一種用于提高萊茵衣藻脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因衣藻、構(gòu)建方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及將外源基因優(yōu)化改造后轉(zhuǎn)入萊茵衣藻基 因組中并提高萊茵衣藻脂肪酸含量的方法，尤其涉及一種用于提高萊茵衣藻脂肪酸含量的 轉(zhuǎn)基因衣藻、構(gòu)建方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，全球大約80 %的能源來自于化石燃料，作為一種不可再生能源，化石燃料逐 漸枯竭，它的消耗殆盡成為人們面臨的重大問題，并且化石燃料的大量使用引起了氣候變 暖、環(huán)境污染、健康等一系列問題?；剂系氖褂檬侨蜃兣闹饕蛑唬剂?作為一種能量來源，應(yīng)該被一種可再生的，清潔的能源所替代，以便減少溫室氣體的排放， 長期依賴化石燃料，不利于長久的可持續(xù)發(fā)展。所以當(dāng)務(wù)之急是找到可再生、低污染的新型 可替代能源。在眾多的可替代能源中，生物燃料最受關(guān)注，而生物柴油是常用的生物燃料之 〇
[0003] 生物柴油現(xiàn)已被各國認(rèn)為是理想的可再生能源，其主要成分是脂肪酸甲酯 (FAME)，是以可再生資源為原料通過酯交換制備而成，具備與石化柴油相近的性能。其 優(yōu)勢如下：1.可持續(xù)供應(yīng)的可再生資源；2.具有高度生物降解性，毒性小；3.基本不會增 加對環(huán)境有害的化學(xué)物質(zhì)排放；4.有較高的氧含量，比來自石油的柴油有更大的燃燒值； 5.能逐步緩解對進(jìn)口資源的依賴性；6.生物柴油來源于植物的光合作用，可以緩解生物柴 油燃燒所生成的C0 2，所以無論是生產(chǎn)還是使用生物柴油均不會造成溫室效應(yīng)。生物柴油 的發(fā)展歷程主要分為三個：第一代生物柴油的原料主要是油菜、大豆、棕櫚油和向日葵，而 這些主要是食用油的來源，對全球的食品市場和食品安全產(chǎn)生了影響，同時，培養(yǎng)第一代生 物柴油作物需要大面積的土地進(jìn)行種植，來供應(yīng)燃料需求，這造成大量森林被砍伐，導(dǎo)致生 態(tài)失衡。第二代生物柴油原料主要是麻風(fēng)樹、麻花、煙草種子、三文魚油、廢烹調(diào)油、餐廳油 脂和動物脂肪等，這些原料部分改善了與人爭糧，與人爭地的現(xiàn)象，所產(chǎn)出的生物柴油更高 效、更環(huán)保。但是它同樣存在一些問題，比如說，來源不夠廣泛，無法滿足燃料的需求以及飽 和脂肪酸含量過高等缺點(diǎn)。原料的低效率和不可持續(xù)性，使得人們進(jìn)一步尋找理想的生物 原料。第三代生物柴油原料，是微藻，它具有較高的光和效率生長速度，具有高油脂含量的 微藻生產(chǎn)油脂的能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)農(nóng)作物，微藻巨大的產(chǎn)業(yè)價值使得它成為近年來的研宄熱 點(diǎn)。
[0004] 微藻產(chǎn)油主要分為兩部分，分別是自由脂肪酸合成和三酰甘油合成（即kennedy 路徑），兩個路徑分別發(fā)生在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中，在質(zhì)體中生成自由脂肪酸后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體 外進(jìn)行三酰甘油合成。藻細(xì)胞中的糖酵解路徑為脂肪酸合成提供原材料乙酰輔酶A，乙酰輔 酶A在乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，AC-Case)的催化下生成丙二酸單酰 輔酶A，這步反應(yīng)是不可逆的，是脂肪酸合成的關(guān)鍵步驟。在脂肪酸合酶的作用下生成自由 脂肪酸，自由脂肪酸從質(zhì)體中進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上開始三酰甘油的組裝。主要是三種酰 基轉(zhuǎn)移酶甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（LPAAT)和二酰甘油?；?轉(zhuǎn)移酶（DAGAT)起作用。微藻中脂肪酸合成路徑如圖1所示。
[0005] 美國能源部在1978年立項(xiàng)研宄生物柴油方面，他們從海洋和湖泊中分離出3000 株微藻，并從中篩選出大約300株生長速度快、脂肪酸含量高的微藻，包括硅藻、綠藻、藍(lán)藻 等。根據(jù)目前的報道，微藻的脂含量占干重的比例在1%~70%之間，在某些培養(yǎng)條件下 可達(dá)90 %。要使微藻產(chǎn)油量提高，通常都是脅迫條件，這種條件下，微藻在提高含油量的 同時，生長會受到影響。所以很多研宄人員致力于基因改造方面，1991年美國能源部開展 了利用基因工程構(gòu)建高產(chǎn)油微藻的研宄。在微藻脂肪酸合成路徑以乙酰輔酶A為底物，在 乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)的催化下進(jìn)入后續(xù)合成路 徑，ACCase是脂肪酸生物合成中的關(guān)鍵限速酶，1995年Dunahay T G等人成功將ACCase 車專入小環(huán)藻中(Dunahay T G, Jarvis E E, Roessler P G. Genetic transformation of the diatomsCyclotella crypticaandNavicula saprophila. J Phyco,1 1995,31:1004 ~ 1012)。近年來，很多藍(lán)藻和大腸桿菌的ACCase基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中公布，目前未 見到關(guān)于利用ACCase顯著提高微藻脂肪酸含量的報道。
[0006] 在提高脂肪酸代謝速率時，抑制分支代謝路徑也是一種方法，PEPC催化C02與磷 酸烯醇式丙酮酸（PEP)的羧化反應(yīng)，生成草酰乙酸（0AA)和無機(jī)磷酸，PEP可轉(zhuǎn)化成乙酰 CoA，后者是脂肪酸合成的主要原料。PEPC在碳代謝途徑中將碳源導(dǎo)向三羧酸循環(huán)，使得碳 源流向非脂類積累的方向而不易于油脂的積累。1999年Chen等人發(fā)現(xiàn)，油菜籽中的pepc 沉默后，其產(chǎn)油量提高了 6. 4-18% (陳錦清，郎春秀，胡張華等.反義p印c基因調(diào)控油菜 籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率的研宄丄農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報.，1999,7(4):316-32)。此外，他 還提出"底物競爭"假說，認(rèn)為籽粒油脂和蛋白質(zhì)合成時均需要同一底物一丙酮酸，兩者存 在底物競爭，而其競爭性取決于兩類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶活性高低，即PEPC和乙酰輔酶A羧 化酶（ACCase)的相對活性。研宄發(fā)現(xiàn)，微藻脂肪酸含量與pepc酶活性成反相關(guān)，所以近年 來多應(yīng)用RNA沉默技術(shù)探宄其對微藻萊茵衣藻和海洋硅藻三角褐指藻的影響。利用RNAi 技術(shù)使p印c2基因沉默后，萊茵衣藻（C.Reinhardtii)的油脂含量提高了 14-28%。結(jié)果初 步顯示抑制PEPC酶活性，可以顯著提高微藻脂含量，效果較明顯。
[0007] 近年來關(guān)于三酰甘油組裝路徑相關(guān)基因的研宄也逐漸展開，關(guān)于這些酶的研宄主 要集中在擬南芥、油菜等高等植物、大腸桿菌、酵母和部分藻類中，不同物種中相關(guān)酶的存 在形式有差異。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT)在TAG合成中也是一種重要的酶。據(jù)報 道，將大腸桿菌和紅花（saflower)的GPAT基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中，使得種子的含油量和重量 都有所增加，含油量最多增加了 22%。甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶（DAGAT)是一種完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 細(xì)胞微粒體酶。它是三酰甘油合成的最后一個酶，催化二酰甘油（DAG)生成三酰甘油，同 時也是反應(yīng)的限速酶。最早關(guān)于DAGAT影響產(chǎn)油量的報道是2001年，Jako等人將DGAT的 cDNA在野生型擬南芥中過量表達(dá)，結(jié)果DGAT活性增加了 10% -70%，種子含油量也有所增 加。后來Zhang等用特異性hpRNA使得煙草中DGAT1基因沉默，結(jié)果煙草種子的含油量下 降了 9%-49%。這說明，一些高等植物中油脂含量與DGAT表達(dá)量關(guān)系密切。相比前面幾 個基因，對于油脂產(chǎn)量的提高效果不明顯或者不穩(wěn)定。關(guān)于甘油-3-磷酸脫氫酶（G3PDH)， 它負(fù)責(zé)催化甘油-3-磷酸的形成，將一種胞質(zhì)酵母的甘油-3-磷酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化到油菜 (B.napus)種子中，結(jié)果使得產(chǎn)油率提高40%。在藻類中關(guān)于這幾種基因的報道主要是萊 茵衣藻，Hexin Lv等人在萊茵衣藻脂肪酸積累時，利用轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超過2500種 基因的上調(diào)，其中LPAAT和DAGAT被抑制后，脂肪酸產(chǎn)量下降。甘油-3-磷酸脂肪酰轉(zhuǎn)移酶、 溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶、或者甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶（DAGAT)對應(yīng)基因的過表達(dá)都可以使植 物脂肪酸產(chǎn)量提高，由此可以推測TAG形成過程中的酶同樣可以影響微藻中脂肪酸含量。
[0008] 萊茵衣藻（Chlamydomons reinhardtii)屬于綠藻門團(tuán)藻目衣藻科，是一種單細(xì)胞 真核鞭毛藻類，細(xì)胞呈卵形，有細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。胞質(zhì)里有一個大型杯狀葉綠體，占 整個細(xì)胞體積的40 % -60 %。萊茵衣藻細(xì)胞的前端有兩根鞭毛，可擺動，能在水中自由游 動，可誘導(dǎo)光照和其它條件都適宜的地方，進(jìn)行光合作用，因其與酵母細(xì)胞有許多共同的特 征，又被稱為"光合酵母"。萊茵衣藻有無性生殖和游行生殖兩種生殖方式，有光能自養(yǎng)、異 養(yǎng)及光能異養(yǎng)3種不同的營養(yǎng)方式，其生長周期短，光合效率高，并且遺傳背景清晰。雖然 LPAAT和DAGAT在TAG合成中具有重要的功能，但國內(nèi)外關(guān)于LPAAT和DAGAT在萊茵衣藻中 的功能研宄很少，尚未有關(guān)于它們在萊茵衣藻轉(zhuǎn)化、表達(dá)的研宄，更未見它們對萊茵衣藻脂 肪酸合成影響的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本方法的目的就是提供一種提高萊茵衣藻脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因衣藻。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于提高萊茵衣藻脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因衣藻的 構(gòu)建方法，步驟如下：
[0011] 獲得溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因和甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因；
[0012] 分別構(gòu)建溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因重組表達(dá)載體和甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基 因重組表達(dá)載體；
[0013] 將所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因重組載體和甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因重組 載體分別或者共同轉(zhuǎn)化至萊茵衣藻細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因和/或甘油 3-