專利名稱：一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列及其應(yīng)用，尤其是一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥葉銹病是一種世界性病害，對(duì)小麥生產(chǎn)會(huì)造成嚴(yán)重的危害。小麥葉銹病菌適 應(yīng)不同的氣候條件，可在全世界不同的小麥種植區(qū)發(fā)生，若條件適宜可造成40%甚至更大 的產(chǎn)量損失(Knott 1989)。在我國(guó)，小麥葉銹病過(guò)去主要在西南及長(zhǎng)江流域的部分地區(qū) 如貴州、江西等省發(fā)生較重，近年來(lái)華北、黃淮麥區(qū)也日趨嚴(yán)重。在我國(guó)1969年、1973年、 1975年、1979年和1998年曾幾度大面積流行，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。利用抗葉銹品種是減輕葉銹 病危害的最經(jīng)濟(jì)、有效、快捷的方法。目前已有66個(gè)抗葉銹病基因正式命名(Mcintosh et al. 2009)，其中大多數(shù)具有生理?；?，這些抗病基因往往會(huì)由于病菌小種的變異而很快 “喪失”抗性。育種學(xué)家和植病學(xué)家希望通過(guò)利用多基因聚合、基因布局和多系品種來(lái)延長(zhǎng) 苗期抗病基因的抗性壽命。要實(shí)現(xiàn)多基因聚合、基因布局和多系品種，必須有豐富的有效抗 源，目前已知的有效抗病基因僅有Lr9，Lrl9, Lr24和Lr38，因此尋找和發(fā)掘新的抗源異常 重要。目前，在尋找和發(fā)掘抗源的過(guò)程中，分子標(biāo)記技術(shù)使用較為廣泛，特別是在小麥的 基因作圖中得到了廣泛應(yīng)用。分子標(biāo)記包括RAPD、RFLP, SSR和RGAP，近年來(lái)，利用分子標(biāo) 記定位和標(biāo)記了多個(gè)小麥抗葉銹病基因。其中SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性高、共顯性、穩(wěn)定性好 及染色體位置清楚而得到了廣泛應(yīng)用，緊密連鎖的SSR標(biāo)記可用于標(biāo)記輔助選擇和聚合育 種。在利用分子標(biāo)記進(jìn)行抗性篩選和鑒定的過(guò)程中，特異性的引物是關(guān)鍵。小麥品種畢麥16由貴州省畢節(jié)地區(qū)農(nóng)科所在2004年育成，累積推廣種植面積達(dá) 20萬(wàn)公頃，其綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，田間高抗小麥葉銹病和條銹病，苗期高抗我國(guó)大多數(shù)葉銹 菌生理小種(Li et al. 2006，2010)，可能含有新的抗葉銹基因。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)畢麥16和 Thatcher雜交產(chǎn)生的FpF2和F3群體用于遺傳分析和基因定位，將抗病基因定位于7BL染 色體上，該基因命名為L(zhǎng)rBil6，找到了與抗病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記，可用于標(biāo)記輔助育 種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列，用 于篩選LrBi 16基因。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述引物序列包括cfa2257和wms344。其中引物cfa2257由序列表中其上游序列(20個(gè)堿基)和下游序列(25個(gè)堿基) 組成；引物wms344由序列表中其上游序列(20個(gè)堿基)和下游序列(20個(gè)堿基)組成，見(jiàn) 表1。表1用于檢測(cè)抗葉銹基因的兩引物上下游序列 本發(fā)明所提供的用于篩選小麥抗葉銹病基因的分子標(biāo)記分別是cfa2257和 gwm344，標(biāo)記cfa2257由引物cfa2257擴(kuò)增獲得(188bp)，標(biāo)記gwm344由引物wms344擴(kuò)增 獲得(185bp)。 本發(fā)明還提供了弓丨物序列在篩選小麥葉銹病基因中的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用的具體方法為以待測(cè)小麥基因組DNA為模板，分別在引物cfa2257 和wms344的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)用cfa2257擴(kuò)增的產(chǎn)物有 188bp條帶，并且用wms344擴(kuò)增的產(chǎn)物有185bp條帶時(shí)，則待測(cè)小麥含有小麥抗葉銹病基因 LrBi16。本發(fā)明應(yīng)用中所述的PCR擴(kuò)增中20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng, Taq酶lU，4ymol · Γ1的上、下游引物 各2yL，IOmmol · Γ1的dNTP 0. 4 μ L，10 XPCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至 20μ L ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)橄?94°C 5min ；然后 94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共 35 個(gè)循 環(huán)；最后72°C 10min，4°C保存。本發(fā)明應(yīng)用中所述的對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在6% (w/v)的變性聚 丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后銀染顯色。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于本發(fā)明提供了一個(gè)新的小麥抗葉銹病 基因LrBi 16的SSR標(biāo)記cfa2257和gwm344，連鎖距離分別為2. 8cM和2. 9cM, LrBi 16對(duì)我 國(guó)目前多數(shù)小種表現(xiàn)抗病。利用與該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記輔助 選擇，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)有效抗病基因的累加，延長(zhǎng)品種的抗病性。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的新抗葉銹基 因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作用。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是用微衛(wèi)星引物cfa2257對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2是用微衛(wèi)星引物wms344對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖3是7個(gè)SSR標(biāo)記與抗葉銹病基因LrBi 16的連鎖圖。
具體實(shí)施例方式用于篩選小麥抗葉銹病基因LrBi 16的引物，是由序列表中引物cfa2257和wms344 的上下游核苷酸序列組成的弓I物對(duì)。應(yīng)用本引物序列篩選小麥抗葉銹病基因LrBiie的具體方法如下1、提取待測(cè)小麥基因組DNA為模板；
2、以cfa2257和wms344為引物、待測(cè)小麥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4 μ mol · Γ1)各2 μ L， dNTP (IOmmol · Γ1) 0· 4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μ L ；反 應(yīng)程序是94°C預(yù)變性5min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸 Imin ；72°C延伸 lOmin，最后 4°C保存。3、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性載樣指示劑，94°C變性 IOmin后，于冰水混合物中冷卻，然后在濃度為6% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分 離，銀染顯色，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有188bp和185bp大小的條帶，則待測(cè)小麥有抗葉銹病基因。 所述變性載樣指示劑組成為98% (ν/ν)無(wú)離子甲酰胺，IOmM EDTA (ρΗ8. 0),0. 25% (w/v) 溴酚藍(lán)，0.25% (w/v) 二甲苯氫氟，溶劑為蒸餾水。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。實(shí)驗(yàn)例小麥抗葉銹病新基因LrBi 16的SSR標(biāo)記gwm344和cfa2257的獲得用我國(guó)目前強(qiáng)毒力葉銹菌生理小種FHTT對(duì)小麥材料畢麥16和Thatcher的FpF2 和F3代群體進(jìn)行苗期抗病性鑒定，共鑒定16個(gè)F1單株、F2群體359株和298個(gè)F3家系，畢 麥16表現(xiàn)中抗，Thatcher表現(xiàn)感病，F(xiàn)1全部抗病，F(xiàn)2中有258株表現(xiàn)抗病，101株表現(xiàn)感病， 抗感分離符合3 l(x2= 1.88，P>0. 1)。298個(gè)&家系中65個(gè)家系表現(xiàn)純合抗病，165 個(gè)家系表現(xiàn)抗感分離，68個(gè)家系表現(xiàn)為感病。F3家系分離比例為純合抗抗感分離純合 感=1 2 Kx2 = 3.5,P>0. 1)如表2所示，表明畢麥16中含有一個(gè)顯性抗病基因， 命名為L(zhǎng)rBil6。從F2代單株中選用10個(gè)抗病單株和10個(gè)感病單株分別組成抗病池和感 病池。選用1255 個(gè) SSR 引物，其中 WMC(Wheat Microsatellite Consortium)系列引物 416 個(gè)，BARC 系列引物 442 個(gè)，GWM(Gatersleben wheatmicrosatellite)系列引物 175 個(gè)， CFA系列引物222個(gè)，所有引物序列源自美國(guó)農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站(http://wheat, pw. usda. gov/ GG2/quickquery. shtml)，以畢麥16、Thatcher、抗病池和感病池的基因組DNA為模板，進(jìn) 行PCR檢測(cè)，20 μ LPCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng, Taq酶1U，上、下游引物(4 μ mol · Γ1) 各2yL，dNTP (IOmmol · Γ1) 0. 4 μ L，10 XPCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至 20 μ Lo PCR 反應(yīng)程序?yàn)橄?94°C 5min ；然后 94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin,共 35 個(gè)循環(huán)； 最后 72°C 10min，4°C保存。然后按下述方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6T%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)取20μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5μ L變性載樣指示劑(98% (ν/ν)無(wú)離子甲酰胺，IOmM EDTA(ρΗ = 8.0)，0.25% (w/v)溴酚藍(lán)和0.25% (w/v) 二甲苯氫氟)，94°C變性IOmin后，4°C保存，每 份變性的擴(kuò)增樣品取5 μ L在濃度為6Τ%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。結(jié) 果位于染色體 7BL 上的 7 個(gè) SSR 位點(diǎn) barc50、barc32、wmc70、cfa2257、barcl82、gwml46 和 gwm344在親本和抗感池之間有多態(tài)性，初步表明這些位點(diǎn)和抗葉銹病基因連鎖，其中用微 衛(wèi)星引物cfa2257和wms344對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果 如圖1和圖2所示(Pl為畢麥16，P2為T(mén)hatcher，Br為抗病池，Bs為感病池，R為抗病單 株，S為感病單株)，用引物cfa2257檢測(cè)出現(xiàn)了 3種電泳帶型，分別稱為帶型A、B和H(雜合帶型)，畢麥16、抗病池和抗病單株可擴(kuò)增出188bp的DNA片段，見(jiàn)圖1中帶型A，P2、感 病池和感病單株可擴(kuò)增出208bp的DNA片段，見(jiàn)圖1中帶型B。用引物wms344檢測(cè)出現(xiàn)了 2種電泳帶型，分別稱為D和B，畢麥16、抗病池和抗病單株可擴(kuò)增出185bp的DNA片段，見(jiàn) 圖2中D帶型，P2、感病池和感病單株不能擴(kuò)增出特異的DNA片段，為圖2中B帶型。用染色體7BL 上的 7 個(gè) SSR標(biāo)記 barc50、barc32、wmc70、cfa2257、barcl82、gwml46 和gwm344對(duì)F2群體354個(gè)單株分別進(jìn)行檢測(cè)(反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上)，用Mapmanager QTX b2.0進(jìn)行處理，繪制基因連鎖圖，如圖3所示，表明這7個(gè)標(biāo)記都與抗病基因連鎖，遺傳 距離從2. 8cM到19. 6cM。距抗病基因較近的兩個(gè)標(biāo)記cfa2257和gwm344遺傳距離分別為 2. 8cM 和 2. 9cM。用兩個(gè)標(biāo)記cfa2257和gwm344對(duì)298個(gè)F3家系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，表明 這兩個(gè)標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離分別為3. 6cM和4. OcM0表1298個(gè)F3家系的苗期鑒定 結(jié)果及SSR標(biāo)記cfa2257和gwm344在各個(gè)F3家系中帶型 注A和D為抗病帶型，H為雜合帶型，B為感病帶型。實(shí)施例1 1、提取畢麥16基因組DNA為模板；2、以cfa2257和wms344為引物、畢麥16基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4 μ mol · Ι71)各2 μ L， dNTP (IOmmol · I71) 0. 4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μ L ；反 應(yīng)程序是94°C預(yù)變性5min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸 Imin ；72°C延伸 lOmin，最后 4°C保存。3、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性載樣指示劑，94°C變性 IOmin后，于冰水混合物中冷卻，然后在濃度為6% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分 離，銀染顯色，擴(kuò)增產(chǎn)物中含有188bp和185bp大小的條帶，表明畢麥16含有抗葉銹病基因 LrBi16。實(shí)施例2 1、提取Thatcher基因組DNA為模板；2、以cfa2257和wms344為引物、Thatcher基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4 μ mol · Γ1)各2 μ L， dNTP (IOmmol · Γ1) 0. 4 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μ L ；反 應(yīng)程序是94°C預(yù)變性5min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸Imin ；72°C延伸 lOmin，最后 4°C保存。 3、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性載樣指示劑， 94°C變性 IOmin后，于冰水混合物中冷卻，然后在濃度為6% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分 離，銀染顯色，引物cfa2257擴(kuò)增產(chǎn)物中不含有188bp (含有208bp)以及引物wms344擴(kuò)增 產(chǎn)物中不含有185bp大小的條帶，表明Thatcher不含有抗葉銹病基因LrBil6。
權(quán)利要求
一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列，其特征在于該引物序列是由序列表中引物cfa2257和wms344的上下游核苷酸序列組成的引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列，其特征在 于，所述引物cfa2257的上游序列為5，GATACAATAGGTGCCTCCGC 3，，下游序列為 5’ CCATTATGTAAATGCTTCTGTTTGA3’ ；所述引物wms344的上游序列為5，CAAGGAAATAGGCGGTAACT 3，，下游序列為 5， ATTTGAGTCTGAAGTTTGCA 3，。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物序列在篩選小麥葉銹病基因中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物序列在篩選小麥葉銹病基因中的應(yīng)用，其特征在于 以 待測(cè)小麥基因組DNA為模板，分別在引物cfa2257和wms344的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，再對(duì) 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)用cfa2257擴(kuò)增的產(chǎn)物有188bp條帶，并且用wms344擴(kuò)增的產(chǎn)物有 185bp條帶時(shí)，則待測(cè)小麥含有小麥抗葉銹病基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物序列在篩選小麥葉銹病基因中的應(yīng)用，其特征在于，所 述的PCR擴(kuò)增20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U，4 μ mol 的上、下游引物各2 μ L， IOmmol · Γ1的dNTP 0. 4 μ L，IOXPCR緩沖液2 μ L，用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)橄?94°C 5min ；然后 94°C lmin，56°C lmin，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；最 后 72°C 10min，4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的引物序列在篩選小麥葉銹病基因中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在6T%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然 后銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于篩選小麥抗葉銹病基因的引物序列及其應(yīng)用，所述引物序列是由序列表中引物wms582和barc8的上下游核苷酸序列組成的引物對(duì)。本發(fā)明提供了一個(gè)新的小麥抗葉銹病基因LrBi16的SSR標(biāo)記cfa2257和gwm344，連鎖距離分別為2.8cM和2.9cM，LrBi16對(duì)我國(guó)目前多數(shù)小種表現(xiàn)抗病。利用與該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)有效抗病基因的累加，延長(zhǎng)品種的抗病性。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的新抗葉銹基因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101838694SQ20101012462
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者劉大群, 張汀, 張海, 李在峰, 李星, 王海燕 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)