專利名稱：獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的方法及其專用引 物。
背景技術(shù)：
細(xì)菌的核糖體核苷酸基因通常包含9個(gè)(Vl-V9)區(qū)。但是，在這9個(gè)區(qū)中，可變區(qū) 的長度和可變區(qū)堿基序列的多樣性也存在差異。其中V3、V6區(qū)的堿基序列多樣性最高。V6 區(qū)比較短，因此16S rRNA基因中V3區(qū)(約200bp)成為最為常用的分子標(biāo)記之一。PCR-DGGE 技術(shù)以及由此延伸的PCR-TGGE被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。因信息量 大，能夠區(qū)分細(xì)菌的幾乎所有的屬且序列長度在DGGE膠的最佳分離效果之內(nèi)，16S rRNA基 因中V3區(qū)被大量科研工作者應(yīng)用于對(duì)環(huán)境多樣性的研究。 PCR擴(kuò)增16S rRNA基因中高可變區(qū)V3的通用引物為338F和543R組成的引物對(duì)。 當(dāng)用上述技術(shù)研究環(huán)境樣品多樣性時(shí)，研究人員一般會(huì)直接從膠中回收DGGE/TGGE膠中單 一條帶的DNA，然后用DNA溶解Buffer溶解回收的DNA，用PCR 二次擴(kuò)增回收DNA以提高回 收樣品的豐度，再通過連接載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆細(xì)胞，驗(yàn)證陽性克隆，提取質(zhì) 粒，進(jìn)行測(cè)序，最后分析數(shù)據(jù)。但是，通過轉(zhuǎn)化克隆載體測(cè)序的方法試驗(yàn)步驟繁瑣、試驗(yàn)周期 長、工作量大、花費(fèi)大、最為嚴(yán)重的缺點(diǎn)是獲得序列信息有可能出錯(cuò)。造成出錯(cuò)原因大概有
兩方面第一方面DNA模板二次擴(kuò)增時(shí)發(fā)生低豐度污染，因挑選陽性克隆不當(dāng)，錯(cuò)把污染序 列作為目的序列；另一方面以DNA為模板的DNA聚合酶本身在催化半保留復(fù)制時(shí)也會(huì)發(fā)生 錯(cuò)誤合成，當(dāng)挑選陽性單克隆測(cè)序時(shí)，序列的準(zhǔn)確性有可能降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的方法及其 專用引物。 本發(fā)明提供了專用引物，是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸 組成的特異引物對(duì)。該專用引物可用于獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列。
本發(fā)明還保護(hù)一種獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的試劑盒，包括 特異引物對(duì)、通用引物和測(cè)序引物；所述特異引物對(duì)是由序列表的序列17和序列表的序列 19所示的核苷酸組成的引物對(duì)；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所 示的核苷酸組成的引物對(duì)；所述測(cè)序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。
所述特異引物對(duì)在制備獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的試劑盒中 的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述特異引物對(duì)在獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明提供的獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的方法，包括如下步驟 (1)用通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)；所述通用引物是由序列表 的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸組成的引物對(duì)； (2)以步驟(1)的PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物對(duì)
是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸組成的引物對(duì)； (3)將步驟(2)的PCR產(chǎn)物采用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，得到細(xì)菌16S rRNA基因的V3
區(qū)的核苷酸序列；所述測(cè)序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。采用通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)，產(chǎn)物約200bp，因擴(kuò)增產(chǎn)物較短不能直
接用于測(cè)序而必須通過傳統(tǒng)的連接載體克隆后進(jìn)行測(cè)序，工作量繁重，實(shí)驗(yàn)周期漫長。本發(fā)
明提供的用于細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的V3區(qū)的特異引物對(duì)可以直接進(jìn)行測(cè)
序，無需借助載體，有助于降低了實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)的周期，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的
特異引物對(duì)和方法特別適用于針對(duì)16S rRNA基因的V3區(qū)用PCR-DGGE技術(shù)分析環(huán)境樣品
細(xì)菌多樣性試驗(yàn)。


圖1為用Tinoco Plot軟件對(duì)M543R引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果。 圖2為用Dotplot軟件對(duì)338F-M543R引物對(duì)進(jìn)行全局比對(duì)評(píng)估的結(jié)果。 圖3為用通用引物和特異引物對(duì)進(jìn)行PCR的PCR產(chǎn)物電泳圖。 圖4為DNA片段甲的測(cè)序結(jié)果。 圖5為序列1至序列4的比對(duì)結(jié)果。 圖6為DNA片段乙的測(cè)序結(jié)果。 圖7為序列5至序列8的比對(duì)結(jié)果。 圖8為DNA片段丙的測(cè)序結(jié)果。 圖9為序列9至序列12的比對(duì)結(jié)果。 圖10為DNA片段丁的測(cè)序結(jié)果。 圖11為序列13至序列16的比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例中引物的核苷酸序列如下 338F :5' -ACTCCTACGGAGGCAgCAG-3 (序列表的序列17);
543R :5' -TGTATTACCGCGGCTGCTGG-3'(序列表的序列18);
CTGG-3'(序列表的序列19);QSS :5' -GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTG-3'(序列表的序列20)。
實(shí)施例中的PCR參數(shù)PCR的反應(yīng)體系(50ul) : 10 X buffer 5ul，2mM dNTP 4ul，10mM primer (338F) 2ul，10mM primer (M543R或543R)2ul， Taq酶(2U/ul) lul， DNA lul， ddH20 35ul。 PCR反應(yīng)條件；起始變性(10分鐘，95。C ) ;30個(gè)循環(huán)(變性30秒，95。C ;退火30
秒，55。C ;延伸30秒，72。C );延伸2分鐘，72。C。 實(shí)施例1、特異引物對(duì)的發(fā)現(xiàn)和分析 —、特異引物對(duì)的發(fā)現(xiàn) 合成序列表的序列1所示的DNA片段甲(Clostridium bifermentans strain MKA2的16S rRNA基因)。序列1所示DNA與GENBANK ACCESSION NUMBER GU358061. 1所 示DNA互補(bǔ)。Clostridium bifermentans strain MKA 2的16S rRNA基因的V3區(qū)為自5' 末端第125至299位核苷酸。 用通用引物(338F-543R)對(duì)DNA片段甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% (質(zhì) 量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。純化后的產(chǎn) 物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用543R作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè)序圖譜見圖4A，測(cè) 序結(jié)果見序列表的序列2。分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)用引物直接測(cè)序時(shí)，測(cè)序引物下游40個(gè)堿基后的 序列峰圖完全可信。 設(shè)計(jì)一條長達(dá)44bp的特異序列連接到原來的543R引物5'端，原引物從20堿基 加長到64個(gè)堿基，得到新的下游引物M543R。
二、特異引物對(duì)的分析 用Tinoco Plot (http://www. biophys. uni_duesseldorf. de/local/TIN0C0/ tinoco.html)軟件對(duì)M543R的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，見圖1， M543R自身沒有形成超過4堿 基的螺旋結(jié)構(gòu)。用Dot-Plot (http :〃www. biophys. uni-duesseldorf. de/local/D0TPL0T/ dotplot. html)對(duì)338F-M543R引物對(duì)進(jìn)行完全比對(duì)評(píng)估加長的序列是否會(huì)與338F形成螺 旋結(jié)構(gòu)，如圖2所示，該增加的特異性序列沒有和338F引物形成超過4堿基的強(qiáng)螺旋結(jié)構(gòu)。
三、特異引物對(duì)的應(yīng)用效果 用特異引物對(duì)(338F-M543R)對(duì)步驟一中純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn) 物進(jìn)行1.5% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠純 化。純化后的產(chǎn)物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用QSS作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè)序 圖譜見圖4B，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列3。從測(cè)序峰圖分析，可以很清晰的分辨出M543R中 與543R引物相同的堿基序列以及在其后的堿基序列，無論堿基的可信度還是峰間距，噪音 值都達(dá)到的試驗(yàn)要求的準(zhǔn)確度。特別需要補(bǔ)充的是，根據(jù)測(cè)序的原理，測(cè)序不準(zhǔn)確的序列一 般會(huì)出現(xiàn)在前端，后端序列只要測(cè)序反應(yīng)可靠長度區(qū)間(700bp)內(nèi)，就不會(huì)出現(xiàn)不準(zhǔn)確。
將步驟 一 中純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品pGEM-T easyVector system)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (北京天為時(shí)代公司)感受態(tài)，挑選陽性克 隆.使用載體引物M1320進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見圖4C，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列4。
將序列1至序列4用clustalw2(http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/)比 對(duì)分析，結(jié)果見圖5。用特異引物對(duì)(338F-M543R)和QSS引物測(cè)序的結(jié)果和連接載體后所 得結(jié)果不存在差別，都能高效準(zhǔn)確的擴(kuò)增DNA片段甲，從而得到DNA片段甲的準(zhǔn)確核苷酸序 列(Clostridium bifermentans的V3區(qū))直接用543R測(cè)序由于前端約40多堿基不能測(cè) 出，影響了序列準(zhǔn)確性。 分別用特異引物對(duì)(338F ;M543R)和通用引物(338F ;543R)對(duì)7株菌的16S rRNA基因中V3區(qū)的進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳。 PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣為5ul，所用DNA分子量標(biāo)記(marker)為北京天根公司的lkb Plus。結(jié)果見 圖3， M為marker ;1-14為7株菌，每株菌兩個(gè)泳道?？梢?，引物改造后對(duì)引物的退火溫度， 擴(kuò)增效率無影響。 實(shí)施例2、細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的獲得 合成序歹lj表的序歹lj 5所示的DNA片段乙(Shewanella sp. enrichment cultureclone LY4的16S rRNA基因)。序列5所示DNA與GENBANK ACCESSION NUMBER GQ465946. 1所示DNA互補(bǔ)。Shewanella sp. enrichment culture clone LY4的16S rRNA 基因的V3區(qū)為自5'末端第195至395位核苷酸。 1、用通用引物(338F-543R)對(duì)DNA片段乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% (質(zhì) 量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。純化后的產(chǎn) 物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用543R作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè)序圖譜見圖6A，測(cè) 序結(jié)果見序列表的序列6。 2、用特異引物對(duì)(338F-M543R)對(duì)步驟1中純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠 純化。純化后的產(chǎn)物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用QSS作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè) 序圖譜見圖6B，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列7。 3、將步驟1的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品pGEM-T easy Vectorsystem)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (北京天為時(shí)代公司)感受態(tài)，挑選陽性克隆.使 用載體引物M1320進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見圖6C，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列8。
將序列5至序列8用clustalw2(http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/)比 對(duì)分析，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法，可以直接對(duì)DNA片段乙(Shewanellasp. 的V3區(qū))進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。 實(shí)施例3、細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的獲得 合成序列表的序列9所示的DNA片段丙(Marine bacterium SIM0-4432的16S rRNA基因)。序列9所示DNA與GENBANK ACCESSION NUMBER DQ469762. 1所示DNA互補(bǔ)。 Marinebacterium SIMO-4432的16S rRNA基因的V3區(qū)為自5'末端第129至327位核苷酸。 1、用通用引物(338F-543R)對(duì)DNA片段丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% (質(zhì) 量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。純化后的產(chǎn) 物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用543R作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè)序圖譜見圖8A，測(cè) 序結(jié)果見序列表的序列10。 2、用特異引物對(duì)(338F-M543R)對(duì)步驟1中純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠 純化。純化后的產(chǎn)物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用QSS作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè) 序圖譜見圖8B，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列11。 3、將步驟1的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品pGEM-T easy Vectorsystem)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (北京天為時(shí)代公司)感受態(tài)，挑選陽性克隆.使 用載體引物M1320進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見圖8C，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列12。
* ，歹lj 9 g ，歹廿12目clustalw2 (http: 〃www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/) 比對(duì)分析，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法，可以直接對(duì)DNA片段丙 (Marinebacterium SIM0-4432的V3區(qū))進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。
實(shí)施例4、細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的獲得 合成序列表的序歹lj 13所示的DNA片段丁 (Providencia alcalifaciens strain3Tl-2的16S rRNA基因)。序列13所示DNA與GENBANK ACCESSION NUMBER GU195126. 1所示DNA互補(bǔ)。Marine bacterium SIMO-4432的16S rRNA基因的V3區(qū)為自 5'末端第252至451位核苷酸。 1、用通用引物(338F-543R)對(duì)DNA片段丁進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% (質(zhì) 量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。純化后的產(chǎn) 物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用543R作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè)序圖譜見圖IOA， 測(cè)序結(jié)果見序列表的序列14。 2、用特異引物對(duì)(338F-M543R)對(duì)步驟1中純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，然后用天根DNA膠純化試劑盒進(jìn)行切膠 純化。純化后的產(chǎn)物洗脫體積為50ul。將純化后的DNA用QSS作測(cè)序引物，直接測(cè)序。測(cè) 序圖譜見圖IOB，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列15。 3、將步驟1的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品pGEM-T easy Vectorsystem)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (北京天為時(shí)代公司)感受態(tài)，挑選陽性克隆.使 用載體引物M1320進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見圖IOC，測(cè)序結(jié)果見序列表的序列16。
>|#，歹廿13 g，歹lj 16 M clustalw2(http:〃www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/) 比對(duì)分析，結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法，可以直接對(duì)DNA片段丁 (Marinebacterium SIM0-4432的V3區(qū))進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。
權(quán)利要求
由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸組成的特異引物對(duì)。
2. 獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的試劑盒，包括特異引物對(duì)、通用引物和測(cè)序引物；所述特異引物對(duì)是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸組成的引物對(duì)；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸組成的引物對(duì)；所述測(cè)序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。
3. 權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)在制備獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的試劑盒中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述特異引物對(duì)在獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列中的應(yīng)用。
5. —種獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列的方法，包括如下步驟(1) 用通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸組成的引物對(duì)；(2) 以步驟(1)的PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物對(duì)是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸組成的引物對(duì)；(3) 將步驟(2)的PCR產(chǎn)物采用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，得到細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)的核苷酸序列；所述測(cè)序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲取細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)核苷酸序列的方法及其專用引物。本發(fā)明的專用引物是由序列表的序列17和序列19所示的核苷酸組成的特異引物對(duì)。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟(1)以細(xì)菌的基因組DNA為模板，用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；通用引物是由序列表的序列17和序列18所示的核苷酸組成的引物對(duì)；(2)以步驟(1)的PCR產(chǎn)物為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟(2)的PCR產(chǎn)物采用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。本發(fā)明提供的用于細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因V3區(qū)的引物對(duì)可以直接進(jìn)行測(cè)序，無需借助載體，有助于降低了實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)的周期，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的特異引物對(duì)和方法特別適用于針對(duì)16S rRNA基因V3區(qū)用PCR-DGGE技術(shù)分析環(huán)境樣品細(xì)菌多樣性試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101792760SQ201010114660
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者何夙旭, 劉玉春, 周志剛, 姚斌, 孟昆, 曹雅男, 楊培龍, 韓少鋒 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所