專利名稱：豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體地說是一種豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵
衣藻制氫產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
光合生物制氫是未來清潔能源可持續(xù)生產(chǎn)的重要途徑之一，包括萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)在內(nèi)的許多微型綠藻和藍(lán)藻可以在缺氧的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞 內(nèi)的氫酶(H2ase)基因表達(dá)，將光合作用中產(chǎn)生的H+和e—合成H2，釋放到細(xì)胞外，生物制氫 是利用太陽能生產(chǎn)氫氣的理想模式。萊茵衣藻生長速度快，培養(yǎng)成本低，氫酶活性高，是很 有開發(fā)潛力的微藻光合制氫藻種。但是，氫酶對(duì)氧氣極其敏感，很容易受氧氣的抑制而失去 活性，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物，這一對(duì)矛盾限制了衣藻產(chǎn)氫技術(shù)的應(yīng)用。為了 提高衣藻光合產(chǎn)氫的效率，需要盡可能的降低衣藻細(xì)胞內(nèi)的氧氣含量或者提高氫化酶的氧 耐受性。目前降低衣藻細(xì)胞內(nèi)的氧氣含量的辦法是通過抑制光合系統(tǒng)II(PS II)活性進(jìn)而 抑制光解水放氧來實(shí)現(xiàn)，但是該方法同時(shí)抑制了光合鏈電子傳遞效率，影響了衣藻的產(chǎn)氫 效率，另一方面，缺氧條件下衣藻的生長也受到嚴(yán)重抑制，最終也影響產(chǎn)氫效率。
豆科植物根瘤中的固氮酶與氫酶有相似的特性，也對(duì)氧氣敏感，但是根瘤中的固 氮酶卻有很高的固氮活性，這與根瘤細(xì)胞中含有大量的豆血紅蛋白(leghemoglobin，簡(jiǎn)稱 Lb)有密切關(guān)系。豆血紅蛋白有兩個(gè)亞基構(gòu)成，一個(gè)是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一 個(gè)是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成，兩個(gè)亞基結(jié)合成為有活性的豆血紅蛋白。豆血紅蛋 白具有與氧氣可逆結(jié)合、降低細(xì)胞內(nèi)氧濃度和調(diào)節(jié)呼吸作用的特性，既能維持根瘤細(xì)胞內(nèi) 較低的氧氣含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中國專利200380107352. 7肯 和02138702. 8分別公開了利用表達(dá)豆血紅蛋白改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量和提高植物抗?jié)?能力。生物發(fā)酵工程研究中也有應(yīng)用其它血紅蛋白體外重組表達(dá)而使產(chǎn)量提高的報(bào)導(dǎo)。
在植物細(xì)胞內(nèi)、尤其是葉綠體中，血紅素輔基前體可以通過葉綠素合成途徑合成， 只是在最后一步，植物葉綠體中，原撲啉在鎂螯合酶的作用下生成葉綠素。在根瘤細(xì)胞中， 原撲啉在根瘤菌合成的亞鐵螯合酶(ferrochelatase)催化下合成血紅素輔基(Sangwan 和0' Brain， 1991 ;Santana等，1998)。在植物細(xì)胞內(nèi)沒有亞鐵螯合酶基因hemH，但是在植 物細(xì)胞中存在著具有與亞鐵螯合酶相似功能和相似結(jié)構(gòu)的吡啶核苷酸雙硫酸氧化還原酶 (pyridine-nucleotide disulfide oxidoreductase)蛋白酶家族，會(huì)g合成與血紅素輔基有 相似功能的蛋白。本發(fā)明的前期工作表明，單獨(dú)在萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白的 球蛋白亞基基因lba可以降低培養(yǎng)體系內(nèi)的氧氣含量和使產(chǎn)氫量提高約50 % 。為了進(jìn)一步 提高萊茵衣藻的產(chǎn)氫能力，本發(fā)明將來源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium J即onicum) 的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和來源于大豆(Glycine max)根瘤的豆血紅蛋白球蛋 白亞基基因lba轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達(dá)，解決衣藻產(chǎn)氫代謝過程中需要盡量降低細(xì) 胞內(nèi)氧氣含量、保障細(xì)胞內(nèi)低氧環(huán)境又要盡量保證其正常代謝的難題。本發(fā)明人曾發(fā)明 大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量的方法(中國專利201010107922. 4)，為了更進(jìn)一步提高萊茵衣藻生物制氫產(chǎn)量，本發(fā)明將來源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium J即onicum)的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因和來源于大豆(Glycine max)根瘤的豆血紅蛋 白球蛋白亞基基因lba轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達(dá)，萊茵衣藻制氫產(chǎn)量得到顯著提高， 取得了出人意料之外的效果。本發(fā)明首次利用豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的 葉綠體內(nèi)具有新穎性和創(chuàng)造性；本發(fā)明解決了衣藻產(chǎn)氫代謝過程中保證其正常代謝的技術(shù) 難題，具有實(shí)用性。隨著生物制氫技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明將愈發(fā)顯現(xiàn)出越來越大的實(shí)用性和重 要性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因，更好的提高萊茵衣
藻和各種微藻制氫產(chǎn)量的技術(shù)方法。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法，步驟如下
(1)萊茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)
A、選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849 ;
B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種 (a)萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件溫度25 ± 1°C ;日光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光 量子/平方米 秒(y mol photons m—2s—0 ;50 100ml三羥甲基氨基甲烷_乙酸_磷酸 鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡(jiǎn)稱TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天1 %接種繼代培養(yǎng)； (b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5% ;挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線 方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次； C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、 硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對(duì) 數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在 缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條 件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 100微摩爾光量子/平方 米 秒(ii molphotons m—2s—0 ，溫度25±1°C ;每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；
D、慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)條件用pH 7. 2的酵母提取液_甘露醇液體培養(yǎng)基，溫度 28士rC、黑暗條件下200rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長期，吸光度0D6。。值達(dá)到0. 6_0. 8， 1%接種繼代；E、用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩5 X 1/8 (0D)，柱長2m，內(nèi)徑3mm，熱 導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C ，進(jìn)樣溫度200°C ，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C ;
(2)豆血紅蛋白hemH基因和lba基因的克隆A、取序列號(hào)M92427慢生大豆根瘤茵hemH基因和序列號(hào)V00453大豆lba基因；
B、分別提取慢生大豆根瘤菌的總DNA，提取大豆的總RNA，再對(duì)大豆總RNA進(jìn)行濃 度和純度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; C、分別克隆hemH基因和lba基因；反應(yīng)條件為94"預(yù)變性5min， 一個(gè)循環(huán)；94°C 變性lmin，62。C退火30s，72。C延伸1. 5min ;共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸15min ;反應(yīng)產(chǎn)物純化
C、測(cè)序鑒定hemH基因、lba基因的特異性引物
hemH基因的特異性引物為 hemH-Pl :5， - GC6^CO^^gggaggg; atgtcgaccgccgctc-3'，斜體表示SacII酶切
位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序列； hemH-P2 :5，-^C6KKT6Wctatatccagccctggagctcgcg-3，，斜體表示SacII酶切位 點(diǎn)序列； lba基因的特異性引物為 Lba-Pl :5， _c卵《ctcagggaggg aaa ttt aaa ttt atg gtt get ttc
actgag-3'，斜體表示Small酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序 列； Lba-P2 :5， -tec CCC敘g ata cta att atg cct tct taa tag c-3，，斜體表示 Sacl酶切位點(diǎn)序列； (3)萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建 A、用限制性內(nèi)切酶Small和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和載體cg40， 將純化的lba基因片段通過上述酶切位點(diǎn)用T4 DNA連接酶連接質(zhì)粒cg40中的aadA基因， 形成aadA-lba融合基因，得到載體cg401-l-lba ;用SacII酶切位點(diǎn)將hemH基因用T4 DNA 連接酶連入到質(zhì)粒cg401-l-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba 融合蛋白，構(gòu)建得到衣藻葉綠體表達(dá)載體cg401-l-hemH-lba ;轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，用于保 存、鑒定和大量制備質(zhì)粒DNA ;
(4)萊茵衣藻葉綠體的轉(zhuǎn)化A、取100ml對(duì)數(shù)期中后期的萊茵衣藻，25 °C下3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞， 用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米 秒 (iimol photons *m—2 s—0和25± TC條件下培養(yǎng)24小時(shí)；用基因搶轟擊轉(zhuǎn)化；真空 度9. 48192 X 104Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7. 584236 X 106Pa，金粉子彈經(jīng)限制性內(nèi)切酶 EcoRI酶切質(zhì)粒cg401-l-hemH-lba DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1. 0微米；
B、轉(zhuǎn)化后的衣藻在光照和25± rC條件下，過渡培養(yǎng)18h，用TAP液體培養(yǎng)基沖洗， 涂布于含壯觀霉素lOOii g/ml的TAP固體選擇培養(yǎng)基上，在25士rC和100微摩爾光量子/ 平方米 秒(P mol photons m—2 s—0的連續(xù)光照條件下，培養(yǎng)約7 15天；取有抗性的 單藻落分別在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)；分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量；
(5)分析轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表達(dá)
A、 hemH-lba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測(cè) a、hemH基因和lba基因通過同源重組交換整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上，以轉(zhuǎn)基 因衣藻總DNA為模板的PCR產(chǎn)物為8229bp ;未整合的PCR產(chǎn)物是5400bp ;與萊茵衣藻葉綠 體DNA結(jié)合的引物是cpDNA-Pl :5， _aga cag cca aca ttt tgtta-3' ;cpDNA_P2 :5， -get tea aaa aca aaa tea aa_3 ^ b、取對(duì)數(shù)生長后期的衣藻培養(yǎng)液，4t:低速離心收集，加350 ii 1 NET重懸沉淀；加 入25iU 10mg/ml的蛋白酶K及25iU 20% SDS，混勻37。C水浴12小時(shí)，冰上冷卻；加入200 ill 5mol/L KAc，靜置離心；上清中加入等體積25 : 24 : 1的酚/氯仿/異戊醇溶液 抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無水乙醇沉淀和70%乙醇洗滌，干燥后溶 于30 ill TE緩沖液，用于PCR檢測(cè)； B、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞；提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA ;利用hemH基因和lba基因的特異性引物和克隆hemH基因和lba基因所 述的PCR條件擴(kuò)增，進(jìn)行hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)；
C、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中亞鐵螯合酶和Lba表達(dá)量的檢測(cè) a、按下列配比制備蛋白提取緩沖液50mM Tris/HCl pH 8.3 plus l%Triton_X 100 ;上樣緩沖液0. 25M Tris-HCl， pH 8. 0 ;25 % glycerol ;7. 5 % SDS ;0. 25mg ml_l bromophenolblue ;12. 5% (v/v) 2-merc即toethano1 ;b、取產(chǎn)氫培養(yǎng)的萊茵衣藻培養(yǎng)液，快速室溫3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用
250 iU蛋白提取緩沖液懸浮，加入2iU P-巰基乙醇，液氮凍融三次；4t:條件下離心
20min ;取200 iU蛋白上清液加入100 yl上樣緩沖液，用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)
行凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜；分別用抗豆血紅蛋白亞鐵螯合酶多克隆抗體和抗大豆Lba多克隆
抗體做性免疫雜交檢測(cè)，對(duì)HRP標(biāo)記的抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)； (6)分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長的影響 A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度；B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95%乙醇溶液，混合均勻，
室溫避光放置20min，4。C下12000rpm離心10min ;取上清，測(cè)定0D665及0D649的吸光值； C、計(jì)算總?cè)~綠素的含量，單位mg/L :葉綠素Chi (mg/1)=
20. 04X0D649+6. 10X0D665 ; (7)分析豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)的耗氧量和產(chǎn)氫量的影 響 A、缺硫培養(yǎng)基中耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)
B、含硫培養(yǎng)基中耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)。 本發(fā)明的要點(diǎn)是豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基因lba在萊茵 衣藻產(chǎn)氫中的應(yīng)用及其實(shí)施方法。 本發(fā)明過程中通過研究發(fā)現(xiàn)，豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基 因lba在萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá)以后，使轉(zhuǎn)基因衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中的氧氣含量較快速 度降低，并維持在較低的氧氣含量水平，使產(chǎn)氫量提高4倍左右。這種結(jié)果及其用途是人們 在生物制氫領(lǐng)域一直尋求而沒有想到的。 本發(fā)明提供了一個(gè)在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和 球蛋白亞基基因lba的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。 按照本發(fā)明，葉綠體中表達(dá)了豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基 因lba的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量明顯降低，產(chǎn)氫量明顯提高。
在本發(fā)明中，豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH來源于慢生大豆根瘤菌，該基因的 核苷酸序列和氨基酸序列是已知的，其基因庫(NCBI GenBank)序列號(hào)是M92427。豆血紅 蛋白球蛋白亞基基因lba來源于大豆，該lba基因的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的，其NCBI GenBank基因庫序列號(hào)是V00453。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過基因序列中的數(shù)據(jù)信 息進(jìn)行檢索得到該hemH和lba基因的信息。本發(fā)明優(yōu)選具有該序列號(hào)信息所示的核苷酸 序列，更優(yōu)選的是編碼具有該序列號(hào)信息所示的氨基酸序列的基因。在本發(fā)明的具體實(shí)例 中，特別提到的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基因lba分別克隆于慢生大 豆根瘤菌的DNA和大豆根瘤的cDNA。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，可以直接從慢生大 豆根瘤菌中提取DNA，然后用PCR方法克隆用于本發(fā)明的hemH基因；從大豆根瘤細(xì)胞中提 取mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用PCR方法克隆用于本發(fā)明的lba基因?？蛇x擇地、根據(jù)已 知的核苷酸序列和氨基酸序列合成該基因。可選擇地、利用已有的含有該基因的質(zhì)粒中提 取該目的基因。 在本發(fā)明中，表達(dá)載體除了上面特別提到的豆血紅蛋白hemH基因和lba基因，還 包括啟動(dòng)子、終止子，選擇性標(biāo)記基因、增加轉(zhuǎn)錄和表達(dá)穩(wěn)定性的基因片段以及能夠使目的 基因整合到宿主細(xì)胞DNA上并穩(wěn)定表達(dá)的基因片段等，這些都是在植物和藻類轉(zhuǎn)基因工作 中常用的基因表達(dá)元件。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，用于豆血紅蛋白hemH基因和lba基因的 表達(dá)載體包括psbB啟動(dòng)子和終止子、3' -rbcL轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性增強(qiáng)元件、aadA篩選性標(biāo)記基因 和幫助該表達(dá)載體整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上的含atpB基因序列的cpDNA-l序列區(qū)域 和cpDNA-2序列區(qū)域。 本發(fā)明提供的啟動(dòng)子、終止子、增加轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的基因片段和幫助目的基因整合 到葉綠體DNA上的基因片段的種類不受限制，只要能夠在豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba 基因?qū)氩⒄系饺R茵衣藻葉綠體DNA上并能將該基因穩(wěn)定表達(dá)就可以。優(yōu)選是psbB啟 動(dòng)子和終止子、3'-rbcL基因序列以及含atpB基因序列的基因序列片段等萊茵衣藻葉綠體 內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控元件。 本發(fā)明指的轉(zhuǎn)化包括基因槍轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法，更優(yōu)選的是基因槍轉(zhuǎn)化法。在 利于表達(dá)載體導(dǎo)入的條件下，用包被表達(dá)載體DNA的金粉轟擊衣藻細(xì)胞，將含有包括豆血 紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基因lba的表達(dá)載體導(dǎo)入萊茵衣藻細(xì)胞的葉綠 體中。 本發(fā)明通過抗生素的選擇性篩選出表達(dá)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶和Lba的轉(zhuǎn)基因 萊茵衣藻，并進(jìn)一步在抗生素平板上多次繼代培養(yǎng)，增加目的基因在轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻葉綠 體DNA中的整合率；篩選出產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量低、產(chǎn)氫量高的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻單克 隆。 本發(fā)明表達(dá)理解為將起始DNA或RNA的遺傳信息轉(zhuǎn)移至基因產(chǎn)物多肽或蛋白質(zhì) 中，即本發(fā)明中的豆血紅蛋白亞鐵螯合酶和球蛋白亞基。 本發(fā)明轉(zhuǎn)基因理解為將遺傳信息轉(zhuǎn)移至生物體，特別是萊茵衣藻。這意味著包括 引入所有對(duì)熟練工作人員所公知信息的方法，例如粒子轟擊、電穿孔、化學(xué)介導(dǎo)或農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的攝入、顯微注射等。遺傳信息可引入細(xì)胞，例如以DNA、RNA、質(zhì)?；蛞匀魏纹渌绞?，并 且通過重組摻入宿主基因組的方式。為了本發(fā)明目的順利實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻是經(jīng)過遺 傳修飾的萊茵衣藻。 本發(fā)明通過使用在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球 蛋白亞基lba基因，使萊茵衣藻的產(chǎn)氫能力提高。 本發(fā)明所述的在其葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基lba基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，其分類命名為萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) cg401_l_hemH_lba。 本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) cg401-l-hemH-lba，其密閉培養(yǎng)體系中的氧氣含量下降地明顯比未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的快， 并且氧氣含量能維持較低水平，產(chǎn)氫量明顯增加。 本發(fā)明所述的方法也適用于包括萊茵衣藻在內(nèi)的其它微型綠藻和藍(lán)藻產(chǎn)氫能力 的提高。 本發(fā)明指出了豆血紅蛋白基因不曾發(fā)現(xiàn)的和記載的新性能和用途；特別指出了豆 血紅蛋白亞鐵螯合酶基因?qū)τ谔岣呷R茵衣藻產(chǎn)氫量的用途；本發(fā)明提供了一種降低綠藻產(chǎn) 氫培養(yǎng)體系中氧氣含量和提高產(chǎn)氫量的新方法；提供了一個(gè)在葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白 hemH基因和lba基因的和產(chǎn)氫量增加的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻種。 本發(fā)明目的生物體是更多具有光合活性的產(chǎn)氫微藻和需要呼吸提供能量產(chǎn)氫的 微藻或微生物，如微型綠藻、藍(lán)藻、光合細(xì)菌。優(yōu)選的藻類是微型綠藻如萊茵衣藻和藍(lán)藻如 集胞藻屬(Synechocystis)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn) 1、本發(fā)明方法顯著降低綠藻產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量。
2、本發(fā)明能夠顯著提高生物產(chǎn)氫量。
3、本發(fā)明方法適用于各種產(chǎn)氫綠藻和藍(lán)藻。 本發(fā)明在世界上首次將豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因應(yīng)用于萊茵衣藻及其它各種 產(chǎn)氫微藻，使得產(chǎn)氫微藻產(chǎn)氫量得到顯著的提高，取得了出人意料的效果，具有新穎性、創(chuàng) 造性和實(shí)用性。本發(fā)明方法利用轉(zhuǎn)基因的方法取得了生物制氫技術(shù)的突破；是制備人類迫 切需要的氫氣能源的突破；本發(fā)明對(duì)未來的生物技術(shù)、能源技術(shù)和環(huán)境技術(shù)的發(fā)展都具有 不可忽視的重大影響。


圖1為萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體cg401-l-hemH-lba主要基因元件結(jié)構(gòu)圖。
圖2為萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體cg40-l-l-hemH-lba的酶切鑒定電泳圖。圖 中l(wèi)為分子標(biāo)記AHindIII圖；2為質(zhì)粒cg40-l-l-lba DNA經(jīng)SacII酶切圖；3為質(zhì)粒 cg40-l-l-hemH-lba DNA經(jīng)SacII酶切圖；4為分子標(biāo)記DL2000。 圖3為葉綠體轉(zhuǎn)化hemH-lba基因的萊茵衣藻在含lOOmg. L_l壯觀霉素的TAP平 板上篩選圖。圖A為陰性對(duì)照組未轉(zhuǎn)基因的萊茵衣藻849 ;圖B為陽性對(duì)照組轉(zhuǎn)化載體 cg401-l的萊茵衣藻；圖C為轉(zhuǎn)化lba基因的萊茵衣藻。 圖4為萊茵衣藻葉綠體中轉(zhuǎn)化hemH基因和lba基因的PCR鑒定圖。圖A為以總 DNA為模版的PCR電泳圖。其中l(wèi)為分子標(biāo)記AHindIII ;2為不含模版的陰性對(duì)照組；3為 未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻；4為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻；圖B為以cDNA為模版的PCR電泳圖其中1為分 子標(biāo)記DL2000 ;2和4為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻；3和5為未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。
圖5為對(duì)葉綠體中轉(zhuǎn)化hemH和lba基因的萊茵衣藻中hemH表達(dá)量進(jìn)Western Blot檢測(cè)圖。前一組數(shù)字0、3、5、6和7分別指轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻開始進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)的天數(shù)； 后一組數(shù)字3和5分別指陰性對(duì)照組未轉(zhuǎn)基因的萊茵衣藻開始進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)的天數(shù)。
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圖6為葉綠體中轉(zhuǎn)化hemH和lba基因的萊茵衣藻與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻849的生 長情況的比較圖。 圖7為葉綠體中轉(zhuǎn)化hemH和lba基因的萊茵衣藻與未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻849在培 養(yǎng)基中分別含0， 12. 5， 25和50i！ M硫酸鹽的產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下耗氧量和產(chǎn)氫量的比較圖。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 : 萊茵衣藻和慢生大豆根瘤菌及其培養(yǎng) 因?yàn)槿R茵衣藻生長速度快、培養(yǎng)成本低、氫化酶活性高，所以是微藻光合制氫的代 表物種。為了使轉(zhuǎn)基因容易操作，本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞壁缺欠型的萊茵衣藻藻種cc849。
①萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件按照Harris主編的《The ChlamydomonasSourcebook : a comprehensive guide to biology and laboratory use.New York :Academic Press. 1989》，優(yōu)選條件25±1°C，日光燈光照強(qiáng)度(100 200 ii molphotons m—2s—0 ;液體 培養(yǎng)是在50 100ml Tris-Acetate-Phosphate (TAP)培養(yǎng)基，初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速 100 130rpm，每5 6天1%接種繼代培養(yǎng)；固體平板培養(yǎng)基(TAP)含1. 5%的瓊脂粉，藻 種的保存和純化是挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上，每3周繼代 一次。 ②萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件按照Melis等(Plant Physiology. 2000， 122 : 127-136)的方法，萊茵衣藻的產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)基(TAP-S)中進(jìn)行。缺硫培養(yǎng)基 (TAP-S)是把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾濃度 的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅。本發(fā)明為了將來在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，有目的的簡(jiǎn)化 了其產(chǎn)氫培養(yǎng)的操作步驟即將生長至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收 集藻細(xì)胞并用TAP-S培養(yǎng)基洗3次，然后懸浮在TAP-S或者含有不同濃度硫酸鹽的TAP-S 培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在50ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞塞緊培養(yǎng) 瓶密閉培養(yǎng)。放在黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 lOOiimol photons m—2s—、溫度25± 1°C 。每24小時(shí)用微量氣密進(jìn)樣器抽取瓶中氣體，進(jìn)行 氣體成分和含量檢測(cè)。 ③慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)條件按照Regensburger等(Arch. Microbiology. 1986， 144:355-366)的方法，用YEM(yeast extract-mannitol) (pH 7. 2)液體培養(yǎng)基，在黑暗條 件下、溫度28± 1°C 、200rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度0D6。。值達(dá)到0. 6_0. 8 (即對(duì)數(shù)生長期) 時(shí)，1%接種繼代。 ④按照冉春秋等(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2006， 27 :62-66.)的方法用GC測(cè)定氫氣和 氧氣含量。氣相色譜儀為Agilent Technologies GC 7890A, USA，分子篩5 X 1/8 (0D)，柱 長2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣。進(jìn)樣體積0. 5ml，柱溫5(TC，進(jìn)樣溫度 20(TC，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300°C。用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的外標(biāo)法計(jì)算氫氣和氧氣體積。
實(shí)施例2 : 豆血紅蛋白hemH基因和lba基因的克隆 通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)以及所用試劑盒制造商的產(chǎn)品說明書(QIAGEN , Promega )分別提取慢生大豆根瘤菌的總DNA和提取大豆的總RNA，再 對(duì)大豆總RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體地當(dāng)慢生大豆根瘤菌液的0D6。。 為0. 6-0. 8時(shí)，取10ml菌液，4。C下10000rpm離心15min，收集菌細(xì)胞，用400 y 1TE溶菌， 加40ii 110% SDS和Proteinase K(20mg/ml)，然后56。C水浴45min，加400 ii 1苯酚，4。C下 10000rpm離心10min，上清液分別用酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)抽提2次、用氯仿 抽提1次，無水乙醇沉淀總DNA，溶于30 ii L TE緩沖液。取lg大豆根瘤細(xì)胞，按照QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit試劑盒制造商說明書提取大豆的總RNA，其濃度和純度用紫外分光 光度法檢測(cè)。并用DNase I (Fermentas ) 37。C水浴30min，去除RNA中混雜的DNA ;然后 加入25mMEDTA， 65。C水浴10min，終止DNase I的活性。單鏈cDNA的合成是按照Promega AMV RT protocol制造商說明書進(jìn)行在25 反應(yīng)體系中含2 y g的總RNA禾P 1 y g Radom Primer, 37。C水浴60min。 本發(fā)明根據(jù)NCBI GenBank中慢生大豆根瘤菌hemH基因(序列號(hào)M92427)和大豆
lba基因(序列號(hào)V00453)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，并在引物前分別添加相應(yīng)的特異
性限制內(nèi)切酶位點(diǎn)序列，用ExTag進(jìn)行PCR反應(yīng)分別克隆hemH基因和lba基因。hemH基因
和lba基因可共用PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94"C變性lmin，62t:退火
30s，72。C延伸1. 5min ;共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸15min。 PCR產(chǎn)物分別用QIAGEN試劑盒純化
回收，并測(cè)序鑒定正確性。 hemH基因的特異性引物如下 hemH-Pl :5， - G"C(7GCC( Clagggagggl atgtcgaccgccgctc-3，，斜體表示SacII 酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序列。 hemH-P2 :5' _ GCGGCC( C ctatatceagccctggagctcgcg-3'，斜體表示SacII酶 切位點(diǎn)序列。 lba基因的特異性引物如下 Lba-Pl :5' _cCfeagggaggg aaa ttt aaa ttt atg gtt get ttc act
gag-3'，斜體表示Smal I酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序列。
Lba-P2 :5'-tccCCCg欲ata cta att atg cct tct taa tag c-3'，斜體表示Sacl 酶切位點(diǎn)序列。
實(shí)施例3 : 萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建 通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)禾口 Vaistij等對(duì)萊茵衣藻口十 綠體表達(dá)載體cg40描述的方法(The Plant Journal, 2000， 21 (5) :469-482)進(jìn)行載體構(gòu) 建。分別用限制性內(nèi)切酶Small和Sacl來酶切上述克隆得到的大豆lba基因片段和載體 cg40，將純化的lba基因片段通過上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)用T4 DNA連接酶連接在質(zhì)粒cg40中 的aadA基因之后形成aadA-lba融合基因，得到載體cg401-l-lba，再用SacII酶切位點(diǎn)將 hemH基因用T4 DNA連接酶連入到質(zhì)粒cg401-l_lba中aadA基因之后和lba基因之前，形 成aadA-hemH-lba融合蛋白，構(gòu)建得到衣藻葉綠體表達(dá)載體cg401-l-hemH-lba(圖1)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5a ，用于保存、鑒定(圖2)和大量制備質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例4 : 萊茵衣藻葉綠體的轉(zhuǎn)化 通過Boynton等(Science, 1988， 240 (4858) :1534-1538)的方法對(duì)萊茵衣藻 葉綠體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。取100ml生長至對(duì)數(shù)期中后期(約4 5X106)的萊茵衣藻，25t:下 3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上，在光照 lOO踐ol m—2 s—1和25士TC條件下培養(yǎng)1天，用基因搶(BioRad ， Model :PDS1000/He Biolistic particle delivery system)進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化。參數(shù)為真空度9. 48192X 104Pa， 轟擊距離9cm，氦氣壓力7. 584236 X 106Pa，金粉顆粒直徑1. 0 y m。金粉子彈用EcoRI酶切 的線性化質(zhì)粒cg401-l-hemH-lba DNA包裹。 轉(zhuǎn)化后的衣藻在25t:和光照下經(jīng)過18h過渡培養(yǎng)后，用TAP液體培養(yǎng)基沖洗，涂布 于含壯觀霉素100 ii g/ml的TAP固體選擇培養(yǎng)基上，在25t:和100 y mol *m—2 *s—1的連續(xù)光 照條件下，培養(yǎng)7 15天，挑取有抗性的單藻落分別在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)(圖3)， 然后分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量，使用上?；繕?biāo)準(zhǔn)氣體有限公司生產(chǎn)的標(biāo) 準(zhǔn)品定義所測(cè)氣體的組成和含量。
實(shí)施例5: 分析轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表達(dá)
①hemH-lba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測(cè) 測(cè)定hemH-lba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的合適方法是實(shí)施下文所述的 PCR法，如果hemH基因和lba基因通過同源重組交換的方式整合到萊茵衣藻葉綠體DNA 上，則以轉(zhuǎn)基因衣藻總DNA為模板的PCR產(chǎn)物應(yīng)該是8229bp，而未整合的PCR產(chǎn)物應(yīng)該是 5400bp(圖4， A)。其中與萊茵衣藻葉綠體DNA結(jié)合的引物是cpDNA-Pl :5' -aga cag cca aca ttt tgt ta_3， ；cpDNA_P2 :5， -get tcaaaa aca aaa tea aa_3，。
通過Rochaix禾口 Erickson的方法(Trends in Biochemistry Science, 1988， 13 : 56-59)提取衣藻總DNA。取10ml處于對(duì)數(shù)生長后期的衣藻培養(yǎng)液，4。C低速離心收集，加 350 ill NET(0.1mol/L NaCl， 50mmol/L EDTA， 20mmol/LTris-HCl， pH 8.0)重懸沉淀，加入 25 ii 1 10mg/ml的蛋白酶{((Proteinase K)及25 y 1 20% SDS，混勻并于37。C水浴過夜，冰 上冷卻，加入200iU 5mol/L KAc，冰上靜置后離心，上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊 醇(25 : 24 : 1)抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無水乙醇沉淀和70X乙 醇洗滌，干燥后溶于30 iU TE緩沖液，用于上述PCR檢測(cè)。
②轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè) 檢測(cè)hemH基因和lha基因在轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中是否轉(zhuǎn)錄的合適方法是按照本領(lǐng) 域熟練技術(shù)人員所公知的反轉(zhuǎn)錄PCR的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press. 1998)或參照上述的hemH基因禾口 lba基 因克隆方法的實(shí)施部分。萊茵衣藻的取樣是取對(duì)數(shù)生長期中期的萊茵衣藻1ml左右，室溫 3000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞。按照試劑盒制造商的產(chǎn)品說明書(QIAGEN ,Promega )提 取萊茵衣藻的總RNA和按照Promega AMV RT Protocol說明書合成cDNA，利用上述hemH 基因和lba基因的特異性引物和上述克隆hemH基因和lba基因所述的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增， 進(jìn)行hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)(圖4， B) ， PCR產(chǎn)物回收純化，送基因測(cè)序公司 證明所得核苷酸序列正確。
③轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中亞鐵螯合酶和Lba表達(dá)量的檢測(cè) 參照Hemschemeier等(Planta， 2008， 227 :397-407)的方法提取萊茵衣藻總蛋白和進(jìn)行Western blot檢測(cè)。取30ml進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)的萊茵衣藻培養(yǎng)液，快速室溫3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞。用250 蛋白提取緩沖液(50mMTris/HCl pH 8. 3， 1% Triton-X100)懸浮，加入2iU P-巰基乙醇，液氮凍融三次；在4。C，14000g離心20min，取100 y g的蛋白上清液加上樣緩沖液(0. 25M Tris-HCl， pH 8. 0 ;25% glycerol ;7. 5% SDS ;0. 25mgml-1 bromophenolblue ;12. 5% (v/v) 2-mercaptoethanol)于10%的分離膠禾口 5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜(Millipore，USA)， 一抗分別用抗豆血紅蛋白亞鐵螯合酶多克隆抗體和抗大豆Lba多克隆抗體(上海中科蛋白抗體制備公司)進(jìn)性免疫雜交檢測(cè)，按照ECL Plus (Amersham公司)說明書對(duì)HRP標(biāo)記的抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(圖5)。對(duì)于蛋白質(zhì)的定量和SDS-PAGE凝膠電泳以及western blot實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、洗膜、顯影等操作技術(shù)均為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)或按照試齊U盒制造商說明書(Bio-Rad Bradford kit禾P GE Healthcare)操作。
實(shí)施例6: 分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長的影響
本發(fā)明通過測(cè)量轉(zhuǎn)基因藻前后萊茵衣藻的細(xì)胞數(shù)和葉綠素含量的變化來比較在葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶和球蛋白亞基Lba對(duì)萊茵衣藻生物量的影響。藻細(xì)胞數(shù)和葉綠素含量的測(cè)定參照Harris主編的《TheChlamydomonas Sourcebook :acomprehensive guide to biology andlaboratory use. New York :Academic Press. 1989》方法。萊茵衣藻在750nm處的吸光度(0D75。)與萊茵衣藻的細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，用TU-1901雙光束紫外可見光光度計(jì)直接檢測(cè)培養(yǎng)的萊茵衣藻在750nm處的吸光度作為萊茵衣藻細(xì)胞數(shù)的生長指標(biāo)。葉綠素含量的測(cè)定是取1ml藻液，3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95%乙醇溶液，混勻，室溫避光放置20min， 4。C下12000rpm離心10min，取上清，按比例稀釋后，測(cè)定0D665及0D649的吸光值，根據(jù)下列公式計(jì)算出總?cè)~綠素的含量，單位是mg/L。
葉綠素Chi (mg/1) = 20. 04 X (0D649) +6. 10 X (0D665)。 結(jié)果表明在葉綠體中表達(dá)hemH基因和lba基因未使轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的生長受到抑制(圖6)。
實(shí)施例7: 分析豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)的耗氧量和產(chǎn)氫量的影響
①在缺硫培養(yǎng)基中對(duì)耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè) 在缺硫培養(yǎng)基中，萊茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影響。在密封條件下萊茵衣藻液體培養(yǎng)基中的氧氣含量因?yàn)楹粑亩焖傧陆担率挂后w培養(yǎng)基中出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，誘導(dǎo)萊茵衣藻氫酶表達(dá)而開始產(chǎn)生氫氣，通過檢測(cè)密封瓶子上方封存的空氣中的氧氣和氫氣含量變化情況就能反映出萊茵衣藻的耗氧和產(chǎn)氫情況。結(jié)果表明(圖7， A、 B)，轉(zhuǎn)hemH-lba基因的萊茵衣藻培養(yǎng)體系中的氧氣含量從進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)開始就很快下降，在第二天的時(shí)候就降到4.6%，第三天至第五天達(dá)到最低，為2.9%。未轉(zhuǎn)基因的萊茵衣藻培養(yǎng)體系中的氧氣含量在第二天僅降到9. 5%，直到第六天才達(dá)到最低，為3. 7%。轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻的產(chǎn)氫最大速率出現(xiàn)在第5天，為47. 0 ig—^hl 『、比未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻在第7天的最大產(chǎn)氫速率16. 7iU *mg—^hl *h—'高2.8倍。相應(yīng)的，轉(zhuǎn)hemH-lba 基因的萊茵衣藻培養(yǎng)體系的最大產(chǎn)氫量為3. 3ml，比未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的最高值O. 8ml高4倍。 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5)，轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻中重組hemH-Lba的 表達(dá)量在產(chǎn)氫培養(yǎng)的第3天開始被檢測(cè)出來，在第5天達(dá)到最大，在第6天和第7天又迅 速下降到幾乎檢測(cè)不到。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻的氧氣含量下降快與重 組hemH-Lba的表達(dá)量呈正相關(guān)；而且轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻的最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)在 產(chǎn)氫培養(yǎng)的第5天，這個(gè)時(shí)間與重組hemH-Lba的最大表達(dá)量出現(xiàn)的時(shí)間一致，說明重組 hemH-Lba對(duì)轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的耗氧和產(chǎn)氫產(chǎn)生影響。
②在含硫培養(yǎng)基中對(duì)耗氧量和產(chǎn)氫量的影響 控制培養(yǎng)基中硫元素的濃度在一定范圍內(nèi)，可以部分恢復(fù)PSII的活性，但仍使呼 吸作用耗氧速率大于光合放氧速率，仍然可以使培養(yǎng)體系處于缺氧狀態(tài)，但是光合電子效 率會(huì)增加，理論上可以增加產(chǎn)氫量(Woykoff等，1998 ;Melis等，2000)。
本發(fā)明的結(jié)果表明(圖7， C、D、E、F、G、H)，在培養(yǎng)基中含有12. 5、25和50iiM硫 酸鹽時(shí)，萊茵衣藻培養(yǎng)體系的產(chǎn)氫量沒有提高，但轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻培養(yǎng)體系的氧 氣含量下降速度仍然較快，在產(chǎn)氫培養(yǎng)第2天時(shí)候分別下降到5. 1%、8.9%和15.0%。未 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻分別下降到10. 1%、11.9%和18. 2X;轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻培養(yǎng)體系 的氧氣含量最低點(diǎn)分別為3. 1%、4. 1%和4. 3%，而且能維持在3. 1-4. 3%的低氧狀態(tài)達(dá)兩 天之久，比未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的最低點(diǎn)10. 1%、11.9%和11.2%分別低了 2. 26倍、1.90倍 和1. 60倍；而且未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含硫元素恢復(fù)了部分PSH活性而使氧氣含 量在照光后迅速回升到21 % ，轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻的氧氣含量在培養(yǎng)基中硫元素含 量大于25 ii M時(shí)才在照光后出現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。在培養(yǎng)基中含有12. 5、25和50 y M硫酸鹽 時(shí)，轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻培養(yǎng)體系的最大產(chǎn)氫量分別為1. 2、0. 68和0. 41ml，而未轉(zhuǎn)基 因萊茵衣藻培養(yǎng)體系的最大產(chǎn)氫量?jī)H分別為0. 46、0. 47和0. 22ml。 本發(fā)明前期工作結(jié)果顯示，單獨(dú)在萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白的球蛋白 亞基基因lba可以降低培養(yǎng)體系內(nèi)的氧氣含量和使產(chǎn)氫量提高約50X。本發(fā)明的上述結(jié)果 表明，在萊茵衣藻葉綠體中增加表達(dá)合成豆血紅蛋白血紅素輔基的hemH基因能顯著加快 萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)體系的氧氣消耗速度和在培養(yǎng)體系內(nèi)維持較低的氧氣含量，能進(jìn)一步提 高萊茵衣藻的氫氣產(chǎn)量達(dá)4倍多。并且重組hemH-Lba在萊茵衣藻中的最大表達(dá)量出現(xiàn)時(shí)間 與其最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)的時(shí)間一致，說明轉(zhuǎn)hemH-lba基因萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中耗氧 速度的增力n、氧氣含量的降低以及產(chǎn)氫量的增加是與重組hemH-Lba的表達(dá)聯(lián)系在一起的。 提高該轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH-Lba的表達(dá)量，進(jìn)一步增加產(chǎn)氫培養(yǎng)體系內(nèi)的耗氧能力，本 發(fā)明方法可以用于進(jìn)一步提高微型綠藻和藍(lán)藻的產(chǎn)氫能力。 上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，并不用來限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則之內(nèi)， 所做的任何修改和變化，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻和慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)A、選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件溫度25±1℃；日光燈光照強(qiáng)度100～200微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons m-2s-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡(jiǎn)稱TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7.2，水平搖床轉(zhuǎn)速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養(yǎng)；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons m-2s-1)，溫度25±1℃；每24小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測(cè)一次；D、慢生大豆根瘤菌培養(yǎng)條件用pH 7.2的酵母提取液-甘露醇液體培養(yǎng)基，溫度28±1℃、黑暗條件下200rpm轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長期，吸光度OD600值達(dá)到0.6-0.8，1％接種繼代；E、用氣相色譜儀測(cè)定氫氣和氧氣含量分子篩5×1/8(OD)，柱長2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50℃，進(jìn)樣溫度200℃，熱導(dǎo)檢測(cè)溫度300℃；(2)豆血紅蛋白hemH基因和lba基因的克隆A、取序列號(hào)M92427慢生大豆根瘤菌hemH基因和序列號(hào)V00453大豆lba基因；B、分別提取慢生大豆根瘤菌的總DNA，提取大豆的總RNA，再對(duì)大豆總RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；C、分別克隆hemH基因和lba基因；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1.5min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min；反應(yīng)產(chǎn)物純化回收；C、測(cè)序鑒定hemH基因、lba基因的特異性引物hemH基因的特異性引物為hemH-P15’-atgtcgaccgccgctc-3’，斜體表示SacII酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序列；hemH-P25’-tatatccagccctggagctcgcg-3’，斜體表示SacII酶切位點(diǎn)序列；lba基因的特異性引物為Lba-P15’-c aaa ttt aaa ttt atg gtt gct ttc actgag-3’，斜體表示SmalI酶切位點(diǎn)序列，方框中的序列是加入的增強(qiáng)翻譯能力的RBS序列；Lba-P25’-tcc ata cta att atg cct tct taa tag c-3’，斜體表示SacI酶切位點(diǎn)序列；(3)萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建A、用限制性內(nèi)切酶SmalI和SacI酶切克隆得到的大豆lba基因片段和載體cg40，將純化的lba基因片段通過上述酶切位點(diǎn)用T4 DNA連接酶連接質(zhì)粒cg40中的aadA基因，形成aadA-lba融合基因，得到載體cg401-1-lba；用SacII酶切位點(diǎn)將hemH基因用T4DNA連接酶連入到質(zhì)粒cg401-1-lba中aadA基因之后和lba基因之前，形成aadA-hemH-lba融合蛋白，構(gòu)建得到衣藻葉綠體表達(dá)載體cg401-1-hemH-lba；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用于保存、鑒定和大量制備質(zhì)粒DNA；(4)萊茵衣藻葉綠體的轉(zhuǎn)化A、取100ml對(duì)數(shù)期中后期的萊茵衣藻，25℃下3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用新鮮TAP洗三次，涂于新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)和25±1℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)；用基因搶轟擊轉(zhuǎn)化；真空度9.48192×104Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7.584236×106Pa，金粉子彈經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切質(zhì)粒cg401-1-hemH-lba DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1.0微米；B、轉(zhuǎn)化后的衣藻在光照和25±1℃條件下，過渡培養(yǎng)18h，用TAP液體培養(yǎng)基沖洗，涂布于含壯觀霉素100μg/ml的TAP固體選擇培養(yǎng)基上，在25±1℃和100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)的連續(xù)光照條件下，培養(yǎng)約7～15天；取有抗性的單藻落分別在選擇培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)；分別進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，并檢測(cè)產(chǎn)氫量和耗氧量；(5)分析轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH-lba基因的整合及其表達(dá)A、hemH-lba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測(cè)a、hemH基因和lba基因通過同源重組交換整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上，以轉(zhuǎn)基因衣藻總DNA為模板的PCR產(chǎn)物為8229bp；未整合的PCR產(chǎn)物是5400bp；與萊茵衣藻葉綠體DNA結(jié)合的引物是cpDNA-P15’-aga cag cca aca ttt tgtta-3’；cpDNA-P25’-gct tca aaa aca aaa tca aa-3’；b、取對(duì)數(shù)生長后期的衣藻培養(yǎng)液，4℃低速離心收集，加350μl NET重懸沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％SDS，混勻37℃水浴12小時(shí)，冰上冷卻；加入200μl 5mol/L KAc，靜置離心；上清中加入等體積25∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇溶液抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無水乙醇沉淀和70％乙醇洗滌，干燥后溶于30μl TE緩沖液，用于PCR檢測(cè)；B、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA；利用hemH基因和lba基因的特異性引物和克隆hemH基因和lba基因所述的PCR條件擴(kuò)增，進(jìn)行hemH基因和lba基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)；C、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中亞鐵螯合酶和Lba表達(dá)量的檢測(cè)a、按下列配比制備蛋白提取緩沖液50mM Tris/HCl pH 8.3plus 1％Triton-X 100；上樣緩沖液0.25M Tris-HCl，pH 8.0；25％ glycerol；7.5％SDS；0.25mg ml-1 bromophenolblue；12.5％(v/v)2-mercaptoethanol；b、取產(chǎn)氫培養(yǎng)的萊茵衣藻培養(yǎng)液，快速室溫3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，用250μl蛋白提取緩沖液懸浮，加入2μl β-巰基乙醇，液氮凍融三次；4℃條件下離心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上樣緩沖液，用10％的分離膠和5％的濃縮膠進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜；分別用抗豆血紅蛋白亞鐵螯合酶多克隆抗體和抗大豆Lba多克隆抗體做性免疫雜交檢測(cè)，對(duì)HRP標(biāo)記的抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；(6)分析重組豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻生長的影響A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)檢測(cè)萊茵衣藻在750nm處的吸光度；B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細(xì)胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測(cè)定OD665及OD649的吸光值；C、計(jì)算總?cè)~綠素的含量，單位mg/L葉綠素Chl(mg/l)＝20.04×OD649+6.10×OD665；(7)分析豆血紅蛋白hemH-lba基因?qū)θR茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)的耗氧量和產(chǎn)氫量的影響A、缺硫培養(yǎng)基中耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)B、含硫培養(yǎng)基中耗氧量和產(chǎn)氫量的檢測(cè)。FSA00000045598700021.tif,FSA00000045598700022.tif,FSA00000045598700023.tif,FSA00000045598700024.tif
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，一種豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因提高萊茵衣藻制氫產(chǎn)量的方法?，F(xiàn)有萊茵衣藻制氫的缺點(diǎn)是萊茵衣藻氫酶對(duì)氧氣敏感，容易受氧氣的抑制而失去活性；限制了衣藻的產(chǎn)氫效果。本發(fā)明公開了一種豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因和球蛋白亞基基因在萊茵衣藻產(chǎn)氫中的應(yīng)用，將豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和球蛋白亞基基因lba構(gòu)建在萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體中，使hemH-lba基因在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻的密閉培養(yǎng)體系中氧氣含量下降地明顯比未轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻快，并且氧氣含量能維持較低水平，產(chǎn)氫量明顯增加。
文檔編號(hào)C12N15/79GK101775407SQ20101011501
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者吳雙秀, 王全喜, 王榮榮, 許麗麗, 黃瑞 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)