專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)血紅蛋白β鏈的N末端區(qū)域的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識(shí)別未修飾的血紅蛋白β鏈的N末端區(qū)域的抗體和使用該抗體的血紅蛋白Alc的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
血中的血紅蛋白(以下稱(chēng)為“Hb”)結(jié)合有糖的糖化血紅蛋白中，血紅蛋白β鏈的 N末端纈氨酸殘基由葡萄糖糖化的血紅蛋白Alc (以下稱(chēng)為“HbAlc”)由于在臨床上反映過(guò)去1 2個(gè)月的平均血糖值，因此作為適合糖尿病的診斷、糖尿病的病程觀察的指標(biāo)而廣泛使用。作為HbAlc的測(cè)定方法，使用HPLC法和免疫學(xué)測(cè)定方法，但是根據(jù)HPLC柱的種類(lèi)、試劑廠商，測(cè)定對(duì)象有微妙的不同，而要求測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化。從該觀點(diǎn)出發(fā)， IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) (國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì))的HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化的工作組，制定了基準(zhǔn)測(cè)定方法(以下稱(chēng)為“IFCC參照法”)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。該方法如下，將紅血球溶血液用蛋白酶消化而提取血紅蛋白β鏈的N末端六肽(VHLTPE)(序列號(hào)1)，求出該提取物中的HbAlc的β鏈N末端的糖化六肽(f-VHLTPE)、和血紅蛋白AO (以下稱(chēng)為“HbAO”)的β鏈N末端的未被修飾的六肽(VHLTPE)(序列號(hào)1)的量，利用下述式算出HbAlc含有率(％ )。HbAlc 含有率(% ) = (f-VHLTPE 量 / (f-VHLTPE 量 +VHLTPE 量))X 100 = (HbAlc 量 / (HbAlc 量 +HbAO 量))X 100但是，該方法中的糖化六肽含量的測(cè)定方法由于使用HPLC-MS或HPLC-毛細(xì)管電泳，需要昂貴的裝置，并且只能用特定的設(shè)施進(jìn)行測(cè)定。另外，存在其測(cè)定值與以往的方法的HbAlc值相比發(fā)生很大變化的問(wèn)題(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Clin. Chem. Lab. Med. 2002 ；40 (1) :78-89非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 糖尿病46卷9號(hào)000；3)，775 778頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的課題是提供能夠測(cè)定與IFCC參照法相同的HbAlc含有率(％ )的通用的方法。在這里，本發(fā)明的發(fā)明人為了開(kāi)發(fā)代替HPLC-MS、HPLC-毛細(xì)管電泳法的IFCC參照法而進(jìn)行研究的結(jié)果，首次成功制成了與Hb β鏈N末端的六肽VHLTPE (序列號(hào)1)特異性地反應(yīng)、且與該六肽被修飾的肽不反應(yīng)的抗體。并發(fā)現(xiàn)使用該抗體與HbAlc抗體，可以正確且簡(jiǎn)便地定量HbAlc與HbAO，可以利用簡(jiǎn)便的免疫學(xué)方法測(cè)定IFCC參照法的HbAlc含有率 (%)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供一種抗體，該抗體與N末端具有氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，與該肽或蛋白質(zhì)的N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)。
另外，本發(fā)明提供一種試樣中的HbAlc含有率的測(cè)定方法，其特征在于，使用上述抗體測(cè)定試樣中的HbAO量，使用抗HbAlc抗體測(cè)定上述試樣中的HbAlc量，由下式(1)算出試樣中的HbAlc含有率(％ )。HbAlc 含有率(% ) = (HbAlc 量/(HbAlc 量+HbAO 量))X 100(1)使用本發(fā)明的抗體可以正確且簡(jiǎn)便地測(cè)定試樣中的HbAO量，因此，能夠簡(jiǎn)便且正確地測(cè)定利用將試樣中的HbAO量與HbAlc量作為基準(zhǔn)的IFCC參照法的HbAlc含有率 (% )。


圖1表示利用免疫層析法的HbAlc的測(cè)定方法示意圖。圖2表示利用免疫層析法的HbAlc的測(cè)定方法示意圖。圖3表示用抗原固相化ELISA法測(cè)定小鼠抗血清中的抗體效價(jià)的結(jié)果。圖4表示用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢驗(yàn)本發(fā)明抗體對(duì)血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE) (序列號(hào)1)及其糖化肽(f-VHLTPE)的反應(yīng)性的結(jié)果。圖5表示用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢驗(yàn)本發(fā)明抗體對(duì)血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE) (序列號(hào)1)以及α鏈N末端肽(VLSPAD)(序列號(hào)10)的反應(yīng)性的結(jié)果。圖6表示用抗原固相化ELISA法檢驗(yàn)本發(fā)明抗體、抗血紅蛋白抗體對(duì)HbAlc以及 HbAO的反應(yīng)性的結(jié)果。圖7表示用抗原固相化ELISA法檢驗(yàn)本發(fā)明抗體、抗血紅蛋白抗體、以及抗HbAlc 抗體對(duì)以HPLC分離的血紅蛋白亞型的反應(yīng)性的結(jié)果。圖8表示利用夾心ELISA的HbAlc濃度測(cè)定系、以及HbAO濃度測(cè)定系中的校正曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的抗體是與N末端具有氨基酸序列VHLTPE (序列號(hào)1)、且N末端纈氨酸未被修飾的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，與該肽或蛋白質(zhì)的N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)的抗體。作為N末端具有氨基酸序列VHLTPE (序列號(hào)1)、且N末端纈氨酸未被修飾的肽， 可以舉出由氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)構(gòu)成的寡肽、以及含有氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)的多肽。作為N末端具有氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)、且N末端纈氨酸未被修飾的蛋白，可以舉出作為健康成人的主要的Hb的、具有Hbi3鏈的血紅蛋白AO和具有Hb δ鏈的血紅蛋白Α2(以下稱(chēng)為“HbA2”)中δ鏈N末端未被修飾的蛋白，HbA2是非常微量的成分。因此，作為與本發(fā)明抗體反應(yīng)的主要Hb，可以舉出HbAO。另一方面，作為上述N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)，可以舉出N末端具有氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)、且該N末端纈氨酸被糖修飾的肽或Hb。作為該蛋白質(zhì)，可以舉出 HbAlc。因此，作為本發(fā)明的抗體的優(yōu)選方式，可以舉出與N末端具有氨基酸序列 VHLTPE (序列號(hào)1)、且N末端纈氨酸未被修飾的肽或Hb反應(yīng)，與該肽或Hb的N末端纈氨酸被修飾的肽或Hb不反應(yīng)的抗體。作為進(jìn)一步優(yōu)選的方式，是與HbAO反應(yīng)，與HbAlc不反應(yīng)的抗體。進(jìn)而，本發(fā)明的抗體優(yōu)選與Hb以外的蛋白質(zhì)不反應(yīng)，進(jìn)一步與不具有氨基酸序列 VHLTPE (序列號(hào)1)的Hb、例如HbF不反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，但特別優(yōu)選為單克隆抗體。本發(fā)明的抗體由于HbAO在β鏈N末端具有VHL(序列號(hào)2)，因此可以將具有氨基酸序列VHL(序列號(hào)2)的肽或蛋白質(zhì)作為免疫原來(lái)使用，通過(guò)常規(guī)方法制作。作為免疫原的例子，可以舉出VHLC (序列號(hào)3)、VHLTC (序列號(hào)4)、VHLTPC (序列號(hào)5)、VHLTPEC (序列號(hào)6)、VHL (序列號(hào)2)、VHLT (序列號(hào)7)、VHLTP (序列號(hào)8)、VHLTPE (序列號(hào)1)、以及這些肽與載體蛋白結(jié)合的抗原。作為載體蛋白，可以舉出卵清蛋白(以下稱(chēng)為“OVA”)、牛血清白蛋白(以下稱(chēng)為“BSA”)、陽(yáng)離子化BSA(以下稱(chēng)為“cBSA”)、鑰孔戚血藍(lán)蛋白(以下稱(chēng)為 “KLH”)等。肽與載體蛋白的結(jié)合方法可以舉出MBS法(使用m-Maleimidobenzoyl-N-hyd roxysuccinimide ester 的方法)以及 EDC 法(使用 l-ethyl-3- (3-dimethyIaminopropyl )carbodiimide hydrochloride 的方法)等。本發(fā)明的單克隆抗體例如可以以Antibodies，ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)記載的方法為基準(zhǔn)來(lái)制作。用于免疫的動(dòng)物沒(méi)有特別的限定，例如可以舉出小鼠、大鼠等。免疫方法可以根據(jù)一般方法來(lái)進(jìn)行。例如，將免疫原懸于通常的緩沖液、生理鹽水的溶液，或者免疫原與完全弗氏佐劑等補(bǔ)液的混合物給藥到動(dòng)物皮下、皮內(nèi)、腹腔等刺激一段時(shí)間后，根據(jù)需要重復(fù)進(jìn)行同樣的操作?？乖慕o藥量根據(jù)給藥途徑、動(dòng)物種類(lèi)來(lái)適當(dāng)決定，通常的給藥量?jī)?yōu)選每次 10 μ g Img左右。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選最終免疫的3 4日后取出的脾細(xì)胞。另外， 作為與上述免疫細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞(以下稱(chēng)為“骨髓瘤細(xì)胞”)，優(yōu)選已經(jīng)確立的公知的各種細(xì)胞株，例如可以舉出小鼠中的NSl (P3/NSI/I-Ag4-l) [Eur. J. Immunol. 6 511-519(1976)]、SP2/0-Agl4[Nature 276 :269 (1978)]、P3-X63_Ag8. 653[J. Immunol. 123 1548(1979)]、P3-X63_Ag8U. 1 [C urr. Top. Microbiol. Immunol. 81 :1(1978)]等，大鼠中的 Y3-Agl. 2. 3. [Nat ure 277 :131-133 (1979) ]、YB2/0(YB2/3HL/P2. Gil. 16Ag. 20) [Methods Enzymo 1. 73B :1(1981)]等。細(xì)胞融合可以使用通常使用的聚乙二醇(以下稱(chēng)為“PEG”)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等。 細(xì)胞融合的方法與通常的方法相同，例如在骨髓瘤細(xì)胞與相對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞為約1 10倍的免疫細(xì)胞的混合顆粒中，以30 60%的濃度滴入平均分子量為1000 6000的PEG，并混合。雜交瘤細(xì)胞的選擇使用通常的選擇性培養(yǎng)基、例如含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(以下稱(chēng)為“HAT”)的培養(yǎng)基?？墒褂靡訦AT培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到的雜交瘤細(xì)胞，利用通常的極限稀釋法，進(jìn)行目標(biāo)抗體產(chǎn)生株的檢索以及單克隆化。目標(biāo)抗體產(chǎn)生株可以通過(guò)以下方法得到，即，利用例如ELISA法、RIA法等，選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述抗體與具有VHLTPE(序列號(hào)1)的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，與該肽或蛋白質(zhì)的N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，首先使培養(yǎng)上清中的單克隆抗體與固相化的純化HbAO抗原反應(yīng)，接著使標(biāo)記抗IgG抗體反應(yīng)。利用抗原固相化ELISA法，篩選產(chǎn)生對(duì)HbAO具有高反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。對(duì)得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)一步利用將純化HbAO抗原固相化的板，在VHLTPE (序列號(hào)1)或糖化VHLTPE (f-VHLTPE)之間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，選擇產(chǎn)生與VHLTPE (序列號(hào)1)反應(yīng)、與f-VHLTPE不反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。該單克隆抗體可以通過(guò)以下方法制造，S卩，根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從培養(yǎng)上清分離的方法，將上述雜交瘤細(xì)胞給藥到與其具有適應(yīng)性的哺乳類(lèi)動(dòng)物，回收腹水的方法。這樣得到的本發(fā)明的單克隆抗體由于與Hb β鏈N末端未被修飾的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)、且與Hb β鏈的N末端被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)，因此是與HbAO反應(yīng)、與HbAlc不反應(yīng)的抗體。因此，作為用于將HbAO與HbAlc區(qū)別而進(jìn)行免疫測(cè)定的抗體而有用。使用本發(fā)明的抗體，可以進(jìn)行與IFCC參照法相同的HbAlc測(cè)定。即，使用本發(fā)明的抗體測(cè)定試樣中的HbAO量，使用抗HbAlc抗體測(cè)定上述試樣中的HbAlc量，由下式(1) 算出試樣中的HbAlc含有率(％ )，即可測(cè)定試樣中的HbAlc含有率。HbAlc 含有率(% ) = (HbAlc 量/(HbAlc 量+HbAO 量))X 100(1)另外，考慮到本發(fā)明單克隆抗體的識(shí)別部位，上述式⑴還可以用下式(2)表示。HbAlc 含有率(% ) = (f-VHLTPE 量 / (f-VHLTPE 量 +VHLTPE 量))X 100 (2)本發(fā)明方法中的HbAO的測(cè)定方法和HbAlc的測(cè)定方法只要是通常的免疫學(xué)測(cè)定方法就可以采用任意一種。在這里作為免疫學(xué)測(cè)定方法，可以舉出夾心ELISA法、競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA法、免疫層析法、乳膠凝集法、競(jìng)爭(zhēng)性乳膠凝集法等。通過(guò)在以往的任意的免疫學(xué)測(cè)定方法中適用本發(fā)明的單克隆抗體，可以分別測(cè)定 HbAO 與 HbAlc。例如，以?shī)A心ELISA法測(cè)定時(shí)，可以將純化的HbAO、或HbAlc作為標(biāo)準(zhǔn)品以如下的方法定量HbAO或HbAlc。即，將本發(fā)明的單克隆抗體或抗HbAlc抗體固定化的ELISA板上添加稀釋的檢測(cè)體試樣并進(jìn)行反應(yīng)后，使標(biāo)記有酶的抗血紅蛋白抗體(以下稱(chēng)為“抗Hb抗體”)反應(yīng)，從顯色后的吸光度的變化可以對(duì)試樣中存在的HbAO或HbAlc進(jìn)行特異性地定量。以乳膠凝集法測(cè)定時(shí)，可以將純化的HbAO或HbAlc作為標(biāo)準(zhǔn)品以如下的方法進(jìn)行定量。S卩，將本發(fā)明的單克隆抗體或抗HbAlc抗體的至少一種在不溶性載體乳膠粒子上敏化，通過(guò)與檢測(cè)體試樣和抗Hb單克隆抗體接觸，介由試樣中的HbAO或HbAlc，抗體敏化乳膠粒子彼此交聯(lián)而發(fā)生凝集，因此，可以由該凝集度的變化對(duì)該HbAO或HbAlc進(jìn)行特異性地定量?；蛘咭愿?jìng)爭(zhēng)性乳膠凝集法測(cè)定時(shí)，可以將純化的HbAO或HbAlc作為標(biāo)準(zhǔn)品以如下方法進(jìn)行定量。即，將VHLTPE(序列號(hào)1)或f-VHLTPE中的至少一種在不溶性載體乳膠粒子上敏化，通過(guò)與檢測(cè)體試樣、以及本發(fā)明的單克隆抗體或抗HbAlc抗體中的至少一種接觸，對(duì)根據(jù)肽敏化乳膠粒子與抗體的凝集反應(yīng)，檢測(cè)體試樣中的HbAO或HbAlc顯示競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此，可以由該競(jìng)爭(zhēng)性抑制的變化對(duì)該HbAO或HbAlc進(jìn)行特異性地定量。作為檢測(cè)體試樣，只要是含有HbAO或HbAlc的人體液就沒(méi)有特別的限制，例如可以舉出血液、紅血球組分等。作為乳膠凝集法等中的乳膠粒子，只要是在利用了乳膠凝集反應(yīng)的免疫學(xué)凝集反應(yīng)以及凝集抑制反應(yīng)中一般使用的微粒的載體就沒(méi)有特別的限制，但是優(yōu)選能夠在工業(yè)上大量生產(chǎn)的有機(jī)系微粒。作為這樣的有機(jī)系微粒，例如可以舉出苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、醋酸乙烯酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等乙烯系單體的均聚物或共聚物；苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯-丁二烯共聚物等丁二烯系共聚物等。另外，還可以?xún)?yōu)選使用在這樣的有機(jī)系微粒上結(jié)合有羧基、伯氨基、氨基甲?；?、羥基、醛基等官能團(tuán)的反應(yīng)性有機(jī)系微粒。 從抗原或抗體的吸附性?xún)?yōu)異、可長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存生物學(xué)活性的角度考慮，在上述乳膠粒子中優(yōu)選聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等聚苯乙烯系乳膠粒子。乳膠粒子的形狀沒(méi)有特別的限定，其平均粒徑優(yōu)選乳膠粒子表面的蛋白質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的凝集反應(yīng)的結(jié)果所產(chǎn)生的凝集體能夠用肉眼或光學(xué)上檢測(cè)的足夠的大小。優(yōu)選的平均粒徑是0. 02 1. 6 μ m,特別優(yōu)選0. 03 0. 5 μ m。在乳膠粒子上將本發(fā)明的單克隆抗體或抗HbAlc抗體進(jìn)行敏化的方法沒(méi)有特別的限制，可以使用公知的方法。例如可以舉出在乳膠粒子表面物理性吸附的方法、在具有官能團(tuán)的乳膠粒子表面進(jìn)行共價(jià)鍵合的方法、以及利用免疫學(xué)性的結(jié)合進(jìn)行敏化的方法等。用免疫層析法測(cè)定時(shí)，可以同時(shí)測(cè)定HbAO和HbAlc，所以特別適合。例如，如圖1 所示，使用將本發(fā)明單克隆抗體和抗HbAlc抗體分別在不同部位(A線和B線)固定化的免疫層析支持體。圖1中的露出化處理可以使用胍或其鹽與非離子型表面活性劑、胍或其鹽與亞硝酸鹽、胍或其鹽與非離子型表面活性劑與亞硝酸鹽、或者以往公知的胍、硫氰酸、 硫氰酸鋰、鐵氰化物、離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑等。將含有表位被露出化的 HbAO和HbAlc的試樣滴落到樣品墊。滴落的試樣通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象而展開(kāi)，到達(dá)A線則只有試樣中的HbAO反應(yīng)，到達(dá)B線則只有試樣中的HbAlc反應(yīng)。其他的血紅蛋白不反應(yīng)而移動(dòng)到末端墊。用免疫層析檢測(cè)儀測(cè)定A線和B線的顏色的濃度、反射強(qiáng)度、或吸光度等，則可以分別定量試樣中的HbAO和HbAlc。在這里，將HbAO的定量值設(shè)為A、HbAlc的定量值設(shè)為 B，則可以由 HbAlc (% ) = (B/(A+B)) XlOO 求出 HbAlc(% )。另外，在上述免疫層析支持體中，預(yù)先在樣品墊上含浸結(jié)合有彩色乳膠的抗Hb抗體(圖幻。圖2中的露出化處理可以使用與上述相同的物質(zhì)。將含有經(jīng)露出化處理的HbAlc 的試樣滴落到樣品墊。滴落的試樣中的Hb(圖2中以橢圓表示)與抗Hb抗體反應(yīng)，并在支持體上移動(dòng)。A線中，形成抗Hb抗體-HbAO-本發(fā)明抗體的夾心復(fù)合體。另一方面，B線中，形成抗Hb抗體-HbAlc-抗HbAlc抗體的夾心復(fù)合體。其他的Hb與抗Hb抗體的結(jié)合物移動(dòng)至末端墊。對(duì)于形成的上述夾心復(fù)合體量，用免疫層析檢測(cè)儀測(cè)定A線和B線的顏色的濃度、反射強(qiáng)度、或吸光度等，則可以分別定量試樣中的HbAO和HbAlc。在這里，將HbAO 的定量值設(shè)為A、HbAlc的定量值設(shè)為B，則也可以由HbAlc (%) = (B/(A+B)) X 100求出 HbAlc (% )。應(yīng)予說(shuō)明，還可以代替彩色乳膠使用金膠體粒子等。在這里，作為抗HbAlc抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，例如可以使用專(zhuān)利文獻(xiàn)(日本特開(kāi)昭61-172064號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)平6-66796號(hào)公報(bào))記載的抗體寸。應(yīng)予說(shuō)明，實(shí)施上述免疫學(xué)測(cè)定方法時(shí)，可以利用使用本發(fā)明的抗體而制造的含有該抗體的免疫學(xué)測(cè)定用試劑盒。該試劑盒可以包括在免疫學(xué)測(cè)定方法的一般性的構(gòu)成要素，例如，標(biāo)記物、載體、支持體、緩沖液、穩(wěn)定劑、反應(yīng)器等。實(shí)施例
接下來(lái)，舉出實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但這些并不限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 (雜交瘤細(xì)胞的制作與抗體的獲得)(I)材料與方法(1)純化HbAO和純化HbAlc的調(diào)制利用使用了非專(zhuān)利文獻(xiàn)(Melisenda J. McDonald et al, JBC, 253 (7), 2327-2332, 1978)所述的Bio-Rex70 (Bio-Rad公司)的離子交換色譜法，由人紅血球溶血液純化HbAO 和HbAlc，用于以后的實(shí)驗(yàn)。(2)各種肽和糖化肽的調(diào)制各序列的肽是利用肽自動(dòng)合成裝置通過(guò)Fmoc法來(lái)合成以及純化。各肽的純度用HPLC確認(rèn)在95%以上。另外，用質(zhì)量分析裝置(MALDI-T0F)確認(rèn)了各肽的分子量與理論值相同。糖化肽是用專(zhuān)利文獻(xiàn)(日本特開(kāi)昭61-172064號(hào)公報(bào))所述的方法合成并純化。即，使各序列的肽與葡萄糖在無(wú)水吡啶中反應(yīng)并用HPLC進(jìn)行純化。用質(zhì)量分析裝置 (MALDI-T0F)確認(rèn)了各糖化肽的分子量與理論值、即在各肽的分子量上加162而得的分子量相同。(3)抗Hb抗體和抗HbAlc抗體的調(diào)制抗Hb抗體使用將上述(1)的純化HbAO作為免疫原以規(guī)定方法制作的小鼠單克隆抗體。抗HbAlc抗體使用以專(zhuān)利文獻(xiàn)(日本特開(kāi)昭61-172064號(hào)公報(bào))所述的方法制作的小鼠單克隆抗體。S卩，將上述⑵合成的糖化肽(f-VHLTPEEKYYC)(序列號(hào)9)與KLH結(jié)合， 將此作為免疫原。在雜交瘤細(xì)胞的篩選中，選擇在抗原固相化ELISA中與純化HbAlc反應(yīng)、 且與純化HbAO不反應(yīng)的株。(4)免疫用抗原的調(diào)制a.將人血紅蛋白β鏈N末端肽的C末端側(cè)結(jié)合有半胱氨酸的各序列的肽 (VHLC(序列號(hào)3)、VHLTC(序列號(hào)4)、VHLTPC(序列號(hào)5)、VHLTPEC(序列號(hào)6))按照上述 ⑵所示進(jìn)行調(diào)制。將它們以5mg/mL的濃度溶解到含有0. 15mol/L NaCl的20mmol/L磷酸緩沖液pH7.2(以下稱(chēng)為“PBS”)中。b.以5mg/mL的濃度將市售(PIERCE公司制)的馬來(lái)酰亞胺活性型的各載體蛋白 (OVA、BSA、cBSA、KLH)溶解于純凈水。c.將上述肽溶液與載體蛋白溶液以1比1混合后，邊在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)邊溫育2 小時(shí)。d.然后，在4°C下，在PBS中進(jìn)行2天的透析。e.回收透析后的液體，并作為各免疫用抗原來(lái)使用。(5)免疫與試驗(yàn)采血將上述免疫用抗原與佐劑以1 1混合后，使用連結(jié)注射器制作乳液。將其注入雌的BALB/c小鼠的背部皮下(每只20 50 μ g)。將該操作(免疫)每2周重復(fù)5次。免疫開(kāi)始6周后，從各小鼠的眼底采取小鼠抗血清，用后述的抗原固相化ELISA法確認(rèn)該抗血清中的抗體效價(jià)。應(yīng)予說(shuō)明，在任意的ELISA法中，將從沒(méi)有進(jìn)行免疫的小鼠的眼底采取的血清作為對(duì)照使用。(6)細(xì)胞融合從由上述試驗(yàn)采血確認(rèn)了高抗體效價(jià)的小鼠中摘出脾臟，通過(guò)使用了50% _PEG1450(西格瑪公司制)的常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞使用SP2/0。得到的融合細(xì)胞懸于含有HAT和15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，使得脾細(xì)胞達(dá)到2. 5 X IO6/ mL，并以0. 2mL分別注入96孔培養(yǎng)板。將其在5% CO2培養(yǎng)箱中以37°C進(jìn)行培養(yǎng)。(7)篩選細(xì)胞融合10日后，作為1次篩選，使用培養(yǎng)上清進(jìn)行后述的抗原固相化ELISA法， 將對(duì)于純化HbAO顯示高反應(yīng)性的孔作為1次陽(yáng)性孔進(jìn)行挑選。該1次陽(yáng)性孔中的細(xì)胞在 24孔板中進(jìn)行傳代。傳代2天后，作為2次篩選，使用培養(yǎng)上清進(jìn)行后述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，將對(duì)于人血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE)(序列號(hào)1)顯示高反應(yīng)性、且對(duì)于相同氨基酸序列的糖化肽(f-VHLTPE)不顯示反應(yīng)的孔作為2次陽(yáng)性孔來(lái)選擇。(8)克隆和免疫球蛋白(抗體)采取將2次篩選中挑選的5株雜交瘤細(xì)胞用極限稀釋法進(jìn)行克隆。接著，為了采取各雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白(抗體)，對(duì)2周前將姥鮫烷0. 5mL注射到腹腔內(nèi)的12周齡的雌BALB/c小鼠，將雜交瘤細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)0. 5X IO6個(gè)的量給藥到腹腔內(nèi)。14天后采取腹水， 離心處理得到上清。將上清與等量的吸附用緩沖液(3mol/L NaClU. 5mol/L Glycine-NaOH 緩沖液、pH8』)混合后，進(jìn)行過(guò)濾。使該濾液通過(guò)以吸附用緩沖液進(jìn)行了平衡化的蛋白A 瓊脂糖凝膠柱，從而將濾液中的抗體吸附于柱后，用0. lmol/L枸櫞酸緩沖液(pH3. 0)洗脫。 將該洗脫液以lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)中和后，用PBS進(jìn)行透析，采取抗體。(9) ELISA用板的制作將溶解于PBS而調(diào)制成1 μ g/mL的濃度的純化HbAO作為篩選用抗原，并以50 μ L/ 孔在96孔板上進(jìn)行固相化，在4°C靜置一晚。用含有0.05% Tween20的PBS(以下稱(chēng)為 “PBST”)以400 μ L/孔洗凈3次后，以100 μ L/孔分別注入含有1 % BSA的PBST (以下稱(chēng)為 “ 1 % BSA-PBST")，在室溫下靜置1小時(shí)以進(jìn)行封閉，從而制作ELISA用板。用PBST洗凈3 次該ELISA用板后，添加各試劑，用于實(shí)施例記載的各ELISA法試驗(yàn)。(10)抗原固相化ELISA法a.在ELISA用板上以50 μ L/孔分別注入利用1 % BSA-PBST逐級(jí)稀釋的各小鼠抗血清、或者融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清，在室溫下靜置1小時(shí)。b.用PBST洗凈3次后，以50 μ L/孔分別注入用1 % BSA-PBST稀釋5000倍的 HRP-GtF(ab，)2-Anti_Mouse Ig，s(Biosource公司制)的溶液，在室溫下靜置1小時(shí)。c.用PBST洗凈3次后，分別注入含有鄰苯二胺鹽酸鹽的顯色液(將鄰苯二胺鹽酸鹽(東京化成公司制)、過(guò)氧化氫溶解于PH5. 0的枸櫞酸緩沖液中，使得鄰苯二胺鹽酸鹽的濃度為ang/mL、過(guò)氧化氫的濃度為0. 02% )(以下稱(chēng)為“0PD顯色液”)(50 μ L/孔)，在室溫下靜置10分鐘。d.以50 μ L/孔分別注入0. 75mol/L硫酸使反應(yīng)停止后，用板檢測(cè)儀測(cè)定492nm的
吸光度。(11)競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 法a.在ELISA用板上以25 μ L/孔分別注入將人血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE) (序列號(hào)1)、或相同氨基酸序列的糖化肽(f-VHLTPE)用BSA-PBST稀釋到適當(dāng)濃度的溶液。
b.接著，以25 μ L/孔分別注入用BSA-PBST稀釋到適當(dāng)濃度的融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清，在室溫下靜置1小時(shí)。以后的操作按照與上述(10)抗原固相化ELISA法的工序b d相同的方法進(jìn)行。( II )結(jié)果(1)試驗(yàn)采血中的抗原固相化ELISA法試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)采血，利用抗原固相化ELISA法檢查各小鼠抗血清中抗體對(duì)純化HbAO的反應(yīng)性，結(jié)果6種小鼠抗血清全都確認(rèn)了對(duì)HbAO的反應(yīng)性(圖3)。認(rèn)為在本實(shí)施例中得到的各小鼠抗血清含有特異性識(shí)別作為免疫用抗原的人血紅蛋白β鏈N末端肽與載體蛋白的復(fù)合體、以及作為篩選用抗原的HbAO中的共通部分的Hbi3鏈的N末端序列的抗體。(2)篩選在1次篩選中選擇對(duì)經(jīng)固相化的純化HbAO顯示高反應(yīng)性的株，進(jìn)一步對(duì)該選擇株實(shí)施2次篩選，結(jié)果明確了 5種抗體(85201、85202、85203、85204、和85206)對(duì)人血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE)(序列號(hào)1)顯示高反應(yīng)性，且對(duì)相同氨基酸序列的糖化肽 (f-VHLTPE)不顯示反應(yīng)性。(3)克隆和免疫球蛋白(抗體)采取對(duì)2次篩選中選擇的5種抗體實(shí)施克隆，將產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(2008年11月觀日保藏，日本茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6)。保藏編號(hào)如下?？贵w編號(hào)保藏編號(hào)85201 =FERM BP-I118785202 :FERM BP-I118885203 =FERM BP-I118985204 =FERM BP-1119085206 =FERM BP-I1191實(shí)施例2(各雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性評(píng)價(jià))(I)材料與方法(1)試劑的調(diào)制用于評(píng)價(jià)的各抗原和各抗體按照與實(shí)施例1的⑴ ⑷相同的操作進(jìn)行調(diào)制。 另外，HPLC餾分(fraction)是使用將人紅血球溶血液通過(guò)利用了東曹公司制的TSK-gel GlycoHSi柱的K0500法進(jìn)行分離、并利用餾分收集器回收的各餾分。添加到抗原固相化 ELISA時(shí)，將各餾分用PBS稀釋6倍而使用。(2)特異性的評(píng)價(jià)按照與實(shí)施例1的抗原固相化ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法相同的方法進(jìn)行操作。但是，使用的抗體是純化IgG (單克隆抗體0. 2μ g/mL)。( II )結(jié)果(1)對(duì)肽和糖化肽的反應(yīng)性首先，如圖4所示，確認(rèn)了在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中用于試驗(yàn)的特異抗體(85201、85202) 均只對(duì)人血紅蛋白β鏈N末端肽(VHLTPE)(序列號(hào)1)進(jìn)行反應(yīng)，與相同氨基酸序列的糖化肽(f-VHLTPE)不反應(yīng)。另外，如圖5所示，確認(rèn)了與人血紅蛋白α鏈N末端肽(VLSPAD)不反應(yīng)。對(duì)其他3種特異抗體(85203、85204、85206)也進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)了只對(duì) VHLTPE (序列號(hào)1)進(jìn)行反應(yīng)、且與f-VHLTPE和VLSPAD (序列號(hào)10)不反應(yīng)。(2)對(duì)純化HbAO和純化HbAlc的反應(yīng)性如圖6所示，在抗原固相化ELISA中，首先，作為對(duì)照使用的抗Hb抗體對(duì)于純化 HbAO和純化HbAlc同樣進(jìn)行反應(yīng)。與此相對(duì)，用于試驗(yàn)的特異抗體(85201)與HbAlc不反應(yīng)，只對(duì)HbAO進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)其他4種特異抗體(85202、85203、85204、以及85206)也進(jìn)行相同試驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)了只對(duì)純化HbAO進(jìn)行反應(yīng)，與純化HbAlc不反應(yīng)。(3)對(duì)HPLC餾分的反應(yīng)性如圖7所示，在抗原固相化ELISA中，首先，作為對(duì)照使用的抗Hb抗體與HbAlc和 HbAO雙方反應(yīng)，另外，同樣作為對(duì)照使用的抗HbAlc抗體只對(duì)HbAlc的峰有反應(yīng)而對(duì)HbAO 的峰沒(méi)有反應(yīng)。與此相對(duì)，用于試驗(yàn)的3種特異抗體(85201、85202、85206)與HbAlc不反應(yīng)，只對(duì)HbAO進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)其他2種特異抗體(85203、85204)也進(jìn)行相同試驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)了對(duì)HbAO進(jìn)行反應(yīng)，與HbAlc不反應(yīng)。從以上的結(jié)果可以確認(rèn)用于試驗(yàn)的5種特異抗體與HbAlc不反應(yīng)，只對(duì)HbAO進(jìn)行反應(yīng)，另外，這些抗體可以檢測(cè)出血紅蛋白β鏈N末端六肽序列(VHLTPE)(序列號(hào)1)。實(shí)施例3 (根據(jù)ELISA的HbAlc值的測(cè)定)( I )材料與方法(1)抗HbAlc抗體、以及抗Hb抗體的調(diào)制用于測(cè)定的抗HbAlc抗體和抗Hb抗體按照與實(shí)施例1的(I ) (3)同樣地進(jìn)行調(diào)制。(2)生物素標(biāo)記抗Hb抗體的調(diào)制利用市售的生物素標(biāo)記試劑(PIERCE公司，EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)對(duì)上述(1)的抗Hb抗體以如下方式進(jìn)行標(biāo)記。將以lOmg/mL的濃度溶解于PBS的生物素標(biāo)記試劑0. 05mL添加到濃度為lmg/mL的抗Hb抗體液ImL中，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后， 用PBS透析，用于測(cè)定。(3)檢測(cè)體和標(biāo)準(zhǔn)試樣的調(diào)制用裝有EDTA_2Na的真空采血管(積水醫(yī)療公司制)對(duì)公司內(nèi)部的志愿者進(jìn)行采血，通過(guò)離心分離來(lái)分離紅血球。混合該紅血球4μ L與抗原處理液(1% Tween20-10mmol/ L NaN02-3mol/L胍鹽酸鹽-5mmol/LMES，ρΗ6. 0) 0. 2mL0在25°C下放置10分鐘后，將該混合液用3%脫脂牛奶-PBST逐級(jí)稀釋?zhuān)瑥亩鳛橄率鰥A心ELISA的檢測(cè)體來(lái)使用。另外，標(biāo)準(zhǔn)試樣使用了通過(guò)下述HPLC法預(yù)先求出了 HbAlc濃度和HbAO濃度的他人的檢測(cè)體。(4)利用夾心ELISA進(jìn)行的HbAO量(濃度)的測(cè)定a.將實(shí)施例1中獲得的特異抗體(85201)用PBS稀釋到5 μ g/mL的濃度。將其以 50 μ L/孔分別注入到ELISA板，在4°C靜置1夜。b.用PBST (350 μ L/孔)洗凈3次后，以100 μ 1/孔分別注入1% BSA-PBST，在室溫下靜置1小時(shí)。c.用PBST洗凈3次后，以50 μ L/孔分別注入上述(3)中處理的標(biāo)準(zhǔn)試樣或檢測(cè)體，在室溫下靜置1小時(shí)。d.用PBST洗凈3次后，以50 μ L/孔分別注入用1 % BSA-PBST稀釋到1 μ g/mL的濃度的生物素標(biāo)記抗Hb抗體，在室溫下靜置1小時(shí)。e.用PBST洗凈3次后，以50 μ L/孔分別注入用1 % BSA-PBST稀釋到1 μ g/mL的濃度的HRP-Mr印tavidin(PIERCE公司制)，在室溫下靜置30分鐘。f.用PBST洗凈3次后，分別注入OPD顯色液(50 μ L/孔)，在室溫下靜置10分鐘。g.以50 μ L/孔分別注入0. 75mol/L硫酸來(lái)停止反應(yīng)后，用板檢測(cè)儀測(cè)定492nm的吸光度。h.以各濃度的標(biāo)準(zhǔn)試樣的吸光度為基礎(chǔ)制成校正曲線，利用它來(lái)求出檢測(cè)體的濃度。(5)利用夾心ELISA進(jìn)行的HbAlc量(濃度)的測(cè)定按照與上述(4)相同的方法，代替特異抗體(85201)使用抗HbAlc抗體來(lái)測(cè)定 HbAlc濃度。⑶HbAlc值的計(jì)算以上述(4)和( 求出的HbAO濃度和HbAlc濃度為基礎(chǔ)，通過(guò)下述式求出HbAlc 值(HbAlc的含有率)，HbAlc 含有率(％ ) = (HbAlc 量(濃度)/(HbAlc 量(濃度)+HbA0 量(濃度)))X100。(7)利用HPLC法進(jìn)行的HbAlc值的測(cè)定利用東曹自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀HLC-723G8測(cè)定全血紅蛋白中的HbAlc的含有率。( II )結(jié)果(1)校正曲線使用標(biāo)準(zhǔn)試樣制作HbAO濃度測(cè)定系、以及HbAlc濃度測(cè)定系的校正曲線。如圖8 所示，兩測(cè)定系均確認(rèn)了有各抗原濃度依賴(lài)性的吸光度的上升。(2)與利用HPLC法的測(cè)定值的比較對(duì)利用本發(fā)明抗體并以上述夾心ELISA求出的HbAlc值與以HPLC法求出的HbAlc 值進(jìn)行比較。利用由5名健康人采取的檢測(cè)體以?xún)煞N方法分別求出HbAlc值。其結(jié)果，如表1所示，兩種方法求出的HbAlc值顯示出大致相同的值。[表1]
權(quán)利要求
1.一種抗體，其特征在于，與N末端具有由序列號(hào)1表示的氨基酸序列VHLTPE、且N末端纈氨酸未被修飾的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，與該肽或蛋白質(zhì)的N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，與N末端具有由序列號(hào)1表示的氨基酸序列 VHLTPE、且N末端纈氨酸未被修飾的血紅蛋白反應(yīng)，與該血紅蛋白的N末端纈氨酸被修飾的血紅蛋白不反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中，與血紅蛋白AO反應(yīng)，與血紅蛋白Alc不反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中，與N末端不具有由序列號(hào)1表示的氨基酸序列VHLTPE的血紅蛋白不反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的抗體，其是單克隆抗體。
6.一種權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抗體的制造方法，其特征在于，將N末端具有由序列號(hào)2表示的氨基酸序列VHL、且N末端纈氨酸未被修飾的肽或蛋白質(zhì)用作免疫原。
7.一種試樣中的血紅蛋白Alc含有率的測(cè)定方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抗體測(cè)定試樣中的血紅蛋白AO量，使用抗血紅蛋白Alc抗體測(cè)定所述試樣中的血紅蛋白Alc量，由下式(1)算出試樣中的血紅蛋白Alc含有率(％ )，血紅蛋白Alc含有率(％ )=(血紅蛋白Alc量/(血紅蛋白Alc量+血紅蛋白AO 量))XlOO0
全文摘要
本發(fā)明提供能夠測(cè)定與IFCC參照法相同的HbA1c含有率的通用的方法。本發(fā)明提供一種抗體，該抗體與N末端具有氨基酸序列VHLTPE(序列號(hào)1)、且N末端纈氨酸未被修飾的肽或蛋白質(zhì)反應(yīng)，與該多肽或蛋白質(zhì)的N末端纈氨酸被修飾的肽或蛋白質(zhì)不反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/02GK102245637SQ200980149839
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者宮崎修, 田久保耕平, 藏下俊祐 申請(qǐng)人:積水醫(yī)療株式會(huì)社