專利名稱：：攪拌罐連續(xù)培養(yǎng)高產(chǎn)核酸熱帶假絲酵母的核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種攪拌罐連續(xù)培養(yǎng)高產(chǎn)核酸熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)的核糖核酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：核酸的發(fā)現(xiàn)已有100多年的歷史，但人們對它真正有所認識不過是近60年的事。遠在1868年瑞士化學(xué)家米歇爾(Miesher，F(xiàn).18441895)，首先從膿細胞分離出細胞核，用堿抽提再加入酸，得一種含氮和磷特別豐富的沉淀物質(zhì)，當(dāng)時曾稱為核質(zhì)。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)。生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。自從有研究人員發(fā)現(xiàn)以核糖核酸為原料，用酶解法制造呈味性物質(zhì)5’-核苷酸的方法以來，有力地促進了從微生物中提取核糖核酸新方法的研究。與動植物相比，微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)生物合成非?；钴S，含有豐富的核糖核酸。酵母菌的核糖核酸是以核蛋白體核糖核酸(rRNA)，mRNA和tRNA的形式出現(xiàn)的。其中rRNA的含量占總量的85%以上。酵母細胞中核糖核酸含量豐富，為DNA的50100倍，這隨酵母種類、生長速率及培養(yǎng)基的組成等因素的不同而變化。已有報道指出，酵母細胞的核糖核酸含量為712%(以干物質(zhì)計)。山口等(山口和夫，三上忠義，茨大農(nóng)學(xué)術(shù)報告，13，69，1965)用含有2%葡萄糖的合成培養(yǎng)基研究比較了數(shù)十種酵母屬結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體中核糖核酸含量，從生長的誘導(dǎo)期至對數(shù)生長期達最高含量。單位培養(yǎng)液中的核糖核酸積累能力，一般以假絲酵母屬的酵母，特別是產(chǎn)阮假絲酵母和糙蹼假絲酵母(C.mycodema)為最佳，其核糖核酸的積累量在對數(shù)生長期末最高，而且因糖的種類不同所引起的差異較??；無機氮源以硫酸銨，有機氮源以蛋白胨、酵母浸出液為佳。核糖核酸最大的應(yīng)用是作為用分解法生產(chǎn)5’_核苷酸的工業(yè)原料。核酸在核酸酶的作用下，水解為寡核苷酸或單核苷酸，其中脫氧核糖核酸水解后產(chǎn)生dAMP、dGMP、dCMP和dTMP,核糖核酸水解后產(chǎn)生AMP、GMP、CMP和UMP。核糖核酸及其酶分解產(chǎn)物腺苷酸、胞苷酸，鳥苷酸，尿苷酸等在醫(yī)藥、食品、化妝品以及農(nóng)業(yè)等行業(yè)中具有重要的用途。近年來一些研究表明核糖核酸及其酶解物核苷酸具有維持機體免疫功能、抗氧化、提高機體蛋白質(zhì)和鐵的生物利用率、降低膽固醇和抗衰老等多種生理功能。因此，核糖核酸的開發(fā)研究越來越受到重視。但是，以前產(chǎn)核糖核酸酵母的培養(yǎng)一般都采用傳統(tǒng)的鼓泡式連續(xù)培養(yǎng)，如文獻(王大琛1986年10月全國核酸技術(shù)學(xué)術(shù)會議)所述，采用該法發(fā)酵液中干菌濃度ll_12g/L，最高13-14g/L干菌體中核糖核酸含量14-15%。該菌株保藏編號為K-79。本發(fā)明的目的，就在于克服以上缺點和不足，提供一種菌體收率高，能耗低，適合于高效規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的攪拌連續(xù)發(fā)酵工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立和改進高核酵母的核糖核酸生產(chǎn)工藝，使菌體濃度達2023g/L和核糖核酸含量達1214%，裝料系數(shù)達到50-75%，同時通過連續(xù)發(fā)酵取消了間歇發(fā)酵過程中的消罐、空消、進料、實消的工藝，延長了實際生產(chǎn)時間，大幅度提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)過程能耗，減少了發(fā)酵廢水的排放。該工藝勞動強度小，生產(chǎn)程序簡單。一、菌種性狀和來源本發(fā)明通過將熱帶假絲酵母ATCC14246進行誘變篩選，得到一株高產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母菌株，簡稱CPU-1，它不但核酸含量很高并且具有解脂假絲酵母可利用石蠟油為碳源的特征。高產(chǎn)核糖核酸的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)菌株CPU-1，已于2009年12月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提交保藏，保藏號為CGMCCNo.3558。本發(fā)明以實驗室保藏的熱帶假絲酵母ATCC12468為原始菌株，先利用以石蠟油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)出能夠利用石蠟油的酵母菌，用稀釋平板法純化出單菌落作為誘變的出發(fā)菌株。根據(jù)一定范圍內(nèi)不同濃度和時間梯度的NTG致死率曲線，得到合適的誘變條件后，用一定濃度的NTG對出發(fā)菌株進行誘變。由于本菌株有對高濃度氯化鉀敏感的特性，所以用影印平板法進行篩選出氯化鉀敏感菌株，接著再將它們進行3次紫外誘變，最后得到一株核糖核酸含量達到12%的菌株CPU-1，較原始菌株熱帶假絲酵母ATCC14246的核糖核酸含量提高了3倍。在此誘變篩選的過程中，所用的培養(yǎng)基為以下幾種。氯化鉀敏感性篩選培養(yǎng)基A葡萄糖3%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，尿素0.5%,FeS04*7H200.01%，瓊脂2.5%;氯化鉀敏感性篩選培養(yǎng)基B為培養(yǎng)基A中加入1.5mol/LKC1；分離單菌落的平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基C葡萄糖3%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，尿素0.5%,FeS04-7H200.01%，瓊脂2.5%；利用石蠟油菌株的篩選培養(yǎng)基D石蠟油1%,(NH4)2S041.5%,KH2P040.9%,K2HP040.3%,MgS047H200.3%,FeS047H200.003%，酵母膏0.3%，玉米菜0.3%；種子培養(yǎng)基S葡萄糖4%，(NH4)2S041.5%,KH2P040.9%,K2HP040.3%,MgS047H200.3%,FeS047H200.003%，酵母膏0.3%，玉米漿0.3%，CaC030.5%；篩選發(fā)酵培養(yǎng)基M石蠟油1%，尿素0.8%，80%磷酸0.3%,KC10.15%,MgS047H200.1%,FeS047H200.003%,CaCl22H200.01%,NaCl0.1%，酵母膏0.3%，玉米菜0.3%。具體地，此誘變篩選的方法為首先將熱帶假絲酵母ATCC14246于培養(yǎng)基D中28°C培養(yǎng)1618h后挑取單菌落，該菌落即為可利用石蠟油的菌株，它作為誘變的出發(fā)菌株。接著，用0.5mg/ml亞硝基胍(NTG)在30°C誘變45min，也可以用1.5mg/ml或2.Omg/mNTG誘變30min，用影印平板法篩選出一株核酸含量達10%的氯化鉀敏感菌株D12，此處的影印平板法為在培養(yǎng)基A和B兩塊平皿的相同位置接種該菌，如果該菌株是對氯化鉀的敏感菌株，則會只在A平板上生長，不在B平板上生長，如果該菌株對氯化鉀不敏感，則會在A和B平板上都生長。然后，D12再通過三次紫外誘變，照射時間為60s，篩選出一株核酸含量高達12%的KC1敏感菌株菌株CPU-1，它同時還具有解脂假絲酵母的特征，可利用石蠟油為碳源，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.3558。該菌株具有以下特征1.菌落形態(tài)特征見附圖1。如圖1所示，在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)(酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%)瓊脂培養(yǎng)基上菌落為白色到奶油色，無光澤或稍有光澤，黏濕，軟而平滑或部分有皺紋，易被挑起。2.菌體形態(tài)特征在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28°C，3天，細胞呈球形或卵球，大小為48X6lliim。3.菌株的生長及核酸含量曲線見附圖2。如圖2所示，012h為菌生長的對數(shù)期，培養(yǎng)基中的葡萄糖含量急劇下降，菌濃也快速增長，PH下降，而核酸增長則較平穩(wěn)；12h以后，菌進入穩(wěn)定期，葡萄糖基本消耗完畢，菌體總量的增長幅度不再顯著，核酸的含量與對數(shù)生長期相比有主見降低的趨勢。這是因為在核糖核酸聚合酶的活性在酵母對數(shù)生長期較高，經(jīng)過了對數(shù)生長期以后，隨著時間的增加，核糖核酸聚合酶活性逐漸降低，所以菌體內(nèi)核糖核酸的含量變少。而酵母菌在生長過程中代謝產(chǎn)生有機酸使培養(yǎng)液PH下降。因此在保持較高菌濃的前提下，確定種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的時間為1012h。且在間歇發(fā)酵過程中，酵母菌的比生長速率P最大可達到0.51T1。二、具體發(fā)酵步驟如下a.將CPU-1菌種在斜面培養(yǎng)基中以2831°C的條件下進行活化；b.將a步驟活化的菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)；c.將搖瓶所得菌種在攪拌發(fā)酵罐中先在間歇發(fā)酵培養(yǎng)基中進行間歇發(fā)酵，412h后在不斷加入補料培養(yǎng)基的情況下進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。d.提取分離核糖核酸.其中在斜面培養(yǎng)基中以2831°C培養(yǎng)的時間優(yōu)選2436h。所述的斜面培養(yǎng)基優(yōu)選由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵、25g/L瓊脂加入水中加熱搖勻所制備。搖瓶培養(yǎng)過程優(yōu)選將斜面活化的CPU-1菌種接到裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床中以100300r/min振蕩，2832°C發(fā)酵培養(yǎng)1030h。更優(yōu)選搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為30°C，培養(yǎng)時間是1824h。攪拌發(fā)酵罐中的間歇發(fā)酵的優(yōu)選的方法是在攪拌罐中投入5075%攪拌罐體積的間歇發(fā)酵培養(yǎng)基，在115°C下，高壓滅菌30min；在溫度降到30°C以下時，將搖瓶所得的菌種以110%體積比的菌種量接種到發(fā)酵罐中，以溫度3034°C，pH3.84.5，溶氧率10-500%，壓力0.020.05Mpa,攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的發(fā)酵條件發(fā)酵412h，得到干菌濃為2023g/L。所述溶氧率10-500%的條件是在發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液中的溶氧率來調(diào)整所通入無菌空氣的量。在發(fā)酵過程中根據(jù)pH下降的趨勢不斷加入氨水使pH保持3.84.5范圍內(nèi)。間歇發(fā)酵412h后，pH下降趨勢略成緩慢，干菌濃度達到2023g/L時開始連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75、溫度3034°C、pH3.94.5、溶氧率10-500%、壓力0.020.05Mpa、攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min。干菌濃度2023g/L，核糖核酸含量約1214%。所述溶氧率10-500%的條件是在發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液中的溶氧率來調(diào)整所通入無菌空氣的量。在發(fā)酵過程中根據(jù)PH下降的趨勢不斷加入氨水使pH保持3.94.5范圍內(nèi)。本發(fā)明中搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)選含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml的磷酸。更優(yōu)選的搖瓶培養(yǎng)基是由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸鎂、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸銨、0.15g/L的硫酸鋅、0.15g/L的硫酸亞鐵、0.lg/L的NaCl、l.8ml/L的磷酸加入水中搖勻所制備。培養(yǎng)基基質(zhì)為水。本發(fā)明中間歇發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl、l3ml的磷酸。更優(yōu)選的間歇發(fā)酵培養(yǎng)基由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸鎂、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸銨、0.15g/L的硫酸鋅、0.15g/L的硫酸亞鐵、0.lg/L的NaCl、2.0ml/L的磷酸加入水中搖勻所制備。本發(fā)明中補料培養(yǎng)基優(yōu)選含2535g/L糖蜜、0.61.3g/L的硫酸鎂、0.61.3g/L的尿素、0.10.4g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.030.lg/L的NaCl和13ml的磷酸。更優(yōu)選的補料培養(yǎng)基由28g/L糖蜜、0.8g/L的硫酸鎂、0.8g/L的尿素、0.2g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鋅、0.lg/L的硫酸亞鐵、0.06g/L的NaCl、l.5ml的磷酸加入水中搖勻所制備。優(yōu)選用堿式法提取分離核糖核酸，將以上發(fā)酵液通過離心分離收集酵母菌體。然后配置氫氧化鈉溶液，該溶液的配置方法是將10%干酵母重量的氫氧化鈉和一定量的水混合，配置成濃度為的氫氧化鈉溶液。(該溶液中水分的量包括濕菌酵母中所含的水)。將菌體加入到以上所配置的氫氧化鈉溶液中，在20°c攪拌3040分鐘。離心收集上清液，并用鹽酸調(diào)PH至2.5，在210°C存放46h，再離心，將離心所得的沉淀干燥后即可獲得核糖核酸產(chǎn)品，其提取收率約為8090%。核糖核酸含量的測定方法如下取IOml發(fā)酵菌液進行離心8000rpm，IOmin,棄去上清，稱菌體濕重。用IOml生理鹽水懸浮細胞，離心8000rpm，10min，再用生理鹽水懸浮后取2ml菌懸液于干凈試管，再加入2ml高氯酸，70°C水浴20min，水浴過程中每5min震蕩一次，水浴后取Iml加入EP管中混勻，用紫外分光光度計于260nm處測0D。核糖核酸含量測A定的公式為:RNA%=A/W*R*32*稀釋倍數(shù)χ100其中，A為OD26tl吸光值，32為文獻單位光吸收值，W為菌體濕重g·R為酵母菌的干濕重比。采用本發(fā)明的發(fā)酵方法適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，可以在203000L的發(fā)酵罐中生產(chǎn)，發(fā)酵液中干菌濃度可達2023g/L，干菌種核糖核酸含量達1214%。圖1是CPU-I的菌落形態(tài)特征圖2是CPU-I的生長及核酸含量曲線圖3是20L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖4是20L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖5是200L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖6是200L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖7是3000L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖8是3000L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵過程中熱CPU-I的生長代謝曲線具體實施例方式實施例1CPU-I在20L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)1、CPU-I的活化將4°C保存的CPU-I菌種接種到斜面培養(yǎng)基上以30°C條件下培養(yǎng)32h。斜面培養(yǎng)基是由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵、25g/L瓊脂加入水中加熱搖勻所制備。2、CPU-I的搖瓶培養(yǎng)裝有IOOml搖瓶培養(yǎng)基的500ml搖瓶，在115°C條件下高壓滅菌20min。將斜面活化的CPU-I菌種接種到搖瓶中，置于搖床中以200r/min振蕩，30°C發(fā)酵培養(yǎng)20h，干菌濃度為15g/L。3、CPU-I在20L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將14升間歇發(fā)酵培養(yǎng)基裝入20L發(fā)酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。等溫度降低到<30°C時，將搖瓶培養(yǎng)所得的600mlCPU-I菌種接種到發(fā)酵罐中，以溫度3132°C,pH4.04.1，溶氧率3040%，壓力0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的發(fā)酵條件進行發(fā)酵，期間由于發(fā)酵會產(chǎn)生大量的有機酸，致使PH下降，因此要不斷的在發(fā)酵液中加入氨水調(diào)整PH。間歇發(fā)酵過程菌的生長代謝曲線見圖3。約7h后，干菌濃約20g/L，pH下降趨勢略呈緩慢，開始連續(xù)發(fā)酵，稀釋率從0.3逐漸提高到0.75，以溫度3132°C、pH4.04.1、溶氧率3050%、壓力0.05Mpa、攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的條件進行發(fā)酵，在28h時稀釋率為0.51Γ1，在28h時稀釋率為0.61^，干菌濃度達21g/L，核糖核酸含量約14%。連續(xù)發(fā)酵菌的生長代謝曲線見圖4。實施例2CPU-I在200L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)將150L間歇發(fā)酵培養(yǎng)基裝入200L發(fā)酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。等溫度降低到<30°C時，將實施例1方法所得的7.5LCPU-I菌種接種到發(fā)酵罐中，以3233°C，pH4.04.2，溶氧率3080%，通氣量為226M3/h，壓力0.020.04Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的條件進行間歇發(fā)酵，期間由于發(fā)酵會產(chǎn)生大量的有機酸，致使pH下降，因此要不斷的在發(fā)酵液中加入氨水，共加入氨水835ml。間歇發(fā)酵培養(yǎng)過程中菌的生長代謝曲線及工藝參數(shù)見圖5。間歇發(fā)酵約7h后pH下降趨勢略成緩慢，測其殘?zhí)橇繛?.63%，干菌濃度達到22.2g/L開始連續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75，以溫度3233°C，pH4.04.2，溶氧率3080%，壓力0.020.04Mpa,攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的發(fā)酵條件進行發(fā)酵，至88h稀釋率為0.51Γ1時，干菌濃度達22.4g/L，核糖核酸含量約14%。連續(xù)發(fā)酵過程中菌的生長代謝曲線及工藝參數(shù)見圖6。實施例3CPU-I在3000L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將1800L間歇發(fā)酵培養(yǎng)基裝入3000L發(fā)酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。將將實施例1方法所得的75LCPU-I菌種接種到接種到發(fā)酵罐中，以溫度32°C33°C，pH4.04.1，溶氧率30120%，壓力0.20.4Mpa的條件進行間歇發(fā)酵，發(fā)酵5h后，測干菌濃度22.18g/L。其生長代謝曲線見圖7。然后開始連續(xù)發(fā)酵，稀釋率從0.33逐漸提高到O.75，以溫度3233°C，pH4.O4.1，溶氧率30120%、壓力0.020.04Mpa、攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的條件進行發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵88h稀釋率為0.51Γ1時，干菌濃度23g/L，核糖核酸含量約13.5%。其生長代謝曲線及工藝參數(shù)見圖8。以上所用發(fā)酵培養(yǎng)基的組成見表1，培養(yǎng)基基質(zhì)為水。表1培養(yǎng)基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種微生物攪拌罐連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)核糖核酸的方法，包括菌種活化、培養(yǎng)、發(fā)酵和提取分離，其特征是活化、培養(yǎng)、發(fā)酵的方法包括a.將保藏編號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌種在斜面培養(yǎng)基中以28～31℃的條件下進行活化；b.將a步驟活化的菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)；c.將搖瓶所得菌種在攪拌發(fā)酵罐中先在間歇發(fā)酵培養(yǎng)基中進行間歇發(fā)酵，4～12h后在不斷加入補料培養(yǎng)基的情況下進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。2.權(quán)利要求1的的方法，其中在斜面培養(yǎng)基中以2831°C培養(yǎng)2436h。3.權(quán)利要求1的方法，其中搖瓶培養(yǎng)過程是將斜面活化的保藏編號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌種接到裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床中以100300r/min振蕩，2832°C發(fā)酵培養(yǎng)1030h。4.權(quán)利要求3的方法，其中搖床轉(zhuǎn)速是200r/min，溫度為30°C，培養(yǎng)時間是1824h。5.權(quán)利要求1的方法，其中攪拌發(fā)酵罐中的間歇發(fā)酵的過程是在攪拌罐中投入5075%攪拌罐體積的間歇發(fā)酵培養(yǎng)基，在115°C下，高壓滅菌30min；在溫度降到30°C以下時，將搖瓶所得的菌種以110%體積比的菌種量接種到發(fā)酵罐中，以溫度3034°C，pH3.84.5，溶氧率10-500%，壓力0.020.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min的發(fā)酵條件發(fā)酵412h。6.權(quán)利要求1的方法，其中連續(xù)發(fā)酵是在間歇發(fā)酵后，pH下降趨勢略成緩慢，干菌濃度達到2023g/L時開始連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75、溫度3034°C、pH3.94.5、溶氧率10-500%、壓力0.020.05Mpa、攪拌轉(zhuǎn)速180400r/min。。7.權(quán)利要求1的方法，其中斜面培養(yǎng)基含30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵和25g/L瓊脂。8.權(quán)利要求1的方法，其中搖瓶培養(yǎng)基含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml/L的磷酸。9.權(quán)利要求1的方法，其中間歇發(fā)酵培養(yǎng)基含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml/L的磷酸。10.權(quán)利要求1的方法，其中補料培養(yǎng)基含2535g/L糖蜜、0.61.3g/L的硫酸鎂、0.61.3g/L的尿素、0.10.4g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.030.lg/L的NaCl和13ml/L的磷酸。全文摘要本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種攪拌罐連續(xù)培養(yǎng)高產(chǎn)核酸熱帶假絲酵母的核糖核酸的方法。其特征是采用誘變得到的保藏號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌株在斜面培養(yǎng)基中以28～31℃的條件下進行活化、再將菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)、將搖瓶所得菌種在攪拌發(fā)酵罐中先在間歇發(fā)酵培養(yǎng)基中進行間歇發(fā)酵，4～12h后在不斷加入補料培養(yǎng)基的情況下進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)、提取分離核糖核酸，即得。采用本發(fā)明的發(fā)酵方法適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，可以在20～3000L的發(fā)酵罐中生產(chǎn)，發(fā)酵液中干菌濃度可達20～23g/L，干菌種核糖核酸含量達12～14％。文檔編號C12N1/16GK101805771SQ201010105789公開日2010年8月18日申請日期2010年2月3日優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日發(fā)明者盧建祥,周長林,曹靜,林忠,王偉,邱蔚然,金由辛申請人:南通秋之友生物科技有限公司;中國藥科大學(xué)