專利名稱：：基于油菜子葉葉綠體轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)體系及獲得轉(zhuǎn)化植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及建立油菜子葉為外植體的葉綠體轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)體系，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法獲得油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明還涉及到利用油菜葉綠體片段為同源重組片段，構(gòu)建油菜葉綠體特異性表達(dá)載體，對(duì)油菜葉綠體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。
背景技術(shù)：
：葉綠體基因工程擁有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括基因的高效表達(dá)、原核基因無(wú)需改造、可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合、外源基因不會(huì)隨著花粉擴(kuò)散等等。而且葉綠體基因工程還克服了傳統(tǒng)核基因工程中易出現(xiàn)的基因失活，基因沉默和位置效應(yīng)等現(xiàn)象，是一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。油菜是世界四大油料作物之一，不僅是食用植物油的最主要來(lái)源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白原，還是目前全球用于解決能源危機(jī)方向之一的生物柴油的理想原料。1988年Boynton等人利用基因槍轉(zhuǎn)化體系，以單細(xì)胞生物萊因衣藻為材料，經(jīng)同源重組，使突變體轉(zhuǎn)化為能進(jìn)行光合作用的正常萊因衣藻，證實(shí)了葉綠體轉(zhuǎn)化是可行的，同時(shí)也是首例成功的葉綠體轉(zhuǎn)化報(bào)道，標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生。1989年I^lMaliga等人首次在高等植物煙草中實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化。自此，葉綠體基因工程迅速發(fā)展起來(lái)(McBride等，(1995)AmplificationofachimericBacillusgeneinchloroplastsleadstoanextraordinarylevelofaninsecticidalproteinintobacco.Biotechnology(NY)13(4):362-5；KhanMS等，(1999)Fluorescentantibioticresistancemarkerfortrackingplastidtransformationinhigherplants.NatBiotechnol,17(9):910-5；HouBK等，(2003)Chloroplasttransformationinoilseedrape.TransgenicRes12(1):111-4；Kumar等，(2004)Stabletransformationofthecottonplastidgenomeandmaternalinheritanceoftransgenes.PlantMolecularBiology56(2):203-216；Kumar等，Generationoffertiletransplastomicsoybean.PlantMolBiol55(4):479-89；Chakrabarti等，(2006).Expressionofthecry9Aa2B.t.geneintobaccochloroplastsconfersresistancetopotatotubermoth.TransgenicRes15(4):481-8.；Liu,等，(2007).Stablechloroplasttransformationincabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)byparticlebombardment.PlantCellRep26(10):1733-44；Liu等，(2008).ExpressionofaBacillusthuringiensistoxin(crylAb)geneincabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)chloroplastsconfershighinsecticidalefficacyagainstPlutellaxylostella.TheorApplGenet117(1):75-88；Soria-Guerra等，(2009).Expressionofamulti-epitopeDPTfusionproteinintransplastomictobaccoplantsretainsbothantigenicityandimmunogenicityofallthreecomponentsofthefunctionaloligomer.Planta229(6):1293-302.；Scotti等’(2009).High-levelexpressionoftheHIV-lPr55(gag)polyproteinintransgenictobaccochloroplasts.Planta229(5)1109-22。其中，侯丙凱等采用的外植體是油菜萌發(fā)4-5天的子葉柄，雖然具有再生率高、再生時(shí)間短的特點(diǎn)，但快速進(jìn)入分化狀態(tài)對(duì)于后續(xù)轉(zhuǎn)化植株的同質(zhì)化是不利的(HouBK,ZhouYH,WanLH,ZhangZL,ShenGF,ChenZH,HuZM(2003)Chloroplasttransformationinoilseedrape.TransgeRes12:111-114)。同時(shí)，在油菜葉綠體轉(zhuǎn)化中，目前突出的問(wèn)題就是轉(zhuǎn)化受外植體類型限制、轉(zhuǎn)化頻率不高等。本發(fā)明從外植體類型和愈傷組織培養(yǎng)入手，通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)期的篩選，通過(guò)構(gòu)建油菜葉綠體特異性表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，建立了一種高效的以油菜子葉為外植體的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種以油菜子葉為外植體進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)體系，通過(guò)基因槍法獲得油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的方法，提高油菜葉綠體轉(zhuǎn)化的效率。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1.引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建1)根據(jù)Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(序列登錄號(hào)NC000932)，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物對(duì)，用該引物對(duì)擴(kuò)增油菜葉綠體基因trnl和trnA作為同源重組片段(見(jiàn)SEQIDNO7-8所示)。所述的引物對(duì)的編號(hào)及DNA序列如下F-trnI:5，-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3，；(序列表SEQIDNO3)R-trnI:5，-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，。(序列表SEQIDNO4)F-trnA:5，-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3，；(序列表SEQIDNO5)R-trnA:5，-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3，。(序列表SEQIDNO6)2)用步驟1)所示的引物對(duì)從待轉(zhuǎn)化的油菜品種華油雜7號(hào)的葉綠體基因組中擴(kuò)增trnl和trnA基因，將PCR產(chǎn)物回收后，片段trnl及克隆載體pBluescript用&icl和NotI進(jìn)行酶切，片段trnA及克隆載體pBluescript用MlI和ApaI進(jìn)行酶切，然后分別進(jìn)行連接得到中間載體p-trnl和p-trnA。從質(zhì)粒p-aadA(購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標(biāo)記基因aadA(見(jiàn)SEQIDNO1所示)及調(diào)控序列(見(jiàn)SEQIDNO2所示)，從質(zhì)粒p-TpsbA(購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA(見(jiàn)SEQIDNO12所示)。將質(zhì)粒p-Prrn((購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)進(jìn)行SmaI和EcoRV酶切，并與aadA基因連接得到中間載體pPrrn-aadA。將中間載體pPrrn_aadA進(jìn)行EcoRV酶切，經(jīng)CIAP去磷酸化酶處理后，與終止子片段TpsbA連接，得到含有完整aadA表達(dá)框架的中間載體p-aadAcassette。將含有左側(cè)同源重組片段trnl的質(zhì)粒進(jìn)行SpeI和SmaI酶切，將中間載體p-aadAcassette進(jìn)行SpeI和SmaI雙酶切，分別回收片段并連接，得到中間載體p-trnl/aadAcassette.將p_trnl/aadAcassette載體用EcoRV酶切，經(jīng)CIAP去磷酸化，將trnA片段T4DNApolymerase切平后連接，得到轉(zhuǎn)化載體pCL318-5。其具體的構(gòu)建路線見(jiàn)附圖2。2.應(yīng)用基因槍方法轉(zhuǎn)化油菜子葉，它包括以下步驟1)外植體的獲得選取飽滿的油菜種子(華油雜7號(hào)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的一個(gè)全國(guó)大面積推廣應(yīng)用的油菜新品種)，先用70%酒精表面消毒種子2min，然后用15%H2O2浸泡種子35min，再用無(wú)菌水沖洗3-5遍，將種子播種于B5基本培養(yǎng)基(不添加其他附加成分)中，25°C，2000Lux,16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)4天。2)基因槍轉(zhuǎn)化及篩選切取4天經(jīng)過(guò)步驟1)培養(yǎng)獲得的油菜植株的子葉，接種至B5-Y預(yù)培養(yǎng)基上，在黑暗條件下預(yù)處理4h，然后進(jìn)行基因槍轟擊，每皿轟擊2次。轟擊后將其轉(zhuǎn)移至B5基本培養(yǎng)基上(不添加其他附加成分)，25°C，在黑暗條件下恢復(fù)培養(yǎng)16h。3)愈傷組織的誘導(dǎo)及篩選恢復(fù)培養(yǎng)后將子葉切成3mmX3mm大小的塊狀，轉(zhuǎn)入附加10mg/l壯觀霉素愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基B5D-5S，25°C，于2000Lux下，16h光照/黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，直至篩選出綠色抗性愈傷組織。在此培養(yǎng)期間每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次。4)誘導(dǎo)愈傷組織的分化及篩選將上述綠色愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素BF3S分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選，于25°C下，光照強(qiáng)度為2000LuX，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠芽。5)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的再生植株的生根及移栽將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的再生油菜苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基B5-N上，1周左右長(zhǎng)出新根。將再生苗移栽到土中，放在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，1光照/黑暗條件下培養(yǎng)。在本發(fā)明中，下列培養(yǎng)基是至關(guān)重要的，各類培養(yǎng)基的配方及編號(hào)如下1.發(fā)苗培養(yǎng)基(編號(hào)B5)2.預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號(hào)B5-Y)3.愈傷組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基(編號(hào)B5D_5S)4.分化及篩選培養(yǎng)基(編號(hào)BF_3S)5.生根培養(yǎng)基(編號(hào)B5-N)上述培養(yǎng)基滅菌采用常規(guī)高壓蒸汽(121°C)滅菌20min，其中B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分和AgNO3采用報(bào)道的抽濾方法滅菌，所述的有機(jī)成分和AgNO3在培養(yǎng)基溫度降至65°C左右時(shí)加入。6)PCR檢測(cè)候選轉(zhuǎn)基因植株，具體方法如下將步驟幻中抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，利用PCR分子鑒定技術(shù)(具體程序參見(jiàn)梁國(guó)棟主編，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科學(xué)出版社，2001)，根據(jù)報(bào)告基因(aadA，見(jiàn)序列表SEQIDNO1所示)的序列設(shè)計(jì)引物5’端引物5’-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3’(見(jiàn)序列表SEQIDNO9)；3，端引物5，-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3，(見(jiàn)序列表SEQIDNO10)。PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)95°C變性5min，然后依次在95°C變性lmin，64°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)30次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外熒光下觀察結(jié)果并照相。7)PCR陽(yáng)性株系的Southern雜交檢測(cè)提取步驟6)中經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的植物總DNA，取10μg轉(zhuǎn)基因油菜植株DNA，根據(jù)樣品數(shù)配制酶切反應(yīng)混合液每個(gè)反應(yīng)體系含IOXBuffer5μL，限制性內(nèi)切酶EcoRI2μL含0011)，水沘“1^，混勻，分裝至0.51^的離心管中，每管；35“1，加入總0嫩15yL，酶切體系為50μL，小心彈勻，瞬時(shí)離心，置于37°C水浴中過(guò)夜(12-18h)，第二天上午取3μL電泳檢測(cè)酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚藍(lán)緩沖液終止酶切，置于4°C，直至電泳。用0.8%瓊脂糖(購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品)凝膠電泳，0.8-1.OV/cm電泳18_24h。將膠切成膜一樣大小和形狀；用0.2mol/LHCl變性lOmin，置于轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，用0.4mol/LNaOH和lmol/LNaCl作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移約Mh。轉(zhuǎn)好的膜用2XSSC漂洗兩次，各5min；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗(yàn)指南(第三版M2002，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。8)Southern雜交陽(yáng)性株系的Northern雜交檢測(cè)提取步驟7)中經(jīng)Southern雜交陽(yáng)性株系的總RNA，利用Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，液氮研磨后每管分約0.Ig,加入Iml的Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司)，搖勻室溫靜置IOmin；加入200μ1的三氯甲烷后立即劇烈搖晃30s，室溫靜置5min；4°C,12000r/m離心IOmin；取上清溶液轉(zhuǎn)移置新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C，12000r/m離心IOmin；棄上清，沉淀用70%乙醇溶液洗一次，4°C，12000r/m離心5min收集沉淀；室溫干燥后溶于20μ1的11000稀釋的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的總RNA首先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)其完整性，然后用紫外分光光度法測(cè)定RNA的得率(0擬60/0擬80，Ratio,R)，R值介于1.8-2.2之間時(shí)，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量良好。利用DNA酶1(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中的基因組DNA。反應(yīng)體系如下10倍的DNA酶I緩沖液5μ1，DNA酶I2μ1，RNA酶抑制劑(40U/ml)1μ1，總RNA20μ1(約40μg)補(bǔ)水至50μ1。37°C反應(yīng)30min后，加入50μ1的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25241)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入等量的氯仿/異戊醇(體積比為M1)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入1/10體積的3M醋酸鈉(ρΗ5·2)和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇，_20°C放置60min,12000r/m離心IOmin回收沉淀，每管加入Iml70%的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m離心IOmin收集沉淀，室溫干燥后用20μ1的DEPC水溶解并進(jìn)行凝膠電泳確認(rèn)是否除去基因組DNA。每個(gè)樣品取20μgRNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，具體過(guò)程如下配制切甲醛凝膠電泳緩沖液將20.6g3-(N-瑪琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50nmol/L乙酸鈉溶液。用2mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0，加IOml經(jīng)用DEPC處理的0.5mol/LEDTA(pH8.0)，再加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，避光保存于室溫。制備凝膠將1.28g瓊脂糖溶于水，冷卻至60°C，加入切甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為Ix和2.2mol/L，在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30分鐘使凝膠凝固。在一滅菌的微量離心管中混合樣品RNA(約20μg)4.5μ1，5χ甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μ1，甲醛3.5μ1，甲酰胺10.0μ1，于65°C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內(nèi)所有液體集中于管底。然后加入2μ1滅菌切經(jīng)DEPC處理過(guò)的甲醛加樣緩沖液(50%甘油，lmmol/LEDTApH8.0，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF)。加樣前將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，然后將樣品加至凝膠加樣孔L。將膠浸入Ix甲醛凝膠電泳緩沖液中，4V/cm電壓進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移出點(diǎn)樣孔約8cm時(shí)停止電泳將膠切成膜一樣大小和形狀，先用DEPC處理過(guò)的水淋洗膠3次以去除甲醛，然后將膠在0.05mol/LNaOH中浸泡20min，用DEPC水沖洗后將膠置于轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，20xSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將RNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移約Mh。轉(zhuǎn)好的膜用2乂55(漂洗兩次，各5!^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗(yàn)指南(第三版M2002，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以油菜子葉為外植體，在參考已發(fā)表的油菜葉綠體轉(zhuǎn)化及其他高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化的方法，并結(jié)合申請(qǐng)人已得到的油菜壯觀霉素耐受性研究結(jié)果的基礎(chǔ)上獲得。目前葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化因受到外植體類型、篩選效率及重組體系的束縛，能應(yīng)用到的高等植物種類還不是很多，在油菜中僅僅有使用下胚軸進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的報(bào)道。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，打破了油菜葉綠體轉(zhuǎn)化外植體類型的限制，利用油菜子葉為外植體，創(chuàng)造一種油菜子葉葉綠體轉(zhuǎn)化的新方法。根據(jù)擬南芥葉綠體的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到油菜葉綠體中的部分基因序列作為同源重組片段構(gòu)建特異性轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)基因槍法得到油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR、S0uthern雜交和Nothern雜交，證明外源基因不僅整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)，而且獲得表達(dá)。序列表SEQIDNO1是人工合成的aadA基因序列；序列表SEQIDNO:2是人工合成的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列；序列表SEQIDNO:3是引物F-trnI的序列；序列表SEQIDNO:4是引物R-trnI的序列；序列表SEQIDNO:5是引物F-trnA的序列；序列表SEQIDNO6是引物R-trnA的序列；序列表SEQIDNO7是油菜葉綠體基因trnl的序列；序列表SEQIDNO8是油菜葉綠體基因trnA的序列；序列表SEQIDNO9和10是鑒定aadA基因的引物對(duì)序列序列表SEQIDNO11是人工合成的啟動(dòng)子ftTn序列；序列表SEQIDNO12是人工合成的終止子子TpsbA序列。圖1，是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2，是本發(fā)明中油菜葉綠體特異性表達(dá)載體pCL318-5物理構(gòu)建圖譜，圖2續(xù)1是載體構(gòu)建的第一部分。圖3，是本發(fā)明中利用基因槍法轉(zhuǎn)化得到的油菜葉綠體轉(zhuǎn)化植株，均能正常抽苔、開(kāi)花和結(jié)果。圖3A是本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因油菜植株，圖:3B是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株正常開(kāi)花和結(jié)莢。圖4，是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)結(jié)果，圖中標(biāo)注M為分子量標(biāo)記，1為空白對(duì)照，2為非轉(zhuǎn)基因油菜植株對(duì)照，3-7為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因油菜。圖5，是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交檢測(cè)結(jié)果，圖中標(biāo)注CK為非轉(zhuǎn)基因油菜植株對(duì)照，1-5為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因油菜。圖6，是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植株的Northern雜交檢測(cè)結(jié)果，圖中標(biāo)注CK為非轉(zhuǎn)基因油菜植株對(duì)照，1-5為轉(zhuǎn)基因油菜。圖7，是本發(fā)明中建立適合油菜葉綠體轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)體系中6種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和3種分化培養(yǎng)基之間的差異比較。圖7A是子葉在6種不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織的差異；圖7B是培養(yǎng)4周后在6種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上仍能保持愈傷狀態(tài)的頻率；圖7C是愈傷組織在3種不同分化培養(yǎng)基上的分化率差異。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1以油菜子葉為外植體的葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的培育方法1.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建(1)同源重組片段trnl/trnA的克隆參照Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(序列登錄號(hào)NC000932)，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物對(duì)，用該引物對(duì)擴(kuò)增油菜葉綠體基因trnl和trnA作為同源重組片段。所述的引物對(duì)的編號(hào)及DNA序列如下F-trnI:5，-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3，；(序列表SEQIDNO3)R-trnI:5，-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，。(序列表SEQIDNO4)F-trnA:5，-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3，；(序列表SEQIDNO5)R-trnA:5，-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3，。(序列表SEQIDNO6)反應(yīng)體系為dNTP(2mM)2μ1IOX緩沖液2·5μ1(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)MgCl21.5μ1Primerl(IOmM)0.5μ1Primer2(IOmM)0.5μ1Taq(5U/L)0.5μ1模板DNA(50ng/μ1)1μ1去離子水17.5μ1總體積25μ1PCR循環(huán)反應(yīng)參婁'1:95°C變性4min，然后依次在95°C變性lmin，58°C復(fù)性lmin,72°C延伸lmin，循環(huán)35次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外熒光下觀察結(jié)果并照相。將剩余的PCR回收，片段trnl及克隆載體pBluescript用McI和NotI進(jìn)行酶切，片段trnA及克隆載體pBluescript用&ill和ApaI進(jìn)行酶切，然后分別進(jìn)行連接得到中間載體p_trnl和p-trnA。(2)aad_cassette表達(dá)框架的構(gòu)建從質(zhì)粒p-aadA(購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標(biāo)記基因aadA及調(diào)控序列，從質(zhì)粒p-TpsbA(購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)中分別以SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA。將質(zhì)粒p-Prrn(購(gòu)自金思特科技(南京)有限公司)進(jìn)行SmaI和EcoRV酶切，并與aadA基因連接得到中間載體pPrrn_aadA。將中間載體pPrrn-aadA進(jìn)行EcoRV酶切，經(jīng)CIAP去磷酸化酶處理后，與終止子片段TpsbA連接，得到含有完整aadA表達(dá)框架的中間載體p-aadAcassette。(3)轉(zhuǎn)化載體pCL318-5的構(gòu)建將含有左側(cè)同源重組片段trnl的質(zhì)粒進(jìn)行SpeI和SmaI酶切，中間載體p-aadAcassette進(jìn)行SpeI和SmaI雙酶切，分別回收片段并連接，得到中間載體p-trnl/aadAcassette。將p-trnl/aadAcassette載體進(jìn)行EcoRV酶切，經(jīng)CIAP去磷酸化，將trnA片段T4DNApolymerase切平后連接，得到轉(zhuǎn)化載體pCL318_5。2.基因槍法介導(dǎo)的油菜子葉的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化(1)轉(zhuǎn)化外植體的獲得選取飽滿的油菜種子(華油雜7號(hào)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的一個(gè)全國(guó)大面積推廣應(yīng)用的油菜新品種)，)，先用70%酒精表面消毒種子2min，然后用15%H2O2浸泡種子35min，再用無(wú)菌水沖洗3-5遍，將種子播種于B5基本培養(yǎng)基(不添加其他附加成分)中，25°C，2000Lux,16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)4天。(2)基因槍轉(zhuǎn)化切取生長(zhǎng)4天的油菜植株的子葉，接種至B5-Y預(yù)培養(yǎng)基上，在黑暗條件下預(yù)處理4h，然后進(jìn)行基因槍轟擊，每皿轟擊2次。轟擊后將其轉(zhuǎn)移至B5基本培養(yǎng)基上(不添加其他附加成分)，25°C，黑暗條件下恢復(fù)培養(yǎng)16h。(3)愈傷誘導(dǎo)及篩選恢復(fù)培養(yǎng)后將子葉切成3mmX3mm大小的塊狀，轉(zhuǎn)入附加10mg/l壯觀霉素愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基B5D-5S，25°C，于2000Lux下，16h光照/黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，直至篩選出綠色抗性愈傷組織。在此培養(yǎng)期間每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次。(4)愈傷組織的分化及篩選將上述綠色愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素BF3S分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選，于25°C下，光照強(qiáng)度為2000LuX，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠芽。(5)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的再生植株生根及移栽將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的再生油菜苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基B5-N上，1周左右長(zhǎng)出新根。將再生苗移栽到土中，放在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，1光照/黑暗條件下培養(yǎng)至開(kāi)花結(jié)實(shí)(見(jiàn)附圖3)。在以上步驟中，培養(yǎng)基是獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵所在，相關(guān)培養(yǎng)基的配方如下1.發(fā)苗培養(yǎng)基(編號(hào)B5)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMo04·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，VB1lmg/L,VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6；2.預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(編號(hào)B5-Y)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2O10mg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，VB1lmg/L，VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L,瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6；3.愈傷組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基(編號(hào)是否為B5)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，2，4_D0.6mg/L，KT0.ang/L，壯觀霉素10mg/L，AgNOJmg/1，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)ρΗ5·6；4.分化及篩選培養(yǎng)基(編號(hào)BF_3S)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，6_BAlmg/L,KTlmg/L,NAA0.5mg/L,壯觀霉素20mg/L，AgNOJmg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6；5.生根培養(yǎng)基(編號(hào):B5-N)KN032500mg/L,(NH4)2S04134mg/L,MgSO4·7H20250mg/L,CaCl2·2H20150mg/L,NaH2PO4·H2O150mg/L,EDTA-Na鐵鹽43mg/L,MnSO4·H2OlOmg/L,H3B033mg/L,ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2H200.25mg/L,CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨10mg/L，NAA0.lmg/L，壯觀霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6。3.候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)利用PCR分子鑒定技術(shù)(具體程序參見(jiàn)梁國(guó)棟主編，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科學(xué)出版社，2001)，根據(jù)報(bào)告基因(aadA，見(jiàn)序列表SEQIDNO!)的序列設(shè)計(jì)引物，序列如下5，端引物:5，-ATGGCAGAAGCGGTGATCGC-3，(見(jiàn)序列表SEQIDNO9)3，端引物:5，-CTAGACATTATTTGCCGACTAC-3，(見(jiàn)序列表SEQIDNO10)。反應(yīng)體系為dNTP(2mM)2μ1IOX緩沖液(Buffer)2.5μ1(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)MgCl21.5μ1Primerl(IOmM)0.5μ1Primer2(IOmM)0.5μ1Taq(5U/L)0.5μ1模板DNA(50ng/y1)1μ1去離子水17.5μ1總體積25μ1PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)95°C變性5min，然后依次在95°C變性lmin，64°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次后在72°C保溫lOmin，最后4°C保存。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外熒光下觀察結(jié)果并照相。發(fā)明效果如附圖4。4.轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測(cè)取經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的植物總DNA約10μg，根據(jù)樣品數(shù)配制酶切反應(yīng)混合液每個(gè)反應(yīng)體系含10XBuffer5μL，限制性內(nèi)切酶EcoRI2μ1^含QOu)，水觀μL，混勻，分裝至0.5mL的離心管中，每管35μ1，加入總DNA15μL，酶切體系為50μL，小心彈勻，瞬時(shí)離心，置于37°C水浴中過(guò)夜(12-1)，第二天上午取3μL電泳檢測(cè)酶切效果，酶切充分后加入5μL溴酚藍(lán)緩沖液終止酶切，置于4°C，直至電泳。用0.8%瓊脂糖(購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品)凝膠電泳，0.8-1.OV/cm電泳18_24h。將膠切成膜一樣大小和形狀；用0.2mol/LHCl變性lOmin，置于轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，用0.4mol/LNaOH和lmol/LNaCl作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移約Mh。轉(zhuǎn)好的膜用2乂33(漂洗兩次，各51^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗(yàn)指南(第三版M2002，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。發(fā)明效果見(jiàn)附圖5。5.轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交檢測(cè)提取經(jīng)Southern雜交陽(yáng)性株系的總RNA，利用Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司)提取總RNA，液氮研磨后每管分約0.lg，加入Iml的Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，搖勻室溫靜置IOmin；加入200μ1的三氯甲烷后立即劇烈搖晃30s，室溫靜置5min；4°C，12000r/m離心IOmin；取上清溶液轉(zhuǎn)移置新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C，12000r/m離心IOmin；棄上清，沉淀用70%乙醇溶液洗一次，4°C，12000r/m離心5min收集沉淀；室溫干燥后溶于20μ1的11000稀釋的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的總RNA首先用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)其完整性，然后用紫外分光光度法測(cè)定RNA的得率(OD26tlA)D28tl，Ratio,R)，R值介于1.8-2.2之間時(shí)，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量良好。利用DNA酶1(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中的基因組DNA。反應(yīng)體系如下10倍的DNA酶I緩沖液5μ1(購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司)，DNA酶I2μ1，RNA酶抑制劑(40U/ml)1μ1，總RNA20μ1(約40μg)補(bǔ)水至50μ1。37。C反應(yīng)30min后，加入50μ1的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25241)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加入等量的氯仿/異戊醇(體積比為M1)，充分混勻，12000r/m離心lOmin，取上層移至新的離心管中，加Λ1/10體積的3Μ醋酸鈉(ρΗ5·2)和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇，_20°C放置60min,12000"m離心IOmin回收沉淀，每管加入Iml70%的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m離心IOmin收集沉淀，室溫干燥后用20μ1的DEPC水溶解并進(jìn)行凝膠電泳確認(rèn)是否除去基因組DNA。每個(gè)樣品取20μgRNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，具體過(guò)程如下配制切甲醛凝膠電泳緩沖液將20.6g3-(N-瑪琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50nmol/L乙酸鈉溶液。用2mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0，加IOml經(jīng)用DEPC處理的0.5mol/LEDTA(pH8.0)，再加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，避光保存于室溫。制備凝膠將1.28g瓊脂糖溶于水，冷卻至60°C，加入切甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為Ix和2.2mol/L，在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30分鐘使凝膠凝固。在一滅菌的微量離心管中混合樣品RNA(約20yg)4.5yl，5χ甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μ1，甲醛3.5μ1，甲酰胺10.0μ1，于65°C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內(nèi)所有液體集中于管底。然后加入2μ1滅菌切經(jīng)DEPC處理過(guò)的甲醛加樣緩沖液(50%甘油，lmmol/LEDTApH8.0，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF)。加樣前將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，然后將樣品加至凝膠加樣孔。將膠浸入Ix甲醛凝膠電泳緩沖液中，4V/cm電壓進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移出點(diǎn)樣孔約8cm時(shí)停止電泳將膠切成膜一樣大小和形狀，先用DEPC處理過(guò)的水淋洗膠3次以去除甲醛，然后將膠在0.05mol/LNaOH中浸泡20min，用DEPC水沖洗后將膠置于轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，20xSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將RNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移約Mh。轉(zhuǎn)好的膜用2\55(漂洗兩次，各5!^11；用濾紙墊夾，80°C烘膜池；取出冷卻后用保鮮膜包好，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2P探針制備、分子雜交、洗膜、壓片的操作按薩姆布魯克、拉塞爾編著的分子克隆試驗(yàn)指南(第三版M2002，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。發(fā)明效果見(jiàn)附圖6。實(shí)施例2對(duì)比實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1)不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)甘藍(lán)型油菜子葉誘導(dǎo)愈傷組織的差異在本實(shí)施例中，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了6種誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基(如后所述)，以三個(gè)油菜品種華油雜6號(hào)、華油雜7號(hào)、華油雜9號(hào)(該三個(gè)品種均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)選育，在中國(guó)大面積推廣應(yīng)用的油菜新品種)的子葉為外植體，期望能夠獲得一種能夠長(zhǎng)期保持愈傷組織脫分化狀態(tài)，并能得到較高質(zhì)量愈傷組織的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本發(fā)明設(shè)計(jì)的6種培養(yǎng)基的配方及編號(hào)如下B5D-1:B5基本培養(yǎng)基+NAA5mg/l+6_BA5mg/l；B5D-2:B5基本培養(yǎng)基+0.4%MES；B5D-3:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.2mg/l；B5D-4:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.4mg/l；B5D-5:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.6mg/l+KT0.2mg/l；B5D-6:B5基本培養(yǎng)基+2，4_D0.8mg/l+KT0.3mg/l；上述培養(yǎng)基中的激素英文縮寫(xiě)的定義為6-BA:6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤；KTKinetin，激動(dòng)素；NAA=Napthaleneaceticacid,萘乙酸；2，4_D:2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸；MES:2_(N-嗎啉)乙磺酸MES。上述培養(yǎng)基均添加30g/l蔗糖和;3mg/lAgNO3,制備時(shí)補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6，培養(yǎng)基用121°C高壓蒸汽滅菌20min。試驗(yàn)表明，在上述培養(yǎng)基中，編號(hào)為B5D-5培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織出愈率較高，4周后大部分愈傷組織仍保持較好的脫分化狀態(tài)，致密且呈淡綠色，有利于芽苗的分化。而且在4周后，仍有80%以上的愈傷組織保持脫分化狀態(tài)，發(fā)明效果如圖6A-e，6B。2)不同分化培養(yǎng)基對(duì)芽苗分化的影響將上述在B5D-5培養(yǎng)基上，25°C，2000Lux，16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)1個(gè)月的愈傷組織分別接種到下列分化培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計(jì)分化率，期望獲得能使長(zhǎng)期保存的愈傷組織具有較高分化能力，較低玻璃化和畸形再生植株頻率的分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基的配方和編號(hào)BFl:B5基本培養(yǎng)基+6-BA3mg/L+ZTlmg/1；BF2:B5基本培養(yǎng)基+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/l；BF3:B5基本培養(yǎng)基+6-BAlmg/L+KTlmg/1+0.5mg/lNAA；上述培養(yǎng)基均添加30g/l蔗糖和;3mg/lAgNO3,制備時(shí)補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.6，培養(yǎng)基用121°C高壓蒸汽滅菌20min。根據(jù)培養(yǎng)30天的油菜葉綠體愈傷組織的分化率統(tǒng)計(jì)，編號(hào)為BF3的分化培養(yǎng)基能夠使長(zhǎng)期處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織快速進(jìn)入分化階段，10-15d左右在油菜葉綠體愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，30d左右分化出綠芽，未發(fā)現(xiàn)有玻璃化和形態(tài)畸形的再生芽。正常再生綠芽經(jīng)生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)，通過(guò)壯苗后移栽至溫室管理，所有再生植株均能正常抽苔、開(kāi)花和結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)畸形苗(見(jiàn)圖6C)。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>基于油菜子葉葉綠體轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)體系及獲得轉(zhuǎn)化植株的方法<130><141>2010-01-27<160>12<170>PatentInversion3.1<210>1<211>792<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1)..(792)<223><400>1atggcagaaggagcgccatcggcctgaagcacaacgcggcgagattctcctatccagctaatcttcgagccatagcgttggatctatttgggcgatgagccggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatc60tcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggc120cacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaa180gagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagc240gcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgt300agcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggt360cagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaa420ccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcttgaacag480aggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggct540gaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggc600aaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataa<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>RBS<222>(1)..(36)<223><400>2aataattttgtttaactttaagaaggagatataccc36<210>3<211>28<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>3atagagctctggaaccctgaacagactg28<210>4<211>29<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(29)<223><400>4atagcggccgcatttgaaccagagacctc29<210>5<211>28<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220>660720780792<221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>5atagtcgacggggatatagctcagttgg28<210>6<211>28<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>primer_bind<222>(1)..(28)<223><400>6taagggccccggtactacttcgctatcg28<210>7<211>1493<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene<222>(1)..(1493)<223><400>7tggaaccctgaacagactgccggtgataagccggaggaaggtgaggatgacgtcaagtca60tcatgccccttatgccctgggcgacacacgtgctacaatggccgggacaaagggtcgcga120tcccgcgagggtgagctaactccaaaaacccgtcctcagttcggattgcaggctgcaact180cgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgccggtcagccatacggcggtgaattcgt240tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacactatgggagctggccatgcccgaagtcgtt300accttaaccgcaaggaggggggtgccgaaggcagggctagtgactggagtgaagtcgtaa360caaggtagccgtactggaaggtgcggctggatcacctccttttcagggagagctaatgct420tcttgggtatttaggtttgacacagcttcaaacccaaagcccatgagcttattatcctag480gtcggaacaagttgataggatccccttttacgcccccatgtccctctcgtgtggcggcag540gggggcgtaaaaaggaaagagagggatggggtttctctcgcttttggcttggcatagcgg600gcccccagcaggaggcccgcacgacgggctattagctcagtggtagagcgcgcccctgat660aattgcgtcgttgtgcctgggctgtgagggctctcagccacatggatagttcaatgtgct720catcagcgcctgaccctgagatgtggatcatccaaggcacattagcatggcgtactcctc780ctgttcgaaccggggtttgaaaccaaacttctcctcaggaggatagatggggcgattcac840gtgagatccaatgtagatccaactttctattcactcgtgggatccgggcggtccggaggg900gaccaccacggctcctctcttctcgagaatccatacatcccttatcagtgtatggacagc960tatctctcgagcgcaggtttaggttcggcctcaatgggaaaataaaatggagcacctaac1020aacgtatcttcacagaccaagaactacgagatcacccctttcattctggggtgacggagg1080gatcgtaccgttcgagcctttttttcatgcttttcccaggggtctggagaaagctgcaatl140caataggattttcctaatcctcccttcccgaaaggaagaacgtgaaattctttttccttt1200ccgcctcgaaatgggagcaggtttgaaaaaggatcttagagtgtctagggttaggccagt1260agggtctcttaacgccctcttttttcttctcatcgaagttatttcacaaatacttcctat1320ggtaaggaagagggggggaacaagcacacttggagagcgcagtacaacggagagttgtat1380gctgcgttcgggaaggatgaatcgctcccgaaaaggaatctattgattctctcccaattg1440gttggaccataggtgcgatgatttacttcacgggcgaggtctctggttcaBat1493<210>8<211>1490<2l2>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><22l>gene權(quán)利要求1.一種利用基因槍方法培育油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因的方法，其步驟包括培養(yǎng)基制備，引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化，其特征在于，以油菜子葉為外植體，通過(guò)基因槍法將油菜葉綠體特異性表達(dá)載體導(dǎo)入受體油菜中，通過(guò)篩選及鑒定，得到葉綠體轉(zhuǎn)化植株，其步驟如下1)引物設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建根據(jù)Genebank公布的擬南芥葉綠體基因組序列(登錄號(hào)為NC00093》，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物對(duì)F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA，以油菜葉綠體基因組為模板，用所述的引物對(duì)F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA擴(kuò)增trnl和trnA基因片段，測(cè)序后作為同源重組片段，從質(zhì)粒p-aadA中分別用SmaI和EcoRV酶切獲得篩選標(biāo)記基因aadA，其序列如SEQIDNO:X所示，調(diào)控序列，其序列如SEQIDNO:Y所示，從質(zhì)粒p-Prrn中分別用SpeI和BioI酶切獲得啟動(dòng)子Prrn，從質(zhì)粒p-TpsbA中分別用SmaI和EcoRV獲得終止子TpsbA，將所述的同源重組片段、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因和終止子連接到載體pBluescript上，構(gòu)建得到油菜葉綠體特異性表達(dá)載體pCL318_5；所述的特異引物對(duì)F-trnI、R-trnI、F-trnA禾口R-trnA的DNA序列如下所示F-trnI:5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’，R-trnI:5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3，；F-trnA:5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’，R-trnA5'-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’；2)應(yīng)用基因槍方法轉(zhuǎn)化油菜子葉，它包括以下步驟1)外植體的獲得取飽滿油菜種子經(jīng)表面消毒后接種至B5基本培養(yǎng)基上，在25°C，2000Lux,16h光照/黑暗條件下生長(zhǎng)4d，然后將子葉切下，黑暗條件下高滲？預(yù)處理4h；2)基因槍轉(zhuǎn)化及篩選將步驟1)的油菜子葉，進(jìn)行基因槍轟擊，每皿轟擊2次，轟擊后在黑暗條件下用B5培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)16h；3)愈傷組織的誘導(dǎo)及篩選將恢復(fù)培養(yǎng)后的油菜子葉切成3mmX3mm的塊狀，轉(zhuǎn)入附加10mg/l壯觀霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基B5D-5S上，于25°C，2000Lux,16h光照/黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，共繼代培養(yǎng)4次；4)愈傷組織的分化誘導(dǎo)將步驟3)的綠色抗性愈傷組織接種到附加20mg/l壯觀霉素的分化培養(yǎng)基BF3S上，于25°C下，2000Lux,16h光照/黑暗條件下培養(yǎng)至分化出綠色小芽，得到候選轉(zhuǎn)基因苗；5)再生芽的生根誘導(dǎo)將步驟4)的得到的材料，在生根培養(yǎng)基B5-N上和壯苗培養(yǎng)基B5上培養(yǎng)，篩選獲得候選轉(zhuǎn)基因植株；6)采用PCR、Southern方法檢測(cè)PCR陽(yáng)性株系，獲得轉(zhuǎn)基因植株。其中所述的培養(yǎng)基成分如下所述發(fā)苗培養(yǎng)基B5:KNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L,VB6lmg/L,半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L,補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.5；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基B5-YKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L,瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.5；愈傷組織誘導(dǎo)和篩選培養(yǎng)基B5D-5SKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L,Vbilmg/L,VB6lmg/L,半胱氨10mg/L，2，4_D0.6mg/L，KT0.ang/L，壯觀霉素10mg/L，AgNO3:3mg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)ρΗ5·5；分化和篩選培養(yǎng)基BF-3SKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4'2H200.25mg/L，CuSO4·5H200.025mg/L,KI0.75mg/L，CoCl2·6H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L，Vb6lmg/L，半胱氨10mg/L，6-BAlmg/L,KTlmg/L,NAA0.5mg/L,壯觀霉素20mg/L，AgNO33mg/l，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.5；生根培養(yǎng)基B5-NKNO32500mg/L,(NH4)2SO4134mg/L,MgSO4'7H20250mg/L,CaCl2'2H20150mg/L,NaH2PO4‘H2O150mg/L，EDTA-Na鐵鹽4!3mg/L，MnSO4·H2OlOmg/L,H3BO33mg/L，ZnSO4·7H202mg/L,NaMoO4·2Η200.25mg/L,CuSO4‘5H200.025mg/L,KI0.75mg/L,CoC126H200.025mg/L，肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，Vbilmg/L，Vb6lmg/L，半胱氨10mg/L，NAA0.lmg/L，壯觀霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，瓊脂7g/L，補(bǔ)充水分至1L，滅菌前調(diào)pH至5.5。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟6)中Southern雜交所述的步驟如下提取經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的油菜葉片的總DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切，將酶切過(guò)的DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，并用32P制備探針，對(duì)轉(zhuǎn)好的膜進(jìn)行分子雜交、洗膜、壓片，篩選陽(yáng)性植株。3.權(quán)利要求1和2所述的方法在培育油菜轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因的方法。本發(fā)明建立了適合以油菜子葉為外植體的葉綠體轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)體系，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法獲得油菜葉綠體轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還公開(kāi)了利用油菜葉綠體片段為同源重組片段，構(gòu)建油菜葉綠體特異性表達(dá)載體，對(duì)油菜葉綠體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明為甘藍(lán)型油菜的轉(zhuǎn)基因提供了一種新途徑。文檔編號(hào)C12N15/82GK102051376SQ201010103458公開(kāi)日2011年5月11日申請(qǐng)日期2010年1月27日優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日發(fā)明者傅庭棟,廖玉才,李和平,涂金星,瞿波,程琳,黃濤申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)