亞單位的第41位的Phe取代為lie、將β亞單位的第51位的Phe取代為 Val、及將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp ；(am)將β亞單位的第46位的Met取代為L(zhǎng)ysjf β亞單位的第108位的Glu取代為 Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ；(an)將β亞單位的第48位的Leu取代為Valjf β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ；(ao)將β亞單位的第127位的Leu取代為kr、將β亞單位的第160位的Arg取代為 ^Ρ、及將β亞單位的第186位的Leu取代為Arg ；(ap)將α亞單位的第6位的Leu取代為Thr、將α亞單位的第19位的Ala取代為 Valjf α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第46位的Met取代為L(zhǎng)ys、 將β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ； (aq)將α亞單位的第6位的Leu取代為Thr、將α亞單位的第19位的Ala取代為 Valjf α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第48位的Leu取代為Val、 將β亞單位的第108位的Glu取代為Arg、及將β亞單位的第212位的Ser取代為Tyr ； (ar)將α亞單位的第6位的Leu取代為Ala、將α亞單位的第19位的Ala取代為 Valjf α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第127位的Leu取代為kr、 將β亞單位的第160位的Arg取代為Trp、及將β亞單位的第186位的Leu取代為Arg ； (as)將α亞單位的第6位的Leu取代為Thr、將α亞單位的第36位的Thr取代為 Met、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第10位的Thr取代為Asp、 將β亞單位的第118位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ； (at)將α亞單位的第19位的Ala取代為Valjf α亞單位的第71位的Arg取代為 His、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第37位的Phe取代為L(zhǎng)eu、 將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ； (au)將α亞單位的第19位的Ala取代為Valjf α亞單位的第71位的Arg取代為 His、將α亞單位的第1 位的Phe取代為Tyrjf β亞單位的第37位的Phe取代為Val、 將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為Glu ； (av)將α亞單位的第36位的Thr取代為Met、將α亞單位的第148位的Gly取代為 Asp、將α亞單位的第204位的Val取代為Arg、將β亞單位的第41位的Phe取代為lie、 將β亞單位的第51位的Phe取代為Val、及將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp ；(aw)將α亞單位的第148位的Gly取代為Asp、將α亞單位的第204位的Val取代為Arg、將β亞單位的第108位的Glu取代為Asp、及將β亞單位的第200位的Ala取代為 Glu ；(ax)將α亞單位的第36位的Thr取代為Gly、及將α亞單位的第188位的Thr取代為 Gly ；(ay)將α亞單位的第36位的Thr取代為Ala、及將α亞單位的第48位的Asn取代為 Gln ；(az)將α亞單位的第48位的Asn取代為Glu、及將β亞單位的第146位的Arg取代為 Gly ；(ba)將α亞單位的第36位的Thr取代為Trp、及將β亞單位的第176位的Tyr取代為 Cys ；(bb)將β亞單位的第176位的Tyr取代為Met、及將β亞單位的第217位的Asp取代為Gly ；(be)將α亞單位的第36位的Thr取代為kr、及將β亞單位的第33位的Ala取代為 Val ；(bd)將β亞單位的第176位的Tyr取代為Ala、及將β亞單位的第217位的Asp取代為Val ；(be)將β亞單位的第40位的Thr取代為Val、及將β亞單位的第218位的Cys取代為 Met ；(bf)將β亞單位的第33位的Ala取代為Met、及將β亞單位的第176位的Tyr取代為 iThr ；(bg)將β亞單位的第40位的Thr取代為L(zhǎng)eu、及將β亞單位的第217位的Asp取代為 Leu ；(bh)將β亞單位的第40位的Thr取代為lie、及將β亞單位的第61位的Ala取代為 Val ；(bi)將β亞單位的第61位的Ala取代為Thr、及將β亞單位的第218位的Cys取代為 Ser ；(bj)將β亞單位的第112位的Lys取代為Val、及將β亞單位的第217位的Asp取代為Met ；(bk)將β亞單位的第61位的Ala取代為 ρ、及將β亞單位的第217位的Asp取代為 His ；(bl)將β亞單位的第61位的Ala取代為L(zhǎng)eu、及將β亞單位的第112位的Lys取代為 Ile ；(bm)將β亞單位的第146位的Arg取代為Gly、及將β亞單位的第217位的Asp取代為；(bn)將β亞單位的第171位的Lys取代為Ala、及將β亞單位的第217位的Asp取代為Thr ；(bo)將β亞單位的第150位的Ala取代為kr、及將β亞單位的第217位的Asp取代為Cys ；(bp)將β亞單位的第61位的Ala取代為Gly、及將β亞單位的第150位的Ala取代為 Asn ；(bq)將β亞單位的第61位的Ala取代為kr、及將β亞單位的第160位的Arg取代為 Met ；(br)將β亞單位的第160位的Arg取代為Cys、及將β亞單位的第168位的Thr取代為Glu。
8.一種編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的腈水合酶突變體的基因。
9.一種編碼腈水合酶突變體的基因，其包含序列表的序列號(hào)3表示的編碼α亞單位的基因和序列表的序列號(hào)4表示的編碼β亞單位的基因，其特征在于，包含選自由下述 (a) (1)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)的堿基取代，(a)序列號(hào)3的堿基序列的第274位 第276位；(b)序列號(hào)3的堿基序列的第280位 第282位；(c)序列號(hào)3的堿基序列的第89位 第591位；(d)序列號(hào)4的堿基序列的第10位 第12位；(e)序列號(hào)4的堿基序列的第69位 第71位；(f)序列號(hào)4的堿基序列的第235位 第237位；(g)序列號(hào)4的堿基序列的第286位 第288位；(h)序列號(hào)4的堿基序列的第319位 第321位；(i)序列號(hào)4的堿基序列的第676位 第678位；(j)序列號(hào)4的堿基序列的第3 位 第330位、及序列號(hào)4的第691位 第693位； (k)序列號(hào)4的堿基序列的第616位 第618位、及序列號(hào)4的堿基序列的第688 位 第690位；(1)序列號(hào)3的堿基序列的第37位 第39位、及序列號(hào)3的堿基序列的第79位 第81位、及序列號(hào)4的堿基序列的第3 位 第330位。
10.如權(quán)利要求9所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于，進(jìn)一步包含選自由下述(m) (u)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代(m)為(b)或(g)時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第37位 第39位； (η)為(b)或(h)時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第79位 第81位； (ο) (d)及(f)；(P)為(f)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 690位； (q) (a)及⑴；(r)為(i)時(shí)，序列號(hào)3的堿基序列的第37 39位及序列號(hào)4的堿基序列的第616 位 第618位；(s)為(a)及(d)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第616位 第618位； (t)為(c)及(h)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位； (u)為(f)時(shí)，序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位、及序列號(hào)4的堿基序列的第691位 第693位。
11.如權(quán)利要求9所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于，為(e)時(shí)，進(jìn)一步包含選自由(a)、(c)、(f)、⑴、(h)、序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位、及序列號(hào) 4的堿基序列的第691位 第693位組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代為其他堿基的取代。
12.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于 序列號(hào)3的堿基序列的第37位 第39位被堿基取代時(shí)，ATC被取代為CTC ； 序列號(hào)3的堿基序列的第79位 第81位被堿基取代時(shí)，ATG被取代為ATC ； 序列號(hào)3的堿基序列的第274位 第276位被堿基取代時(shí)，GAC被取代為GAG ； 序列號(hào)3的堿基序列的第280位 第282位被堿基取代時(shí)，ATG被取代為ATC ； 序列號(hào)3的堿基序列的第589位 第591位被堿基取代時(shí)，GGC被取代為TGC ； 序列號(hào)4的堿基序列的第10位 第12位被堿基取代時(shí)，GTG被取代為ATG ； 序列號(hào)4的堿基序列的第69位 第71位被堿基取代時(shí)，GTC被取代為ATC ；序列號(hào)」4的堿基序列的第235位- 第237位被堿基取代時(shí)，CAC被取代為AAC序列號(hào)」4的堿基序列的第286位- 第288位被堿基取代時(shí)，CAG被取代為CGT序列號(hào)」4的堿基序列的第319位- 第321位被堿基取代時(shí)，CCC被取代為ATG序列號(hào)」4的堿基序列的第328位- 第330位被堿基取代時(shí)，GAG被取代為AAC序列號(hào)」4的堿基序列的第616位- 第618位被堿基取代時(shí)，CCG被取代為CTG序列號(hào)4的堿基序列的第676位 第678位被堿基取代時(shí)，GTC被取代為ATC ； 序列號(hào)4的堿基序列的第688位 第690位被堿基取代時(shí)，GCG被取代為GAG ； 序列號(hào)4的堿基序列的第691位 第693位被堿基取代時(shí)，GCC被取代為GTC。
13.如權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因，其特征在于，包含選自由下述(aa) (br)組成的堿基取代位置中的至少1個(gè)堿基取代，且具有腈水合酶活性(aa)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、及將序列號(hào)3 的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC ；(ab)將序列號(hào)3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、及將序列號(hào)3 的堿基序列的第610位 第612位的GTC取代為CGC ；(ac)將序列號(hào)4的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT ；(ad)將序列號(hào)4的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(ae)將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第556位 第558位的CTG取代為CGG ；(af)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、及將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC ；(ag)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、及將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC ；(ah)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào)3 的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、及將序列號(hào)3的堿基序列的第610 位 第612位的GTC取代為CGC ；(ai)將序列號(hào)4的堿基序列的第觀位 第30位的ACC取代為GAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(aj)將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為CTC、將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598 位 第600位的GCC取代為GAG ；(ak)將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為GTC、將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598 位 第600位的GCC取代為GAG ；(al)將序列號(hào)4的堿基序列的第121位 第123位的TTC取代為ATC、將序列號(hào)4 的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第322 位 第3 位的GAG取代為GAT ；(am)將序列號(hào)4的堿基序列的第136位 第138位的ATG取代為AAG、將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634位 第636位的TCC取代為TAC ；(an)將序列號(hào)4的堿基序列的第142位 第144位的CTG取代為GTG、將序列號(hào)4 的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634 位 第636位的TCC取代為TAC ；(ao)將序列號(hào)4的堿基序列的第379位 第381位的CTG取代為TCG、將序列號(hào)4 的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第556 位 第558位的CTG取代為CGG ；(ap)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3的堿基序列的第陽(yáng)位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378 位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第136位 第138位的ATG取代為AAGjf 序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634位 第636位的TCC取代為TAC ；(aq)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3的堿基序列的第陽(yáng)位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378 位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第142位 第144位的CTG取代為GTGjf 序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為CGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第634位 第636位的TCC取代為TAC ；(ar)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為GCG、將序列號(hào)3的堿基序列的第陽(yáng)位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378 位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第379位 第381位的CTG取代為TCGjf 序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第556位 第558位的CTG取代為CGG ；(as)將序列號(hào)3的堿基序列的第16位 第18位的CTG取代為ACG、將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第 378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第28位 第30位的ACC取代為GAC、 將序列號(hào)4的堿基序列的第352位 第3M位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(at)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為 CTC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(au)將序列號(hào)3的堿基序列的第55位 第57位的GCG取代為GTG、將序列號(hào)3的堿基序列的第211位 第213位的CGT取代為CAT、將序列號(hào)3的堿基序列的第376位 第378位的TTC取代為TAC、將序列號(hào)4的堿基序列的第109位 第111位的TTC取代為 GTC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3 位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為GAG ；(av)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為ATG、將序列號(hào)3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、將序列號(hào)3的堿基序列的第610位 第612位的GTC取代為CGC、將序列號(hào)4的堿基序列的第121位 第123位的TTC取代為 ATC、將序列號(hào)4的堿基序列的第151位 第153位的TTC取代為GTC、及將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT ；(aw)將序列號(hào)3的堿基序列的第442位 第444位的GGC取代為GAC、將序列號(hào)3的堿基序列的第610位 第612位的GTC取代為CGC、將序列號(hào)4的堿基序列的第322位 第3M位的GAG取代為GAT、及將序列號(hào)4的堿基序列的第598位 第600位的GCC取代為 GAG ；(ax)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為GGG、及將序列號(hào)3 的堿基序列的第562位 第564位的ACC取代為GGC ；(ay)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為GCG、及將序列號(hào)3 的堿基序列的第142位 第144位的AAC取代為CAA ；(az)將序列號(hào)3的堿基序列的第142位 第144位的AAC取代為GAA、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第436位 第438位的CGG取代為GGG ；(ba)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為TGG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為TGC ；(bb)將序列號(hào)4的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為ATG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為GGC ；(be)將序列號(hào)3的堿基序列的第106位 第108位的ACG取代為TCG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第97位 第99位的GCG取代為GTG ；(bd)將序列號(hào)4的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為GCC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為GTC ；(be)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為GTG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第652位 第6M位的TGC取代為ATG ；(bf)將序列號(hào)4的堿基序列的第97位 第99位的GCG取代為ATG、及將序列號(hào)4的堿基序列的第5 位 第5 位的TAC取代為ACC ；(bg)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為CTG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為CTC ；(bh)將序列號(hào)4的堿基序列的第118位 第120位的ACG取代為ATT、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為GTC ；(bi)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為ACG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第652位 第6M位的TGC取代為TCC ；(bj)將序列號(hào)4的堿基序列的第334位 第336位的AAG取代為GTG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為ATG ；(bk)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為TGG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為CAC ；(bl)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為CTC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第334位 第336位的AAG取代為ATT ；(bm)將序列號(hào)4的堿基序列的第436位 第438位的CGG取代為GGG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為AGC ；(bn)將序列號(hào)4的堿基序列的第511位 第513位的AAG取代為GCG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為ACC ；(bo)將序列號(hào)4的堿基序列的第448位 第450位的GCG取代為TCG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第649位 第651位的GAC取代為TGT ；(bp)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為GGC、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第448位 第450位的GCG取代為AAT ；(bq)將序列號(hào)4的堿基序列的第181位 第183位的GCC取代為TCG、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為ATG ；(br)將序列號(hào)4的堿基序列的第478位 第480位的CGG取代為TGT、及將序列號(hào)4 的堿基序列的第502位 第504位的ACG取代為GAG。
14.一種被連接的DNA，所述DNA在權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶突變體的基因的5’末端上游進(jìn)一步包含含有基因表達(dá)所必需的啟動(dòng)子序列的DNA，并且在所述啟動(dòng)子的3’末端的下游包含序列號(hào)-J中所包含的核糖體結(jié)合序列。
15.一種質(zhì)粒，含有權(quán)利要求14所述的DNA。
16.一種轉(zhuǎn)化體，是利用權(quán)利要求15所述的質(zhì)粒將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的。
17.一種腈水合酶突變體的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括下述步驟將權(quán)利要求16中所述的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在所述轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)基于質(zhì)粒所含有的腈水合酶基因的腈水合酶突變體。
全文摘要
本發(fā)明的腈水合酶突變體包含至少1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸的取代，通過(guò)1個(gè)氨基酸取代而改善腈水合酶的2個(gè)以上的性質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102216455SQ20098014513
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者德田淳子, 數(shù)野康, 望月大資, 松本和也 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社