專利名稱：一種利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種利用糖蜜作為混合碳源成分之一培
養(yǎng)超高細(xì)胞濃度光合細(xì)菌的方法，在產(chǎn)業(yè)化高效培養(yǎng)光合細(xì)菌方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria)是一大類能在厭氧光照條件下進(jìn)行不產(chǎn)氧 光合作用的原核生物的總稱，屬于革蘭陰性菌，分為紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、著色 菌科(Chromatiaceae)、綠菌科(Chlorobiaceae)禾口綠色絲狀菌科(Chlorof lexaceae) 4個(gè) 科，菌細(xì)胞主要分為桿狀和球形2種不同形態(tài)，是地球生命起源的先鋒物種之一，其中紅假 單胞菌(Rhodopseudomonas)和紫色無硫菌(Rhodospirillaceae)是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)較多的光 合細(xì)菌種類。光合細(xì)菌的蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%以上，同時(shí)富含可以作為細(xì)胞代謝激活劑和 天然抗氧化劑的輔酶Q10(泛醌)及具有抗癌作用的類胡蘿卜素，具有重要的營養(yǎng)和藥用價(jià) 值。目前，光合細(xì)菌在作為畜禽飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長、處理高濃度有機(jī)廢水、水產(chǎn)養(yǎng)殖 水質(zhì)的凈化和農(nóng)業(yè)高效活性菌肥等方面都發(fā)揮了越來越重要的作用。 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀顯示，目前光合細(xì)菌主要有動(dòng)態(tài)和靜置2種培養(yǎng)方式，培養(yǎng)裝置 有開放和密閉2種類型。國外有采用透光的密閉式光生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)連續(xù)培養(yǎng)光合細(xì)菌的 報(bào)道，但在國內(nèi)多采用玻璃缸和塑料桶在光照下靜置密閉培養(yǎng)。動(dòng)態(tài)密閉培養(yǎng)一般在透光 的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行，為了保持培養(yǎng)物能夠得到充分的光照，通過泵使光合細(xì)菌液體培養(yǎng)物流 過螺旋透光的玻璃管。對于靜置封閉培養(yǎng)光合細(xì)菌的規(guī)模生產(chǎn)工藝一般分為四級(jí)培養(yǎng)，分 別是一級(jí)試管種的轉(zhuǎn)接和純化；二級(jí)錐形瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積1 5升；三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng) 體積25 50升；四級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為100 1500升。 對于光合細(xì)菌的培養(yǎng)基，一般包含了含碳、氮和磷等化合物，因?yàn)樘颊脊夂霞?xì)菌干 重的50%左右，因此培養(yǎng)基組成中含碳化合物的選擇與確定在光合細(xì)菌培養(yǎng)中占有非常重 要的地位。目前在國內(nèi)外光合細(xì)菌培養(yǎng)中，一般采用乙酸鈉等有機(jī)酸鹽作為光合細(xì)菌培養(yǎng) 的主要有機(jī)碳源。盡管有機(jī)酸鹽可以作為光合細(xì)菌生長的較好碳源，可以支持光合細(xì)菌的 快速生長，但隨著光合細(xì)菌對有機(jī)酸鹽的利用，必然使培養(yǎng)物的pH急劇上升，而過高的pH 會(huì)明顯抑制光合細(xì)菌的持續(xù)生長，從而導(dǎo)致我國企業(yè)生產(chǎn)的光合細(xì)菌細(xì)胞濃度一般僅維持 在30億/毫升左右，是限制光合細(xì)菌達(dá)到快速可持續(xù)生長的一個(gè)重要原因。因此研究確定 既可以支持光合細(xì)菌快速生長，同時(shí)又能夠保持培養(yǎng)物PH穩(wěn)定的碳源，是獲得超高細(xì)胞濃 度光合細(xì)菌的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用糖蜜作為培養(yǎng)光合細(xì)菌的混合碳源之一，以大幅 度提高光合細(xì)菌細(xì)胞濃度的方法。 —種利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法，是在光合細(xì)菌厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程中，以 有機(jī)酸鹽作為主要碳源培養(yǎng)光合細(xì)菌的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加0. 25g/L 2. 00g/L的糖蜜，作為支持光合細(xì)菌生長混合碳源之一，使培養(yǎng)物PH值穩(wěn)定在適宜光合細(xì)菌生長的范 圍，補(bǔ)充光合細(xì)菌生長所需碳源，大幅度提高了培養(yǎng)的光合細(xì)菌細(xì)胞濃度。
所述的利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法，是在以有機(jī)酸鹽作為主要碳源的光合 細(xì)菌液體培養(yǎng)基中添加0. 25g/L 1. OOg/L的糖蜜。添加糖蜜量從0. 25g/L到1. OOg/L范 圍內(nèi)不僅能夠維持適宜光合細(xì)菌生長的pH范圍，而且可以補(bǔ)充光合細(xì)菌生長的碳源。
本發(fā)明的工作原理是采用有機(jī)酸鹽作為光合細(xì)菌生長的碳源時(shí)，有機(jī)酸鹽中的 碳被利用，而沒有被利用的金屬陽離子必然消耗陰離子使氫離子濃度升高，即導(dǎo)致培養(yǎng)物 的pH升高，因此抑制了光合細(xì)菌的進(jìn)一步生長。而主要含有蔗糖的糖蜜在厭氧條件下，通 過光合細(xì)菌的代謝可以轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，導(dǎo)致培養(yǎng)物PH降低。因此在利用有機(jī)酸鹽作為碳源 的同時(shí)，添加一定濃度的糖蜜不僅可以為光合細(xì)菌提供碳源促進(jìn)其生長，而且可以減緩因 光合細(xì)菌利用有機(jī)酸鹽而引起的PH過快上升對光合細(xì)菌生長的抑制。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用生產(chǎn)蔗糖的副產(chǎn)物糖蜜作為培養(yǎng)光合細(xì)菌的碳源之一， 不僅可以在一定程度上緩解了因利用有機(jī)酸鹽導(dǎo)致培養(yǎng)物pH升高過快而對光合細(xì)菌生長 產(chǎn)生的抑制作用，而且為光合細(xì)菌的生長提供了碳源，培養(yǎng)獲得了超高細(xì)胞濃度的光合細(xì) 菌。


圖1是本發(fā)明在乙酸鈉作為碳源之
沼澤紅假單胞菌生長效應(yīng)的示意圖。 圖2是本發(fā)明在乙酸鈉作為碳源之 培養(yǎng)物PH的變化示意圖。
具體實(shí)施例方式
圖1是本發(fā)明在乙酸鈉作為碳源之一條件下，添加不同濃度糖蜜作為補(bǔ)充碳源對 沼澤紅假單胞菌生長效應(yīng)的示意圖。其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位天；縱坐標(biāo)為代表沼澤紅 假單胞菌生長的光密度值(0D5。。 )。由圖中顯示出在為期6天的實(shí)驗(yàn)中，不添加糖蜜、添加
0. 25g/L糖蜜和添加0. 50g/L糖蜜組沼澤紅假單胞菌在前3天內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的生長趨勢，沼 澤紅假單胞菌的生物量隨糖蜜濃度的增加而增加，而3天以后沼澤紅假單胞菌的生長基本 呈現(xiàn)停止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)糖蜜添加量為1. OOg/L時(shí)，沼澤紅假單胞菌在前5天內(nèi)一直維持很高的 生長速度，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第6天培養(yǎng)物005。。 達(dá)到了最高值9. 78，比不添加糖蜜實(shí)驗(yàn)組的沼 澤紅假單胞菌生物量提高了 77%。而進(jìn)一步加大糖蜜添加量為2. OOg/L時(shí)，沼澤紅假單胞 菌生長緩慢，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第6天ODs。。，僅為2. 82。 圖2是本發(fā)明在乙酸鈉作為碳源之一條件下，添加不同濃度糖蜜作為補(bǔ)充碳源時(shí) 培養(yǎng)物PH的變化示意圖。其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位天；縱坐標(biāo)為pH。由圖中顯示出當(dāng)
沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)物的初始pH都在8. 0時(shí)，實(shí)驗(yàn)第2天，不添加糖蜜組pH增加到可以抑 制沼澤紅假單胞菌生長的8. 7，添加糖蜜量從0. 25g/L到1. OOg/L組的pH范圍維持在適宜 沼澤紅假單胞菌生長的8. 3到7. 0之內(nèi)，添加糖蜜量為2. OOg/L組pH降低到不適宜沼澤紅 假單胞菌生長的6. 6。實(shí)驗(yàn)2天以后所有添加和不添加糖蜜實(shí)驗(yàn)組的pH均呈現(xiàn)不同程度的 增加趨勢，不添加糖蜜組、添加糖蜜量0. 25g/L和0. 50g/L在實(shí)驗(yàn)第3天pH均增加到9. 3左
條件下，添加不同濃度糖蜜作為補(bǔ)充碳源對 條件下，添加不同濃度糖蜜作為補(bǔ)充碳源時(shí)右，而添加1. 00g/L糖蜜組pH的升高速率卻非常緩慢，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第6天pH才達(dá)到8. 7， 添加2. OOg/L糖蜜組pH略微有所升高，但不超過6. 8。
下面根據(jù)圖1、圖2，結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明詳述如下 首先配制光合細(xì)菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組成為(g/L):乙酸鈉3.0，朋4(:1 1. 0， KH2P04 0. 5， MgS04 7H20 0. 2， NaCl 5. O，酵母粉0. 8，微量元素液1. Oml/L。微量元素液包括(mg/ L) :FeCl3 6H20 5. 0， CuS04 5H200. 05， H萬1. 0， MnCl2 4H20 0. 05， ZnS04 7H20 1. 0， CoCl2 6H20 0. 5。用去離子水配制微量元素液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，分別添加糖蜜0、0. 25、0. 50、 1. 00 和2. 00g/L。將配制好的光合細(xì)菌培養(yǎng)基放入500mL玻璃瓶內(nèi)在12rC下進(jìn)行高溫高壓滅 菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至室溫，在潔凈工作臺(tái)無菌條件下接種沼澤紅假單胞菌。接種后 的培養(yǎng)物放入培養(yǎng)箱，在溫度30°C，白熾燈光照強(qiáng)度30001ux下進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)，研究確 定在乙酸鈉為碳源的基礎(chǔ)上，添加糖蜜作為補(bǔ)充碳源對沼澤紅假單胞菌生長的效應(yīng)。經(jīng)過 6天的培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌生長曲線結(jié)果見附圖1，培養(yǎng)物pH的變化見附圖2。
圖1和圖2的研究結(jié)果表明，在乙酸鈉和糖蜜同時(shí)存在下，沼澤紅假單胞菌首先利 用糖蜜中的糖類進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸導(dǎo)致pH降低，因此減緩了沼澤紅假單胞菌后期利用 乙酸鈉時(shí)導(dǎo)致的PH過快升高。在有機(jī)酸鹽作為主要碳源的情況下，添加糖蜜量從0. 25g/L 到1. 00g/L范國內(nèi)不僅能夠維持適宜沼澤紅假單胞菌生長的pH范圍，而且可以補(bǔ)充沼澤紅 假單胞菌生長的碳源，培養(yǎng)物最高0D5。。 達(dá)9. 78，比對照不加糖蜜沼澤紅假單胞菌生物量 提高77%，在利用生產(chǎn)蔗糖的廢棄物糖蜜和培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度光合細(xì)菌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具 有非常重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
一種利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法，其特征在于在光合細(xì)菌厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程中，以有機(jī)酸鹽作為主要碳源的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加0.25g/L～2.00g/L的糖蜜，使培養(yǎng)物pH值穩(wěn)定在適宜光合細(xì)菌生長的范圍，補(bǔ)充光合細(xì)菌生長所需碳源，提高培養(yǎng)的光合細(xì)菌細(xì)胞濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法，其特征在于在以有機(jī) 酸鹽為主要碳源的光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，添加0. 25g/L 1. OOg/L的糖蜜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用糖蜜高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法，其特征在于在以有機(jī) 酸鹽為主要碳源的光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，添加1. OOg/L的糖蜜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用糖蜜作為碳源之一高效培養(yǎng)光合細(xì)菌的方法。在光合細(xì)菌厭氧發(fā)酵培養(yǎng)過程中，以有機(jī)酸鹽作為主要碳源的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加0.25g/L～2.00g/L的糖蜜，使培養(yǎng)物pH值穩(wěn)定在適宜光合細(xì)菌生長的范圍，提高培養(yǎng)的光合細(xì)菌細(xì)胞濃度，補(bǔ)充光合細(xì)菌生長所需碳源。使培養(yǎng)獲得的光合細(xì)菌生物量提高了77％，在利用蔗糖生產(chǎn)的副產(chǎn)物糖蜜和培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度光合細(xì)菌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101748092SQ201010106040
公開日2010年6月23日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者包有霞, 山其米克, 許倩倩, 閆海 申請人:北京科技大學(xué)