雙鏈接頭、其應(yīng)用及構(gòu)建末端配對(duì)dna文庫(kù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提雙鏈接頭、其應(yīng)用及構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法。雙鏈接頭包括接頭A和接頭B，接頭A和接頭B分別包括一個(gè)LoxP序列和將LoxP序列同方向地連接到待環(huán)化的DNA片段兩端的輔助序列。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，基于Cre重組酶/LoxP作用系統(tǒng)特性（當(dāng)兩個(gè)LoxP序列位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，而切除部分的序列將自動(dòng)成環(huán)形狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)DNA長(zhǎng)片段的環(huán)化）設(shè)計(jì)的雙連接頭，通過(guò)T-A克隆的方式高效地連接到用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段的兩端，然后采用Cre重組酶體系能夠高效的使用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段環(huán)化。
【專利說(shuō)明】雙鏈接頭、其應(yīng)用及構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高通量測(cè)序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種雙鏈接頭、其應(yīng)用及構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]全基因組De novo測(cè)序也稱為基因組從頭測(cè)序，它不依賴于已有的序列信息，直接對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。通過(guò)對(duì)某物種全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)研究，可以獲得該物種基因組和重要的功能基因序列信息，解析該物種的進(jìn)化史，闡明該物種生長(zhǎng)發(fā)育、重要性狀的產(chǎn)生以及適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)制。
[0003]二代測(cè)序出現(xiàn)前，利用一代Sanger測(cè)序技術(shù)，若干個(gè)模式生物如:擬南芥、水稻、小鼠和線蟲(chóng)等的全基因組計(jì)劃也得以完成。然而，這種測(cè)序技術(shù)速度慢、通量低、成本太過(guò)昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足科學(xué)家們對(duì)于全面解析眾多具有重要科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值物種的全基因組計(jì)劃的需求。隨著454、IIlumina和SOLid等二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),很多De novo測(cè)序項(xiàng)目由二代測(cè)序技術(shù)完成。在上述三種測(cè)序平臺(tái)中，Illumina測(cè)序兼具高通量、準(zhǔn)確性高、單位數(shù)據(jù)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在短序列拼接組裝軟件開(kāi)發(fā)成功并廣泛應(yīng)用后，成為動(dòng)植物基因組測(cè)序的首選。以李瑞強(qiáng)等為首的技術(shù)團(tuán)隊(duì)針對(duì)Illumina測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了軟件，開(kāi)創(chuàng)了將短多長(zhǎng)用于動(dòng)植物基因組組裝的先河，并利用此技術(shù)完成了多個(gè)重要基因組的組裝，如熊貓基因組、黃瓜基因組、馬鈴薯基因組等。。基于這種二代測(cè)序的基因組De novo測(cè)序和組裝方法，需要獲得該物種梯度插入片段文庫(kù)數(shù)據(jù):180bp、300bp和500bp小片段文庫(kù)數(shù)據(jù)以及2~20K來(lái)源于長(zhǎng)插入片段兩端末端配對(duì)(mate-paired)的基因組文庫(kù)進(jìn)行重疊群(contigMi裝和基因組骨架(scaffold )拼接,DNA長(zhǎng)插入片段的文庫(kù)?；蚪Mmate-paired DNA文庫(kù)測(cè)序是通過(guò)長(zhǎng)插入片段文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序，獲得基因組中較大跨度段兩端的序列。這種從較大跨度兩端所獲得的序列對(duì)較大基因組或者復(fù)雜基因組的組裝和基因組結(jié)構(gòu)變異發(fā)掘具有非常重要的作用。構(gòu)建基因組末端配對(duì)(mate-paired) DNA文庫(kù)的關(guān)鍵在于如何將長(zhǎng)片段(2K, 5K, 10K, 20K)兩端成功實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)環(huán)化,并保證一定的環(huán)化效率。常規(guī)的mate-pairedDNA文庫(kù)的環(huán)化是通過(guò)平末端的分子內(nèi)連接的方式連接實(shí)現(xiàn)的，這種建庫(kù)方法不但環(huán)化效率低，而且測(cè)序后較難有效分辨哪些序列為來(lái)源于連接位點(diǎn)兩端，給后期的基因組的比對(duì)和組裝帶來(lái)困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種雙鏈接頭、其應(yīng)用及構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中Mate-paired DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法不但環(huán)化效率低，而且測(cè)序后較難有效分辨哪些序列來(lái)源于連接位點(diǎn)兩端的技術(shù)問(wèn)題。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種雙鏈接頭。該雙鏈接頭包括接頭A和接頭B，接頭A和接頭B分別包括一個(gè)LoxP序列和將LoxP序列同方向地連接到待環(huán)化的DNA片段兩端的輔助序列。
[0006]進(jìn)一步地，接頭A中的LoxP序列為正向LoxP序列，接頭A中的輔助序列包括位于正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于正向LoxP序列下游的具有突出的3’ T末端，接頭A兩條鏈的5’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且正向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記；接頭B中的LoxP序列為反向LoxP序列，接頭B中的輔助序列包括位于反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于反向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，接頭B兩條鏈的5’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且反向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記。
[0007]進(jìn)一步地，接頭A的喊基序列如圖1所不，接頭B的喊基序列如圖2所不。
[0008]進(jìn)一步地，雙鏈接頭包括:將圖1中除正向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭A同樣功能的核苷酸序列；以及將圖2中除反向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭B同樣功能的核苷酸序列。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種上述雙鏈接頭在構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)中的應(yīng)用。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法。該方法包括用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù) 的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟，用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟包括:將用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段與權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的雙鏈接頭連接，得到連接產(chǎn)物；連接產(chǎn)物中的DNA片段采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。
[0011]進(jìn)一步地，構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法具體包括以下步驟:S1，將基因組DNA用物理方式隨機(jī)破碎，富集用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段；S2，對(duì)步驟SI中富集得到的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后末端加dATP，純化；S3，將步驟S2得到的產(chǎn)物和雙鏈接頭加入連接體系，進(jìn)行連接反應(yīng)；S4，對(duì)步驟S3得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，切取目標(biāo)條帶，回收純化；S5，取步驟S4得到的產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化；S6，對(duì)步驟S5中未環(huán)化的產(chǎn)物進(jìn)行消化；S7，對(duì)步驟S6中的產(chǎn)物進(jìn)行破碎，使DNA片段大小集中在350~650bp之間；S8，利用鏈霉素親和磁珠對(duì)步驟S7的產(chǎn)物中帶有生物素標(biāo)記接頭的序列進(jìn)行富集；S9，對(duì)步驟S8的產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，然后末端加dATP ;S10，對(duì)步驟S9的產(chǎn)物加測(cè)序所用接頭；S11，利用測(cè)序引物對(duì)步驟SlO的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；S12，將步驟Sll的產(chǎn)物電泳分離，切取350~650bp之間的DNA片段，回收、純化，得到末端配對(duì)DNA文庫(kù)。
[0012]進(jìn)一步地，步驟SlO中測(cè)序所用的接頭為illumina測(cè)序所用的接頭，步驟Sll中的測(cè)序引物為illumina提供的P5和P7。
[0013]進(jìn)一步地，步驟S5包括，先將步驟S4得到的產(chǎn)物進(jìn)行定量，然后取200~300ng產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。
[0014]進(jìn)一步地，步驟S9、SlO及Sll均在磁珠上進(jìn)行。
[0015]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，基于Cre重組酶/LoxP作用系統(tǒng)特性(當(dāng)兩個(gè)LoxP序列位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，而切除部分的序列將自動(dòng)成環(huán)形狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)DNA長(zhǎng)片段的環(huán)化)設(shè)計(jì)的雙連接頭，通過(guò)T-A克隆的方式高效地連接到用于構(gòu)建mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段的兩端,然后采用Cre重組酶體系能夠高效的使用于構(gòu)建mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段環(huán)化。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0017]圖1示出了接頭A的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018]圖2示出了接頭B的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0019]圖3示出了實(shí)施例1中基因組破碎目標(biāo)大小的條帶瓊脂糖凝膠電泳圖(切膠回收前后)；
[0020]圖4示出了實(shí)施例1中得到的Mate-paired DNA文庫(kù)用安捷倫公司的2100生物分析儀(Agilent2100bioanalyzer)檢測(cè)2100檢測(cè)插入片段分布圖；以及
[0021]圖5不出了實(shí)施例1中得到的Mate-paired DNA文庫(kù)個(gè)性化分析mate-paired DNA文庫(kù)最終插入片段大小(insert-size)分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0023]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中Mate-paired DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法不但環(huán)化效率低，而且測(cè)序后較難有效分辨哪些序列來(lái)源于連接位點(diǎn)兩端的技術(shù)問(wèn)題，發(fā)明人提出了本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0024]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種雙鏈接頭，該雙鏈接頭包括接頭A和接頭B,接頭A和接頭B分別包括一個(gè)LoxP序列和將LoxP序列同方向地連接到待環(huán)化的DNA片段兩端的輔助序列。
[0025]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，基于Cre重組酶/LoxP作用系統(tǒng)特性(當(dāng)兩個(gè)LoxP序列位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，而切除部分的序列將自動(dòng)成環(huán)形狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)DNA長(zhǎng)片段的環(huán)化)設(shè)計(jì)的雙連接頭，通過(guò)T-A克隆的方式高效地連接到用于構(gòu)建mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段的兩端,然后采用Cre重組酶體系能夠高效的使用于構(gòu)建mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段環(huán)化。
[0026]而且,應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建mate-paired文庫(kù),長(zhǎng)插入片段兩端可通過(guò)加入的接頭序列區(qū)分的，即:接頭序列的兩側(cè)序列一定是長(zhǎng)片段來(lái)源于兩端的序列，解決了測(cè)序后較難有效分辨哪些序列來(lái)源于連接位點(diǎn)兩端的技術(shù)問(wèn)題。
[0027]優(yōu)選的，雙鏈接頭包括接頭A和接頭B，其中，接頭A中的LoxP序列為正向LoxP序列，接頭A中的輔助序列包括位于正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于正向LoxP序列下游的具有突出的3’ T末端，接頭A兩條鏈的5’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且正向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記；接頭B中的LoxP序列為包括反向LoxP序列，接頭B中的輔助序列包括位于反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于反向LoxP序列下游的具有突出的3’ T末端，接頭B兩條鏈的5’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且反向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記。
[0028]因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的雙鏈接頭具有位于正向LoxP序列上游的粘性末端，因此可以采用T-A的高效連接體系。待環(huán)化的DNA片段末端采用加dATP，一定濃度的接頭與目標(biāo)片段可以進(jìn)行高效的連接。同樣，正向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端同樣是便于與DNA片段進(jìn)行T-A連接。接頭A兩條鏈的5’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，保證連接及環(huán)化反應(yīng)的進(jìn)行，且正向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記，以便于環(huán)化后續(xù)的建庫(kù)中，將二次破碎后用連霉親和素磁珠將目標(biāo)片段富集。
[0029]為了防止修飾的生物素基團(tuán)影響接頭末端的連接(空間占位)，盡量靠近粘性末端超出6個(gè)堿基的范圍，因此在第32位的堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記最合適。
[0030]之所以選擇用生物素標(biāo)記，是因?yàn)榉奖憬◣?kù)中采用鏈霉親和素磁珠來(lái)分離建庫(kù)過(guò)程中環(huán)化并二次破碎后的生物素化的核酸片段(該片段以接頭A或B為界限，兩端的序列為來(lái)源長(zhǎng)鏈DNA的兩端)。鏈霉親和素和生物素的結(jié)合力非常的高(Kd=10-15)，因此有非常廣泛的應(yīng)用。該磁珠是均一、超順磁性的直徑為2.8 μ m的磁珠，表面是共價(jià)連接的單層(而非多層)的重組鏈霉親和素，并用BSA封閉。單層的鏈霉親和素可以產(chǎn)生最多的生物的結(jié)合位點(diǎn)，不僅有利于自由生物素的結(jié)合，對(duì)于生物素化配體的捕獲也沒(méi)有問(wèn)題。該磁珠具有快速的液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。正因?yàn)殒溍褂H和素磁珠有獨(dú)特和特定的表面，因此捕獲、分離和下游的操作都非常高效。單層可以保證不會(huì)有鏈霉親和素從磁珠表面掉下來(lái)，同時(shí)不會(huì)有多余的鏈霉親和素吸附，保證了批次間的一致性，確保試驗(yàn)的結(jié)果。
[0031]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，接頭A的堿基序列如圖1所示，接頭B的堿基序列如圖2所示。其中，如圖1所示的堿基序列如下部分組成:正向和反向鏈的5’末端P表示第一個(gè)堿基進(jìn)行了磷酸化修飾；最大的方框中的序列為正向的LoxP序列，包括8對(duì)堿基的方框示出了 LoxP序列中確定方向的8對(duì)堿基，這8對(duì)堿基兩側(cè)的13個(gè)反向重復(fù)的堿基為Cre酶的結(jié)合域，最大的方框中倒數(shù)第3個(gè)堿基T為生物素修飾的堿基；最大的方框外小方框標(biāo)記的堿基T用于與目標(biāo)DNA片段進(jìn)行T-A連接(雙鏈的序列分別為:SEQ ID N01:5’-CGATAACTTCGTATMTGTATGCTATACGAAGTTATACGT-3，,SEQ ID N02:3 ’-CCAGCTATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATATGC-5’)。如圖2所示的堿基序列如下部分組成:正向和反向鏈的5’末端P表示第一個(gè)堿基進(jìn)行了磷酸化修飾；最大的方框中的序列為反向的LoxP序列，包括8對(duì)堿基的方框示出了 LoxP 序列中確定方向的8對(duì)堿基，這8對(duì)堿基兩側(cè)的13個(gè)反向重復(fù)的堿基為Cre酶的結(jié)合域，最大的方框中倒數(shù)第3個(gè)堿基T為生物素修飾的堿基；最大的方框外小方框標(biāo)記的堿基T用于與目標(biāo)DNA片段進(jìn)行T-A連接(雙鏈的序列分別為:SEQ ID N03:5 ’-GCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3’，SEQ ID N04:3 ’-CCACGTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATCG-5，)。
[0032]根據(jù)本發(fā)明另一種的實(shí)施方式，在不改變正/反向LoxP序列下游的具有突出的3’ T，正/反5’末端磷酸化修飾，以及正反向LoxP序列的第31或32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記的原則下所做的修改。該雙鏈接頭包括將圖1中除正向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭A同樣功能的核苷酸序列；以及將圖2中除反向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭B同樣功能的核苷酸序列。
[0033]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種上述雙鏈接頭在構(gòu)建mate-pairedDNA文庫(kù)中的應(yīng)用。
[0034]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的方法。該方法包括用于構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟,用于構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟包括:將用于構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段與權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的雙鏈接頭連接，得到連接產(chǎn)物；連接產(chǎn)物中的DNA片段采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。
[0035]優(yōu)選的,構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的方法具體包括以下步驟:
[0036]SI，將基因組DNA用物理的方式隨機(jī)破碎，富集用于構(gòu)建Mate-paired DNA文庫(kù)的DNA片段；
[0037]S2，對(duì)步驟SI中富集得到的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后末端加dATP，純化；
[0038]S3，將步驟S2得到的產(chǎn)物和上述雙鏈接頭加入連接體系，進(jìn)行連接反應(yīng)；
[0039]S4，對(duì)步驟S3得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，切取目標(biāo)條帶，回收純化；
[0040]S5，取步驟S4得到的產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化；
[0041]S6，對(duì)步驟S5中未環(huán)化的產(chǎn)物進(jìn)行消化，其中未環(huán)化的產(chǎn)物包括了單鏈DNA和雙鏈 DNA ；
[0042]S7，對(duì)步驟S6中的產(chǎn)物進(jìn)行破碎，使DNA片段大小集中在350~650bp之間；
[0043]S8，利用鏈霉素親和磁珠對(duì)步驟S7的產(chǎn)物中帶有生物素標(biāo)記接頭的序列進(jìn)行富集;
[0044]S9，對(duì)步驟S8的產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，然后末端加dATP ；
[0045]S10，對(duì)步驟S9的產(chǎn)物加測(cè)序所用接頭；
[0046]S11，利用測(cè)序引物對(duì)步驟SlO的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0047]S12，將步驟Sll的產(chǎn)物電泳分離，切取350~650bp之間的DNA片段，回收、純化，得到 Mate-paired DNA 文庫(kù)。
[0048]優(yōu)選的，步驟SlO中測(cè)序所用的接頭為illumina測(cè)序所用的接頭，步驟Sll中的測(cè)序引物為illumina提供的P5和P7,使構(gòu)建的文庫(kù)可以在Illumina測(cè)序平臺(tái)上成功測(cè)序。
[0049]優(yōu)選的，步驟S5進(jìn)一步包括，先將步驟S4得到的產(chǎn)物進(jìn)行定量，然后取200~300ng產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。之所以選擇這個(gè)范圍，是因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)既要保障足夠的分子內(nèi)環(huán)化空間(同一個(gè)分子兩端環(huán)化起來(lái))，又要防止分子間的線性連接。
[0050]優(yōu)選的，步驟S9、SlO及Sll均在磁珠上進(jìn)行，使用鏈霉親和素磁珠達(dá)到富集生物標(biāo)記的目標(biāo)DNA片段的目的。
[0051]為了對(duì)得到的Mate-paired DNA文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序，本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步包括對(duì)步驟上述獲得的Mate-paired DNA文庫(kù)進(jìn)行2100檢測(cè)和Q-PCR定量，并采用Illumina公司的Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，生物信息學(xué)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行個(gè)性化評(píng)估，確定各項(xiàng)指標(biāo)。
[0052]在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，上述mate-paired DNA文庫(kù)構(gòu)建的方法,步驟SI中所用基因組DNA為20 μ g任何材料的DNA，包括動(dòng)物、植物、微生物等。DNA破碎儀為Digilab 公司的丨丨ydroShcar? plus DNA Shearing Device。
[0053]步驟S2的補(bǔ)平所用的酶為:T4DNA聚合酶，0.2U/ μ 1，Τ4多聚核苷酸激酶，終濃度
0.5U/ μ I ;加 dATP 所用酶:Klenow(3’ -5，exol，終濃度 0.5U/ μ I ；dATP 終濃度:0.2mM。
·[0054]步驟S3所用的接頭A和B的終濃度:0.1 μ Μ，連接酶=T4DNA快速連接酶(Rapidligase)，連接酶在連接體系中的濃度為30U/μ I。
[0055]步驟S4 產(chǎn)物回收所用 MinElute PCR Purification Kit (QIGEN)試劑盒。
[0056]步驟S5定量采取Qubit定量；環(huán)化體系為:產(chǎn)物300ng，Cre酶(NEB)的終濃度為0.1U/μ I。
[0057]步驟S6單鏈DNA和雙鏈DNA進(jìn)行消化體系為:ΑΤΡ終濃度44mM ;依賴于ATP的線性雙鏈核酸消化酶(Plasmid-Safe ATP-Dependent Dnase)終濃度0.5U/μ I ;單鏈核酸外切酶(Exonuclease I)終濃度 0.6U/μ I。
[0058]步驟S7采用Covaris S220將環(huán)化的DNA分子進(jìn)行破碎。
[0059]步驟S8 中米用 Dynabeads? M_270streptavidin magnetic beads 對(duì)步驟 S7 的產(chǎn)物中帶有生物素標(biāo)記接頭的序列進(jìn)行富集。
[0060]步驟S9末端修復(fù)體系:T4DNA聚合酶終濃度0.2U/ μ I ；Τ4多聚核苷酸激酶終濃度
0.5U/ μ I ；dNTP 終濃度 0.4mM ;加 dATP 體系:Klenow(3’ -5，exol，終濃度 0.5U/ μ I ；dATP終濃度0.2mM。
[0061]步驟SlO中加測(cè)序接頭體系:T4DNA連接酶終濃度60υ/μ I ;接頭(adaptor，含Index)終濃度 0.5 μ M。
[0062]步驟SllPCR 體系:5X Phsion?OC Reaction Buffer (NEB) 1/2 體積；引物 P5, P7終濃度0.5 μ Μ。
[0063]下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0064]下述實(shí)施例中的方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成,所用試劑如無(wú)特別說(shuō)明均為Enzymatics公司的產(chǎn)品,所用水為超純水。
[0065]1、基因組DNA的破碎
[0066]樣品:人標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA樣品，即Promege公司購(gòu)頭的人基因組DNA樣本(HumanGenomic DNA)。
[0067]I)樣品濃度和完整性測(cè)定
[0068]使用Qubit (美國(guó)Invitrogen)對(duì)樣品DNA濃度測(cè)定,進(jìn)行精準(zhǔn)定量,并使用0.8%瓊脂糖凝膠，120v電壓，電泳I小時(shí)，檢測(cè)樣品質(zhì)量，確保人標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA樣品完整無(wú)降解。綜合凝膠電泳與Qubit的結(jié)果，對(duì)樣品的濃度、總量和質(zhì)量是否合格進(jìn)行確定:(合格標(biāo)準(zhǔn))基因組完整、無(wú)降解，電泳結(jié)果基因組DNA主帶應(yīng)在最大條帶40kb以上。若有脈沖場(chǎng)電泳結(jié)果，則DNA主帶應(yīng)在48.5kb以上；無(wú)蛋白質(zhì)、RNA或肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)污染(若樣品含有RNA污染，須按樣品體積加入1/10體積的濃度為10mg/ml的RNase并在37°C處理30min)；樣品濃度達(dá)到150ng/l.! I以上；
[0069]2)如果樣品濃度< IOOng/ μ 1，則需對(duì)樣品進(jìn)行濃縮；
[0070]3)取25 μ g基因組DNA ;37°C溫育30min ;12000rpm離心5min,轉(zhuǎn)移上清到一新的
1.5ml 離心管中；用 QIAGEN EB (Elution buffer)或 TE(Tris-EDTA)緩沖液補(bǔ)足到 200 μ I ；
[0071]4)用液壓剪切裝置(HydroShear device)將樣本破碎在目標(biāo)區(qū)域富集(參數(shù)設(shè)置根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置最佳條件)。
[0072]2、末端修復(fù)和加dATP
[0073]末端修復(fù)體系如表1所示:[0074]表1
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種雙鏈接頭，其特征在于，包括接頭A和接頭B，所述接頭A和所述接頭B分別包括一個(gè)LoxP序列和將所述LoxP序列同方向地連接到待環(huán)化的DNA片段兩端的輔助序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈接頭，其特征在于， 所述接頭A中的所述LoxP序列為正向LoxP序列,所述接頭A中的所述輔助序列包括位于所述正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于所述正向LoxP序列下游的具有突出的3 ’ T末端，所述接頭A兩條鏈的5 ’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且所述正向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記； 所述接頭B中的所述LoxP序列為反向LoxP序列，所述接頭B中的所述輔助序列包括位于所述反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于所述反向LoxP序列下游的具有突出的3 ’ T末端，所述接頭B兩條鏈的5 ’末端第一個(gè)堿基分別進(jìn)行了磷酸化修飾，且所述反向LoxP序列的第32位堿基T進(jìn)行了生物素標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙鏈接頭，其特征在于，所述接頭A的堿基序列如圖1所示，所述接頭B的堿基序列如圖2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙鏈接頭，其特征在于，包括: 將所述圖1中除所述正向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與所述接頭A同樣功能的核苷酸序列；以及 將所述圖2中除所述反向LoxP序列外的堿基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與所述接頭B同樣功能的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙鏈接頭在構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)中的應(yīng)用。
6.—種構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法，包括用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟，其特征在于，所述用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段進(jìn)行環(huán)化的步驟包括: 將用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段與權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙鏈接頭連接，得到連接產(chǎn)物； 所述連接產(chǎn)物中的所述DNA片段采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的方法具體包括以下步驟: SI，將基因組DNA用物理方式隨機(jī)破碎，富集用于構(gòu)建末端配對(duì)DNA文庫(kù)的DNA片段； S2，對(duì)所述步驟SI中富集得到的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后末端加dATP，純化； S3，將所述步驟S2得到的產(chǎn)物和權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙鏈接頭加入連接體系，進(jìn)行連接反應(yīng)； S4，對(duì)所述步驟S3得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，切取目標(biāo)條帶，回收純化； S5，取所述步驟S4得到的產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化； S6，對(duì)所述步驟S5中未環(huán)化的產(chǎn)物進(jìn)行消化； S7，對(duì)所述步驟S6中的產(chǎn)物進(jìn)行破碎，使DNA片段大小集中在350~650bp之間； S8，利用鏈霉素親和磁珠對(duì)所述步驟S7的產(chǎn)物中帶有生物素標(biāo)記接頭的序列進(jìn)行富集; S9，對(duì)所述步驟S8的產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，然后末端加dATP ； S10，對(duì)所述步驟S9的產(chǎn)物加測(cè)序所用接頭；S11，利用測(cè)序引物對(duì)所述步驟SlO的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S12，將所述步驟Sll的產(chǎn)物電泳分離，切取350~650bp之間的DNA片段，回收、純化，得到所述末端配對(duì)DNA文庫(kù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟SlO中測(cè)序所用的接頭為illumina測(cè)序所用的接頭,所述步驟Sll中的所述測(cè)序引物為illumina提供的P5和P7。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟S5進(jìn)一步包括，先將所述步驟S4得到的產(chǎn)物進(jìn)行定量，然后取200~300ng所述產(chǎn)物采用Cre重組酶體系進(jìn)行環(huán)化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟S9、SlO及Sll均在磁珠上進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK103667273SQ201310655625
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】蔣智, 王大偉, 劉運(yùn)超, 曹志生, 劉建, 魏勤, 杜長(zhǎng)詩(shī) 申請(qǐng)人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司