專利名稱：利用染色體加倍改良萬壽菊基因型的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于花卉育種技術(shù)領域，具體涉及一種利用染色體加倍改良萬壽菊基因型的方法。

背景技術(shù)：
萬壽菊屬植物共有56種，其中有27種為一年生植物。目前廣泛應用的萬壽菊屬植物主要有3種孔雀草(Tagetespatula L.)、萬壽菊(Tagetes erecta L.)和三倍體萬壽菊(Tagetes erecta×Tagetespatula)(由二倍體的萬壽菊和四倍體的孔雀草雜交而得到的三倍體不育品系)。萬壽菊和孔雀草具有開花早、花期長、花型緊湊等優(yōu)點，不僅可以露地栽培美化街景、庭院，而且可以盆栽布置花壇。同時富含葉黃素，是天然色素的重要來源。此外還均含有一些生物活性成分，其提取物被廣泛的運用于制作殺蟲劑和殺菌劑。
萬壽菊屬植物具有菊科植物典型的頭狀花序，在雜交育種過程中，去雄非常困難。目前萬壽菊主要通過雄性不育兩用系制種，但是孔雀草由于缺乏不育系，仍以常規(guī)育種為主，造成育成品種的權(quán)力保護困難。孔雀草與萬壽菊是同屬近緣種，若能將萬壽菊的不育性狀轉(zhuǎn)育到孔雀草中，即能實現(xiàn)孔雀草的雜交育種，為孔雀草育種開辟新的領域。然而由于兩者的倍性不一致，雜交F1代為三倍體，不能結(jié)實，從而限制了育性的轉(zhuǎn)育進程。因此當務之急是建立一個穩(wěn)定、高效的萬壽菊加倍技術(shù)體系，將雄性不育的二倍體萬壽菊加倍成四倍體，再與四倍體孔雀草雜交，通過多代選育，人工創(chuàng)造出不育孔雀草。目前植物細胞加倍技術(shù)已在很多物種上得到應用，但國內(nèi)有關萬壽菊加倍的研究尚未見報道。
自然界植物多倍體的發(fā)生均來自于細胞核內(nèi)染色體組的倍性變異，即體細胞分裂過程中偶然發(fā)生的染色體加倍以及減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生未減數(shù)配子。人工誘導染色體加倍可采取秋水仙素溶液等化學誘導方法以及異常溫度等物理誘導方法?？烧T導多倍體的化學藥劑很多，但使用最多、最有效的還是秋水仙素。秋水仙素是從百合科的秋水仙(Colchicum autumnale L.)的器官和種子中提取的一種藥劑，當它接觸處于分裂期的細胞后，能使細胞核紡錘絲立即縮小，阻礙紡錘絲的形成和發(fā)展，使染色體不能移向兩極，停止在細胞分裂中期，從而產(chǎn)生染色體數(shù)加倍的核。利用秋水仙素處理分裂旺盛的組織均能獲得理想的多倍體，而萌發(fā)的種子和生長點是最好的處理材料。
目前利用秋水仙素進行植物染色體加倍的方法主要有浸種法、滴苗法、涂抹法、組織培養(yǎng)結(jié)合化學誘變等。申請人在利用組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙素化學誘變加倍萬壽菊的過程中，發(fā)現(xiàn)對分化的芽點施加不同濃度的秋水仙素后，分化苗玻璃化現(xiàn)象非常嚴重，無法得到健壯的四倍體植株，且組織培養(yǎng)的操作過程也相對復雜，成本較高。滴苗法、涂抹法的具體操作技術(shù)及環(huán)境條件控制都較浸種法的要求高，且易出現(xiàn)嵌合體。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種穩(wěn)定、簡便、高效的萬壽菊染色體數(shù)目加倍的方法，以改良萬壽菊的基因型，為雜交育種提供基礎材料。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 一種利用染色體加倍改良萬壽菊基因型的方法，采用秋水仙素溶液處理萬壽菊雄性不育兩用系的種子或莖尖，使其染色體數(shù)目加倍，從而為萬壽菊的基因型改良提供育種的起始材料。其步驟如下 A、萬壽菊種子染色體加倍 ①催芽處理將萬壽菊雄性不育兩用系的飽滿種子放入墊有用清水潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中催芽處理，培養(yǎng)溫度為25℃，得到萌動的種子； ②秋水仙素加倍處理將步驟①的萌動種子用0.05％濃度的秋水仙素溶液浸泡，浸泡時間為3～6小時，在浸泡過程中不斷攪拌，實現(xiàn)染色體加倍的目的； ③清水沖洗解除處理倒出秋水仙素溶液，將處理過的萬壽菊種子放入三角瓶中，用紗布綁扎瓶口，將三角瓶放在流水下沖洗30分鐘； ④栽培管理將步驟③水洗后的萬壽菊種子播于盛有栽培基質(zhì)的穴盤中，一穴一粒，兩個月后移栽到盛有盆土的瓦盆中，所述的栽培基質(zhì)為泥炭和珍珠巖按重量份的比例為3∶1混合，盆土為園土+腐葉土+黃沙按重量份的比例為3∶2∶1配制； ⑤染色體倍性鑒定秋水仙素加倍處理的萬壽菊植株開花后分別用形態(tài)鑒定法、氣孔鑒定法和流式細胞儀鑒定法確定萬壽菊染色體數(shù)目的倍性；或 B、萬壽菊莖尖染色體加倍 ①催芽處理選取萬壽菊雄性不育兩用系的飽滿種子放在墊有清水潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃下培養(yǎng)，待種子萌動后，播種到穴盤，穴盤的栽培基質(zhì)為泥炭和珍珠巖，按重量份的比例為3∶1混合； ②秋水仙素加倍處理待萬壽菊的兩片子葉剛剛展開，立即用脫脂棉球包裹幼苗的生長點，每隔4小時用0.025％濃度的秋水仙素溶液滴定莖尖，連續(xù)處理2天，處理過程中在所述穴盤上方覆蓋遮陽網(wǎng)，以保持脫脂棉球濕潤； ③流水淋洗解除處理步驟②處理2天后，摘除脫脂棉球，用清水淋洗萬壽菊植株的生長點，以解除秋水仙素處理； ④栽培管理兩個月后，將秋水仙素處理莖尖的植株移栽到瓦盆中，盆土的栽培基質(zhì)為園土+腐葉土+黃沙，按重量份的比例為3∶2∶1配制； ⑤染色體數(shù)目倍性鑒定秋水仙素加倍處理的萬壽菊植株開花后分別用形態(tài)鑒定法、氣孔鑒定法和流式細胞儀鑒定法確定萬壽菊的染色體加倍情況。
在本發(fā)明中，種子萌動是指種子的前端膨大，種皮破裂。
形態(tài)鑒定是指加倍萬壽菊的植株變矮、莖節(jié)變短、莖桿增粗、葉色濃綠、葉片肥厚、小葉變寬、頭狀花序花莖增大、小花花瓣厚實、種子增粗。
氣孔鑒定法是指徒手撕取萬壽菊的下表皮，在顯微鏡下觀察其氣孔大小，若氣孔長度在23.00～35.51μm之間，平均長度為28.55μm者判定為二倍體；若氣孔長度在33.15～52.60μm，平均長度為42.07μm者判定為四倍體。
本發(fā)明所述的萬壽菊種子為萬壽菊雄性不育兩用系種子，該種子的名稱為M525AB，來源于湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院培育。
本方法具有以下優(yōu)點 1、處理的環(huán)境條件容易控制，重復性高。將萬壽菊種子放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)催芽，種子萌發(fā)環(huán)境的濕度和溫度容易控制，種子發(fā)育過程比較一致，方法的可重復性高。
2、操作簡便。相比組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙素化學誘變技術(shù)，用本發(fā)明只需將萌動的種子用秋水仙素溶液浸泡3～6小時或用秋水仙素溶液滴定幼嫩莖尖2天即可，更加省時省力。
3、加倍效率高。本發(fā)明中對萌動的萬壽菊種子施加秋水仙素處理后，對萬壽菊的加倍率達88.89％以上。



圖1二倍體和四倍體萬壽菊形態(tài)比較圖。圖1A是萬壽菊的植株形態(tài)圖。圖左為二倍體萬壽菊植株，圖右為四倍體萬壽菊植株。圖1B是萬壽菊的頭狀花序，圖左為二倍體的萬壽菊花序，圖右為四倍體的萬壽菊花序。圖1C是萬壽菊的種子，圖左為四倍體的萬壽菊種子，圖右為二倍體的萬壽菊種子。
圖2二倍體和四倍體萬壽菊的氣孔觀察情況。圖2A是二倍體的氣孔，圖2B是四倍體的氣孔。放大倍數(shù)均為10×20倍，bar＝50μm。
圖3流式細胞儀分析結(jié)果。圖3A為二倍體萬壽菊的檢測結(jié)果，圖3B為四倍體萬壽菊的檢測結(jié)果。

具體實施例方式 實施例1 2004年，申請人于華中農(nóng)業(yè)大學園藝花卉試驗場發(fā)現(xiàn)1株萬壽菊雄性不育材料，通過多代定向選育，得到一株性狀穩(wěn)定的萬壽菊雄性不育兩用系，命名為M525AB(He Yanhong，等，Cytological and mappinganalysis of a novel male sterile type resulting from spontaneous floral organ homeotic conversion in marigold(Tagetes erecta L.).Molecular Breeding，2009，DOI10.1007/s11032-009-9372-x.見Springerlink數(shù)據(jù)庫http://springer.lib.tsinghua.edu.cn/content/6218771h8502152j/？p＝3a1acfbf8d8442e49f0238dcb63b9da0&pi＝0)。2008年秋季，收獲萬壽菊雄性不育兩用系M525AB的種子，經(jīng)過干燥密封保存以備第二年使用。
萬壽菊加倍方法按以下步驟進行 ①催芽處理于3月上旬，選取萬壽菊雄性不育兩用系M525AB的飽滿種子放在墊有清水濕潤的濾紙的 培養(yǎng)皿中，于25℃下培養(yǎng)，直到獲得萌動的種子； ②秋水仙素加倍處理待催芽的萬壽菊兩用系種子前端膨大，種皮破裂萌動后，用0.05％～0.4％的秋水仙素溶液浸泡3～9小時，在浸泡過程中不斷攪拌，使萬壽菊種子的染色體加倍； ③流水沖洗解除處理倒出秋水仙素溶液，將處理過的種子放入三角瓶中，用紗布綁扎瓶口，并將三角瓶放在流水下沖洗30分鐘解除處理； ④栽培管理將解除處理的萬壽菊種子播種到128孔規(guī)格的穴盤，一穴一粒，其栽培基質(zhì)為泥炭和珍珠巖按照重量份3∶1混合，兩個月后，統(tǒng)計成活率，并移栽到直徑為23厘米的素燒瓦盆，盆土為園土+腐葉土+黃沙按重量份的比例為3∶2∶1配制(所述的園土為通常的菜園土，所述的腐葉土為華中農(nóng)業(yè)大學獅子山森林綠化區(qū)的自然表層土，不添加人工營養(yǎng)物質(zhì)，實施例2相同)，將所述的基質(zhì)混合，按照常規(guī)管理。
⑤染色體數(shù)目倍性鑒定萬壽菊植株開花后進行形態(tài)鑒定，凡是加倍處理后的萬壽菊形態(tài)出現(xiàn)植株變矮、莖節(jié)變短、莖桿增粗、葉色濃綠、葉片肥厚、小葉變寬、頭狀花序花莖增大、小花花瓣厚實、種子增粗的初步確定為四倍體植株(如圖1和表1所示)。同時徒手撕取萬壽菊葉片的下表皮，在顯微鏡下觀察并比較其葉片氣孔大小，凡是氣孔平均長度為28.55μm(幅度范圍為23.00～35.51μm)的鑒定為二倍體；氣孔平均長度為42.07μm(幅度范圍為33.15～52.60μm)的鑒定為四倍體(如圖2所示)；最后采集初步鑒定為四倍體的萬壽菊葉片利用流式細胞儀(PA-1，由德國partec公司生產(chǎn))測定染色體數(shù)目的倍性，檢測結(jié)果如圖3所示。
試驗結(jié)果表明，以0.05％秋水仙素浸泡3～6小時的處理中植株的成活率最高，多倍體植株的得率亦達88.89％。而高濃度處理，雖然多倍體的得率達到100％，但是死亡率亦很高(見表2)。因此優(yōu)選0.05％秋水仙素浸泡3～6小時的處理。
實施例2 本實施例是采用莖尖滴定秋水仙素誘導加倍方法，按照以下步驟進行 ①催芽3月上旬，選取萬壽菊雄性不育兩用系M525AB的飽滿種子放在墊有清水濕潤的濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)，待催芽的種子前端膨大，種皮破裂萌動后，播種到穴盤，穴盤栽培基質(zhì)同實施例1。
②秋水仙素加倍處理待萬壽菊的兩片子葉一展開，立即用脫脂棉球包裹幼苗的生長點，每隔4小時利用0.025％～0.4％濃度的秋水仙素溶液進行莖尖滴定，連續(xù)處理2天，處理過程中穴盤上方覆蓋遮陽網(wǎng)，以保持棉球濕潤。
③流水淋洗解除處理2天后，摘除棉球，用清水淋洗生長點，以解除處理。
④栽培管理兩個月后，統(tǒng)計成活率，并將植株移栽到直徑為23厘米的素燒瓦盆，盆土的配制同實施例1，常規(guī)管理同實施例1。
⑤染色體數(shù)目倍性鑒定秋水仙素加倍處理的萬壽菊植株開花后分別選用形態(tài)鑒定法、氣孔鑒定法和流式細胞儀鑒定法確定萬壽菊的染色體加倍情況，其鑒定方法及評價標準同實施例1。
試驗結(jié)果表明，0.025％～0.4％濃度秋水仙素滴定萬壽菊的莖尖后，高濃度處理中幼苗生長點大多死亡，最后無法成苗而整株死亡，僅有0.025％秋水仙素處理得到了加倍的植株，加倍效率為55.55％(表3)，但是其中嵌合體的比例達到40％。相比實施例1，莖尖滴定法處理繁瑣，多倍體得率低，且嵌合體的頻率高。因此，優(yōu)選的方法是對萌動的萬壽菊種子施加0.05％秋水仙素浸泡3～6小時的處理為宜。
表1秋水仙素處理萬壽菊種子后加倍植株的形態(tài)變異統(tǒng)計
表2萌動種子施加秋水仙素后誘導萬壽菊多倍體得率統(tǒng)計表

表3秋水仙素莖尖滴定誘導萬壽菊多倍體得率的統(tǒng)計

權(quán)利要求
1.一種利用染色體加倍改良萬壽菊基因型的方法，其特征在于，采用秋水仙素溶液處理萬壽菊雄性不育兩用系的種子或莖尖，使其染色體數(shù)目加倍，實現(xiàn)基因型改良，其步驟如下A、萬壽菊種子染色體加倍
①催芽處理將萬壽菊雄性不育兩用系的飽滿種子放入墊有用清水潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中催芽處理，培養(yǎng)溫度為25℃，得到萌動的種子；
②秋水仙素加倍處理將步驟①的萌動種子用0.05％濃度的秋水仙素溶液浸泡，浸泡時間為3～6小時，在浸泡過程中不斷攪拌，實現(xiàn)染色體加倍的目的；
③清水沖洗解除處理倒出秋水仙素溶液，將處理過的萬壽菊種子放入三角瓶中，用紗布綁扎瓶口，將三角瓶放在流水下沖洗30分鐘；
④栽培管理將步驟③水洗后的萬壽菊種子播于盛有栽培基質(zhì)的穴盤中，一穴一粒，兩個月后移栽到盛有盆土的瓦盆中，所述的栽培基質(zhì)為泥炭和珍珠巖按重量份的比例為3∶1混合，盆土為園土+腐葉土+黃沙按重量份的比例為3∶2∶1配制；
⑤染色體倍性鑒定秋水仙素加倍處理的萬壽菊植株開花后分別用形態(tài)鑒定法、氣孔鑒定法和流式細胞儀鑒定法確定萬壽菊染色體數(shù)目的倍性。或
B、萬壽菊莖尖染色體加倍
①催芽處理選取萬壽菊雄性不育兩用系的飽滿種子放在墊有清水潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃下培養(yǎng)，待種子萌動后，播種到穴盤，穴盤的栽培基質(zhì)為泥炭和珍珠巖，按重量份的比例為3∶1混合；
②秋水仙素加倍處理待萬壽菊的兩片子葉剛剛展開，立即用脫脂棉球包裹幼苗的生長點，每隔4小時用0.025％濃度的秋水仙素溶液滴定莖尖，連續(xù)處理2天，處理過程中在所述穴盤上方覆蓋遮陽網(wǎng)，以保持脫脂棉球濕潤；
③流水淋洗解除處理步驟②處理2天后，摘除脫脂棉球，用清水淋洗萬壽菊植株的生長點，以解除秋水仙素處理；
④栽培管理兩個月后，將秋水仙素處理莖尖的植株移栽到瓦盆中，盆土的栽培基質(zhì)為園土+腐葉土+黃沙，按重量份的比例為3∶2∶1配制；
⑤染色體數(shù)目倍性鑒定秋水仙素加倍處理的萬壽菊植株開花后分別用形態(tài)鑒定法、氣孔鑒定法和流式細胞儀鑒定法確定萬壽菊的染色體加倍情況。
2.權(quán)利1所述的方法在萬壽菊基因型改良上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于花卉育種技術(shù)領域，具體涉及一種利用染色體加倍改良萬壽菊基因型的方法。特征是，采用秋水仙素溶液處理萬壽菊雄性不育兩用系的種子或莖尖，使其染色體數(shù)目加倍，從而為萬壽菊的基因型改良提供育種的起始材料。本發(fā)明的步驟包括催芽處理、秋水仙素加倍處理、清水沖洗解除處理、栽培管理、染色體倍性鑒定等。優(yōu)選的處理為對萬壽菊萌動種子施加0.05％濃度的秋水仙素溶液浸泡3～6小時的為宜，植株的成活率高，加倍效率亦達到88.89％。本發(fā)明可以有效的控制種子萌發(fā)時的環(huán)境溫度和濕度，試驗的重復性高，且操作簡便，省時省力。本發(fā)明適用于萬壽菊基因型改良。
文檔編號C12Q1/68GK101766119SQ201010103440
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者何燕紅, 郭冬, 胡燕, 葉要妹, 包滿珠 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學