專利名稱：：一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢子及構(gòu)建方法，具體是一種適用于轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788定性和定量PCR檢子及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：自1996年以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積以年均10%以上的速率增長(zhǎng)，2008年達(dá)到1.25億公頃。與轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化的蓬勃發(fā)展相對(duì)應(yīng)的，是各國(guó)民眾對(duì)其安全性的擔(dān)憂。為保障消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)，許多國(guó)家和地區(qū)都制訂了轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理制度，我國(guó)自2001年相繼頒布了一系列法律法規(guī)，對(duì)大豆、玉米等5類轉(zhuǎn)基因作物的17種產(chǎn)品實(shí)施強(qiáng)制性定性標(biāo)識(shí)。標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。目前主要有兩類技術(shù)一類基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一類基于蛋白質(zhì)方法，如ELISA、試紙條等，其中PCR方法應(yīng)用最廣。根據(jù)靶序列不同，PCR檢測(cè)策略分為4種，即篩查、基因特異性、構(gòu)建特異性、轉(zhuǎn)化體特異性。轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法以外源載體與受體植物基因組的連接區(qū)序列為檢測(cè)對(duì)象，具有品種特異性，已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法的首選。在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時(shí)，需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照來對(duì)檢測(cè)活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)控，特別是在定量PCR檢測(cè)中需要用含量準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因生物陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，由于專利權(quán)和現(xiàn)有技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)基因生物陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品很難獲得，這種現(xiàn)狀已成為檢測(cè)方法建立和應(yīng)用的瓶頸。因此亟需研制能夠替代轉(zhuǎn)基因生物陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的新型陽(yáng)性對(duì)照材料，以滿足不斷發(fā)展的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)需求。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的概念及應(yīng)用最早由日本學(xué)者Shindo等提出，相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在《JournalofAOACInternational》(國(guó)際官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志)2002年第85巻第5期1119-1126頁(yè)，文中介紹了利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子替代轉(zhuǎn)基因生物陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測(cè)的方法。近年來，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者報(bào)道了一些用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，例如張大兵等人于2007年構(gòu)建了適用于9種轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。然而，在對(duì)現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建的專利和文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建方法，以克服轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788轉(zhuǎn)化體特異性定性和定量PCR檢測(cè)中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的匱乏，滿足轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)需求。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于通過特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788基因組DNA中擴(kuò)增出大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列、M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，利用酶切、連接、轉(zhuǎn)化分子克隆技術(shù)將這3個(gè)片段依次構(gòu)建到質(zhì)粒載體pMD18-T中，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。—種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)檢索，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、轉(zhuǎn)基因大豆M0畫883'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin,是指大豆凝集素基因，在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)等特點(diǎn)。所述的轉(zhuǎn)基因大豆M0N897883'端轉(zhuǎn)化特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788外源載體3'端與大豆基因組連接區(qū)的DNA序列。所述的轉(zhuǎn)基因大豆M0N897885'端轉(zhuǎn)化特異性序列，是指轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788外源載體5'端與大豆基因組連接區(qū)的DNA序列。(2)根據(jù)lectin基因序列、M0N89788大豆的3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，設(shè)計(jì)定性PCR引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述的定性PCR引物，是指長(zhǎng)度為25士8nt的寡核苷酸鏈，與lectin基因或M0N89788大豆的3'端或5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列完全相同或者互補(bǔ)。所述的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，是指轉(zhuǎn)基因含量為100%的轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788籽粒。(3)分別回收lectin基因以及M0N89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的定性PCR產(chǎn)物。將lectin基因PCR回收產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體pMD18-T上獲得中間質(zhì)粒分子pMD-L。所述的中間質(zhì)粒分子，是指在構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5過程中，產(chǎn)生的一系列質(zhì)粒分子。(4)將中間質(zhì)粒載體pMD-L和M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列PCR回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切?；厥者@2種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得中間質(zhì)粒分子pMD-LM3。所述的雙酶切，是指在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩種限制性內(nèi)切酶和一種通用緩沖液，對(duì)同一個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)行酶切。(5)將中間質(zhì)粒分子pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列PCR回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切?；厥者@2種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列，是由SEQIDN01和SEQIDN02組成的引物對(duì)，擴(kuò)增M0N89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，是由SEQIDN03和SEQIDN04組成的引物對(duì)，擴(kuò)增M0N89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，是由SEQIDN05和SEQIDN06組成的引物對(duì)，擴(kuò)增M0N89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，包含SEQIDN07的序列。所述的定性PCR驗(yàn)證，是指用定性PCR方法驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5中能擴(kuò)增出與轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788相同的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin以及M0N89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，且pMD-LM3M5中特異性序列的檢測(cè)靈敏度能滿足定性PCR檢測(cè)的要求。所述的定量PCR驗(yàn)證，是指用定量PCR方法分析構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5中大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的檢測(cè)極限、定量極限以及重復(fù)性、重演性等特性，以鑒定該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的能力，進(jìn)而驗(yàn)證該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788樣品實(shí)際檢測(cè)中的有效性。本發(fā)明的有益效果利用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)首次構(gòu)建了含有大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin以及轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。本發(fā)明中提出該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以完全替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用于M0N89788大豆轉(zhuǎn)化體特異性定性和定量PCR檢測(cè)，很好地解決了M0N89788大豆檢測(cè)過程中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品匱乏的問題。該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在實(shí)際檢測(cè)中具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行實(shí)際樣品定量分析時(shí)，樣品檢測(cè)結(jié)果的偏差在國(guó)際上廣泛認(rèn)可的允許范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5完全適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788及其產(chǎn)品中M0N89788大豆轉(zhuǎn)化體成分的定性和定量PCR檢測(cè)。附圖為本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的示意圖。圖中，"pMD-18T"表示用于構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的載體；"BamHI"、"NcoI"、"EcoRI"分別表示存在相應(yīng)的酶切位點(diǎn)；"lectin"表示大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列；"M0N89788-3'"表示M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列；"M0N89788-5'"表示M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的構(gòu)建—、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788。二、試劑限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、Nco1購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pMD18-T載體、T4DNA連接酶及緩沖液、ExTaqDNA聚合酶及其緩沖液、dNTPs、DL2000Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DH5a感受態(tài)菌株購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；CTAB、Tris、EDTA等其他生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。三、主要儀器設(shè)備C1000型PCR儀(Bio-RadLaboratories,Inc.)Gel型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Inc.)ND1000紫外分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies,Inc.)其他儀器包括恒溫水浴鍋，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，微量移液器等。四、實(shí)驗(yàn)方法和過程1、引物設(shè)計(jì)通過GenBank查詢獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin;通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料和國(guó)內(nèi)外，獲得轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。根據(jù)獲得的序列信息，利用PrimerPremier5軟件，設(shè)計(jì)三對(duì)定性PCR引物，分別用于擴(kuò)增lectin基因、M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。lectin基因特異性序列擴(kuò)增引物由SEQIDN01和SEQIDN02組成，M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列擴(kuò)增引物由SEQIDN03和SEQIDN04組成，M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列擴(kuò)增引物由SEQIDN05和SEQIDN06組成。2、特異性序列擴(kuò)增2.1總DNA提取a、取適量植物樣品，在液氮中充分研磨，稱取80-150mg研磨好的樣品(不需研磨的可直接稱取)轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中；b、加入0.6mLCTAB提取液(15gL—1CTAB，50mmo1L—工Tris-HCl(pH8.0)，10,1L—1EDTA(pH8.0)，lmolL—1NaCl，7.5gL—1PVP)和50iigRNaseA，65。C孵育40min，期間顛倒混勻3-5次；c、加入0.6mL氯仿，顛倒混勻1-2min，12OOOrpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，重復(fù)本步驟1次；d、加入0.6倍體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫靜置10min，12OOOrpm離心10min，棄上清；e、加入lmL70%乙醇洗滌沉淀，12OOOrpm離心5min，棄上清；f、晾干，加入100iiL超純水溶解DNA沉淀。用ND1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，將DNA稀釋至50mgL—、備用。2.2PCR擴(kuò)增根據(jù)表1列出的引物，以M0N89788大豆基因組DNA為模板，進(jìn)行特異性序列擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序見表1、2。獲得424bp的lectin基因特異性序列，312bp的M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列以及420bp的M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。表1構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR反應(yīng)體系反應(yīng)試劑體積(nL)終濃度10xPCRBufferlx(50mmol丄-1KC1,10mmol'I/1Tris-HCl，pH8.3'1.5mmol.L"MgCl2)dNTPs4每種dNTP為200urnolU1上游引物1200nmol-L"下游引物1200nmolL4ExTaqDNA聚合酶0.251.25UDNA模板2100ng超純水補(bǔ)足至50nL表2構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的PCR反應(yīng)程序循環(huán)數(shù)溫度(°C)時(shí)間1945mill9430s355830s7240s17210min3、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建3.1中間質(zhì)粒分子pMD-L構(gòu)建按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書，回收lectin基因以及M0N89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的PCR產(chǎn)物。按照pMD18-T載體試劑盒說明書，將lectin基因特異性序列構(gòu)建到載體上獲得中間質(zhì)粒分子pMD-L，并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株。利用菌落PCR對(duì)重組菌株進(jìn)行鑒定，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取中間質(zhì)粒pMD-L。3.2中間質(zhì)粒分子pMD-LM3構(gòu)建將中間質(zhì)粒載體pMD-L和M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，用T4DNA連接酶連接獲得中間質(zhì)粒分子pMD-LM3。反應(yīng)體系見表3，16t:孵育12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株。利用菌落PCR對(duì)重組菌株進(jìn)行鑒定，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取中間質(zhì)粒pMD-LM3。表3構(gòu)建中間質(zhì)粒分子pMD-LM3的連接反應(yīng)體系_反應(yīng)試劑體積(iiL)_10X連接酶緩沖液1T4連接酶1pMD-L質(zhì)粒2M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列3超純水3_3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5構(gòu)建將中間質(zhì)粒載體pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。反應(yīng)體系見表4，16。C孵育12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株。利用菌落PCR對(duì)重組菌株進(jìn)行鑒定，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。通過測(cè)序分析確定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子中的外源序列與預(yù)期一致。表4構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的連接反應(yīng)體系_反應(yīng)試劑體積(iiL)_10X連接酶緩沖液1T4連接酶1pMD-LM3質(zhì)粒2M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列3超純水3_構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的簡(jiǎn)要圖譜如附圖所示。圖中"pMD-18T"表示用于構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的載體；"BamHI"、"NcoI"、"EcoRI"表示存在相應(yīng)的酶切位點(diǎn)；"lectin"表示大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列；"M0N89788-3'"表示M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列;"M0畫88-5'"表示M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。3段序列通過2次雙酶切和3次連接轉(zhuǎn)化依次構(gòu)建到pMD-18T載體上，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子經(jīng)測(cè)序分析，包含SEQIDN07的序列。實(shí)驗(yàn)例質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用—、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788。非轉(zhuǎn)基因大豆吉育84。其他轉(zhuǎn)基因材料大豆GTS40-3-2、A5547-127，玉米M0N810、M0N863、NK603、GA21，棉花M0N1445、M0N15985、M0N88913，油菜MS1、RF1、0xy235，甜菜H7-l。二、試劑2XMixTaqMan定量PCR試劑盒購(gòu)自吉林省標(biāo)新科技發(fā)展有限公司。TaqDNA聚合酶及其緩沖液、dNTPs、DL2000Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；CTAB、Tris、EDTA等其他生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；T叫Man探針和引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。三、主要儀器設(shè)備7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems.)C1000型PCR儀(Bio-RadLaboratories,Inc.)Gel型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Inc.)ND1000紫外分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies,Inc.)其他儀器包括恒溫水浴鍋，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，微量移液器等。四、實(shí)驗(yàn)方法和過程1、DNA提取1.1植物基因組DNA提取a、取適量植物樣品，在液氮中充分研磨，稱取80-150mg研磨好的樣品(不需研磨的可直接稱取)轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中；b、加入0.6mLCTAB提取液(15gL—1CTAB，50mmo1L—工Tris-HCl(pH8.0)，10,1L—1EDTA(pH8.0)，lmolL—1NaCl，7.5gL—1PVP)和50iigRNaseA，65。C孵育40min，期間顛倒混勻3-5次；c、加入0.6mL氯仿，顛倒混勻1-2min，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，重復(fù)本步驟1次；d、加入0.6倍體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫靜置10min，12OOOrpm離心10min，棄上清；e、加入lmL70%乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min，棄上清；f、晾干，加入100iiL超純水溶解DNA沉淀。1.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5DNA提取a、將37。C培養(yǎng)12h的1-5mL菌液于10000rpm離心30s，徹底棄上清;b、按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA。1.3DNA濃度測(cè)定與稀釋a、取3iiLDNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判斷DNA完整性；b、用ND1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度；c、用超純水將植物基因組DNA稀釋至50mgL—、4"C保存?zhèn)溆?；d、根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA初始濃度和大小，用0.1XTE緩沖液將其依次稀釋成106、105、104、103、102、10禾卩l(xiāng)copyyL—、4。C保存?zhèn)溆谩?、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5在定性PCR檢測(cè)中的應(yīng)用通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、M0N89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測(cè)方法。PCR反應(yīng)體系和程序見表6、7。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5(106copyiiL—0、轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788、非轉(zhuǎn)基因大豆吉育84和其他轉(zhuǎn)基因材料的DNA為模板進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，判斷質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子用于定性PCR檢測(cè)的特異性。以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾口lcopy*PL—1)為模板進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，判斷質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子用于定性PCR檢測(cè)的靈敏度。表6pMD-LM3M5用于定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系反應(yīng)試劑體積(nL)終濃度10xPCRBuffer2.5lx(50mmol.L"KCl，10mmol-I/1Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol'L-1MgCl2)dNTPs2每種dNTP為200nmol-I/1上游引物0.5200歸ol.L-1下游引物0.5200nmol-L—1TaqDNA聚合酶0.1250.625UDNA模板1超純水補(bǔ)足至25表7pMD-LM3M5用于定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序循環(huán)數(shù)溫度(°C)時(shí)間1945min9430s355830s7230s17210min3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5在定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用3.1pMD-LM3M5用于定量PCR檢測(cè)的檢測(cè)極限和定量極限通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR檢測(cè)方法。PCR反應(yīng)體系和程序見表8、9。以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、10J、103、102、10禾口lcopy*iiL—0為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次，根據(jù)定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增熒光信號(hào)間的線性關(guān)系，確定利用構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PMD-LM3M5替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，M0N89788大豆轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)極限(LOD)和定量極限(LOQ)。表8pMD-LM3M5用于定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系反應(yīng)試劑體積(HL)終濃度2xMix10lx上游引物0.5250nmol'L"下游引物0.5250nmol-L"TaqMan探針0.4200,1-L"DNA模板1超純水補(bǔ)足至25nL表9pMD-LM3M5用于定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.2應(yīng)用pMD-LM3M5對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788樣品的定量分析根據(jù)利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5建立的M0N89788大豆特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788樣品(轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、1%和0.5%)進(jìn)行分析，確定構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5是否適用于實(shí)際樣品中轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788的定量檢測(cè)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5在定性PCR檢測(cè)中的特異性和靈敏度利用相關(guān)文獻(xiàn)資料的方法，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5(106COpyyL—0、轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788、非轉(zhuǎn)基因大豆吉育84和其他轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行定性PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在pMD-LM3M5和M0N89788大豆中均能擴(kuò)增出lectin基因、M0N89788大豆3'端禾P5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，在非轉(zhuǎn)基因大豆吉育84和其他轉(zhuǎn)基因大豆中僅能擴(kuò)增出lectin基因特異性序列，其他轉(zhuǎn)基因材料中沒有擴(kuò)增出任何產(chǎn)物，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5與轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品具有等效的特異性。以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾口lcopyiiL-0為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在pMD-LM3M5濃度為10copyyL-1及以上的樣品中均能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出lectin基因、M0N89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的定性PCR檢測(cè)靈敏度可達(dá)10copy。說明本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5可替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用于M0N89788大豆定性PCR檢測(cè)。2、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5在定量PCR檢測(cè)中的檢測(cè)極限和定量極限利用相關(guān)文獻(xiàn)資料的方法，對(duì)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的DNA樣品(106、105、104、103、102、10禾3lcopyyL—0進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5的lectin基因和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的定量PCR檢測(cè)LOD均為1個(gè)拷貝，LOQ為10個(gè)拷貝，且具有很好的重復(fù)性和重演性。以濃度為106、105、104、103、102和10copyiiL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5為標(biāo)準(zhǔn)品建立lectin基因和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，斜率在-3.1-3.6之間，具有很好的線性關(guān)系，說明本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5可替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用于M0N89788大豆及其產(chǎn)品的定量PCR檢測(cè)。3、應(yīng)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788樣品的定量分析根據(jù)利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5建立的lectin基因和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0.5%和0.1%的3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788樣品進(jìn)行定量分析，定量分析結(jié)果顯示3個(gè)樣品的含量分別為1.22%、0.55%和0.12%，與真實(shí)值的偏差分別為22%、10%和20%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.020.20之間。結(jié)果表明利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5對(duì)實(shí)際樣品分析的結(jié)果比較準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果的偏差在國(guó)際上廣泛認(rèn)可的0-25%范圍內(nèi)，表明本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5可替代轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，完全適用于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR分析和檢測(cè)。權(quán)利要求一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于通過特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆MON89788基因組DNA中擴(kuò)增出大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列、MON89788大豆3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列和5′端轉(zhuǎn)化體特異性序列，利用酶切、連接、轉(zhuǎn)化分子克隆技術(shù)將這3個(gè)片段依次構(gòu)建到質(zhì)粒載體pMD18-T中，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。2.權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、轉(zhuǎn)基因大豆M0N897883'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列；(2)根據(jù)lectin基因序列、MON89788大豆的3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，設(shè)計(jì)特異性定性PCR引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)分別回收lectin基因以及MON89788大豆3'端和5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的定性PCR產(chǎn)物，將lectin基因PCR回收產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體pMD18-T上獲得中間質(zhì)粒分子pMD-L;(4)將中間質(zhì)粒分子pMD-L和M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列PCR回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切，回收這2種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得中間質(zhì)粒分子pMD-LM3;(5)將中間質(zhì)粒分子pMD-LM3和M0N89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列PCR回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶Ncol和EcoRI分別進(jìn)行雙酶切，回收這2種酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。3.權(quán)利要求l所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列，是由SEQIDN01和SEQIDN02組成的引物對(duì)，擴(kuò)增M0N89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。4.權(quán)利要求1所述的M0N89788大豆3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，是由SEQIDN03和SEQIDN04組成的引物對(duì)，擴(kuò)增MON89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。5.權(quán)利要求l所述的MON89788大豆5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，是由SEQIDN05和SEQIDN06組成的引物對(duì)，擴(kuò)增M0N89788大豆獲得的擴(kuò)增子序列。全文摘要一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建方法，所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子包含大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin特異性序列、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列和5′端轉(zhuǎn)化體特異性序列。通過設(shè)計(jì)特異性定性PCR引物，擴(kuò)增獲得lectin基因特異性序列、MON89788大豆的3′端和5′端轉(zhuǎn)化體特異性序列；通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)將上述3個(gè)特異性序列片段構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒分子中獲得人工重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-LM3M5。經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明中構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以完全替代轉(zhuǎn)基因大豆MON89788陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，適用于對(duì)MON89788大豆的轉(zhuǎn)化體特異性定性和定量PCR分析和檢測(cè)。文檔編號(hào)C12N15/66GK101775440SQ201010106138公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年2月5日優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日發(fā)明者劉娜,夏蔚,宋新元,康嶺生,張明,李蔥蔥,李飛武,董立明,趙寧,邢珍娟,邵改革申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院