專利名稱：一種羊痘病毒檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊痘病毒檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方 法。
背景技術(shù)：
羊痘(capripox)，包括綿羊痘(she印pox)和山羊痘(goatpox)，是綿羊和山羊 的一種高度接觸性傳染病。其病原為綿羊痘病毒(She印pox virus, SPV)和山羊痘病毒 (Goatpoxvirus，GPV)，均屬于痘病毒科山羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CPV)，為有囊膜的雙 股DNA病毒，基因組大小約為149kb。主要表現(xiàn)為發(fā)熱、無(wú)毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹 和皰疹，有較高的死亡率。羊痘在非洲中北部、亞洲中部和西南部以及印度大部分地區(qū)呈地 方性流行，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失。因而，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列 為A類傳染病，在我國(guó)也被列為一類傳染病。目前，我國(guó)用于羊痘的實(shí)驗(yàn)室診斷手段比較落 后，尤其是缺乏快速、簡(jiǎn)便的診斷方法。我國(guó)對(duì)該病的診斷主要依據(jù)臨床癥狀進(jìn)行判斷。國(guó) 外已有很多利用PCR方法從活體組織、組織培養(yǎng)物中檢測(cè)羊痘病毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供一種羊痘病毒檢測(cè)引物對(duì)。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供上述羊痘病毒檢測(cè)試劑盒，以快速、準(zhǔn)確的檢 測(cè)出羊痘病毒，及時(shí)隔離受病羊，避免傳染。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供利用上述羊痘病毒檢測(cè)試劑盒的進(jìn)行羊痘病 毒檢測(cè)的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種用于檢測(cè)羊痘病毒的引物對(duì)，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸 序列。一種羊痘病毒檢測(cè)試劑盒，它包含上述的引物對(duì)。一種羊痘病毒檢測(cè)試劑盒，包括(1)羊痘病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各600 μ L ；(2)羊痘病毒特異性引物對(duì)上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示；下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3) DNA提取試劑采用Geneaid公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)；(4)PCR 反應(yīng)試劑由引物 Pl 15 μ L(IOmM)，弓丨物 P2 15 μ L(IOmM), 2XPCR MasterMix 200 μ L 禾口 ddH20 (超純水)100 μ L 組成；(5)電泳檢測(cè)試劑由50 X TAE電泳緩沖液20mL, GoldView 100 μ L組成。采用上述的試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1) DNA的提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取病毒的 DNA ；(2) PCR 擴(kuò)增25 μ L 體系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；PCR 反應(yīng)條件94°C 3min;然后 94°C 30s，57°C 45s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；(3)瓊脂糖凝膠電泳將0.4g瓊脂糖和20mL 50XTAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取8 μ L點(diǎn)于已凝固 的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(4)判斷結(jié)果如果擴(kuò)增出一條445bp特異性片段，則表明待檢組織羊痘病毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有擴(kuò)增出片段，則表明待檢組織羊痘病毒陰性。有益效果由于本發(fā)明采用的引物來(lái)自羊痘病毒不同基因中高度保守的區(qū)域，采 用該引物對(duì)能準(zhǔn)確、快速、方便的判別病料中是否含有羊痘病毒，靈敏度達(dá)0. 5pg;本研究 針對(duì)羊痘病毒不同基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立一種PCR檢測(cè)羊痘病毒的方法。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，是一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)羊痘的方法，填 補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。


圖1為PCR檢測(cè)電泳圖。其中，1為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL_5000，2 9為羊痘病毒的PCR
擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為PCR方法敏感性試驗(yàn)。其中，1 7為所用摸板的量分別為500ng，50ng, 5ng, 500pg, 50pg, 5pg, 0. 5pg, 8 為標(biāo)準(zhǔn)分子量 DL-5000。圖3為PCR方法檢測(cè)羊痘病毒的特異性鑒定。其中，1為羊口瘡疫苗，2為口蹄疫 疫苗，3為水皰性口炎疫苗，4為羊痘病毒，5為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL-5000。圖4為試劑盒保存不同時(shí)間后PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，1為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL_5000，2為 保存一個(gè)月，3為保存三個(gè)月，4為保存六個(gè)月，5為保存九個(gè)月，6為保存十二個(gè)月。圖5為試劑盒凍融不同次數(shù)后PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，1為凍融1次，2為凍融3次， 3為凍融6次，4為凍融10次，5為凍融20次，6為凍融30次，7為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL-5000。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 試劑盒的制備。1、羊痘病料的獲取。臨床病料于2009年8月采自江蘇省鎮(zhèn)江市發(fā)病羊的痂皮共21份，取0. 5 2. Og 痂皮于無(wú)菌研缽，加生理鹽水研磨，轉(zhuǎn)入1. 5mL的EP管，反復(fù)凍溶2 3次后IOOOOrmp離心5min，取上清于-20°C保存。2、引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中CaPV的全基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè) 引物。CaPV引物如下上游引物Pl (CaPVS) 5' -ACCTAATGGTGCTGTAACTATAAACGG-3‘；下游引物P2 (CaPVA) 5' -TGCCGTCAATGAAGAATGGTTAACTT-3‘。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為445bp。3、試劑盒中其他成分的制造。3. 1 DNA提取試劑購(gòu)自Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)。3.2超純水(ddH20)的制備。購(gòu)自Takara 公司，ImL/ 管。3.3 2 X PCP master Mix 的制備。購(gòu)自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。3. 4 50XTAE電泳緩沖液的制備。0. 5mol/L乙銨四乙酸二鈉((EDTA)溶液(ρΗ8· 0)配制EDTA18. 61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8. 0滅菌雙蒸水加至100mL。50 X TAE電泳緩沖液配制三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL滅菌雙蒸水加至1000mL。使用時(shí)滅菌雙蒸水稀釋50倍。3. 5 Glodview核酸染料的制備。購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，ImL/管。3.6上樣緩沖液的制備。購(gòu)自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。3.7引物的制備。引物由上海英俊合成，20D/管。實(shí)施例2 檢測(cè)方法。主要儀器如下PCR 擴(kuò)增儀(Mastercycler、Eppendorf)冷凍離心機(jī)(2-16P，Sigma)紫外凝膠成像儀(BioSpectrumImaging Systems, UVP)
電泳槽(JY-SP-C，北京君一)具體方法如下
UDNA的提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取病毒的DNA，具體為(Ia)取200uL樣品到1. 5mL的EP管，如果樣品不足200uL,可加PBS Buffer至 200uLo(lb)加入400uL的VB Lysis Buffer到樣品中，旋渦混旋，室溫放置lOmin。(Ic)加入400uL的AD Buffer到樣品中，旋渦混旋。(Id)將VB Column安置于2mL的Collection Tube上。將步驟(Ic)得到的上清 液轉(zhuǎn)移600uL至VB Column中，13000rmp離心lmin，棄濾液。(Ie)將操作Id剩下的上清夜轉(zhuǎn)移至VB Column中，13000rmp離心lmin，棄濾液。(If)加入 400uL 的 Wl Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 離心 30s,棄濾液。(Ig)加入 600uL 的 Wash Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 離心 30s,棄濾液，再 以 13000rmp 離心 3min。(Ih)將干燥的VB Column安置于新的1. 5mL的EP管，在中央處加50uL的無(wú)RNA 酶水，室溫放置3min。13000rmp離心lmin洗脫DNA，收集濾液，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴(kuò)增25 μ L 體系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ；然后 94°C 30s，57°C 45s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。3、瓊脂糖凝膠電泳準(zhǔn)確稱取0. 4g瓊脂糖，加入20mL TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. 0μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取8μ L點(diǎn)于已 凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳lh。4、判斷結(jié)果紫外燈下觀察結(jié)果。如果擴(kuò)增出一條445bp特異性片段，則表明待檢組織羊痘病 毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有擴(kuò)增出片段，則表明待檢組織羊痘病毒陰性，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例3 敏感性試驗(yàn)。以羊痘病料提取的DNA為模板，從50ngDNA開(kāi)始按10倍遞增稀釋，用羊痘PCR反 應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明PCR方法可檢測(cè)出0. 5pg的模 板DNA，具有較高的敏感性，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例4:特異性試驗(yàn)。用相同的方法提取羊口瘡疫苗，口蹄疫疫苗，水皰性口炎疫苗，羊痘病料的DNA，并 以此為摸板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，只有羊痘病毒擴(kuò)增 出一條445bp的片段，將羊痘病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，與Genbank中已發(fā)表的序列進(jìn) 行比較，結(jié)果與已發(fā)表的羊痘基因序列達(dá)98%的同源性，這表明所擴(kuò)增的片段為羊痘病毒， 而羊口瘡疫苗，口蹄疫疫苗，水皰性口炎疫苗都未擴(kuò)增出條帶來(lái)，這表明該方法所擴(kuò)增的片 段為羊痘病毒的特異性片段，結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。將試劑保存于_20°C，經(jīng)過(guò)一年的保存和反復(fù)凍融后，對(duì)羊痘病毒的模板重新進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)圖4和圖5，結(jié)果表明，該試劑盒的穩(wěn)定性較好，可以長(zhǎng)期保存。
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)羊痘病毒的引物對(duì)，其特征在于如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
2.一種羊痘病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊痘病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括(1)羊痘病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各600μ L ；(2)羊痘病毒特異性引物對(duì)上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示；下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3)DNA提取試劑采用Geneaid公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒；(4)PCR反應(yīng)試劑由引物 Pl 15 μ L, Ρ2 15 μ L，2XPCR Master Mix 200 μ L 禾口 ddH20 100 μ L 組成；(5)電泳檢測(cè)試劑由50X TAE電泳緩沖液20mL, GoldView 100 μ L組成。
4.采用權(quán)利要求2所述的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)DNA的提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取病 毒的DNA ；(2)PCR 擴(kuò)增 μ L 體系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl IyL;下游弓 | 物P2 1口1^禾口模板2口1^;PCR 反應(yīng)條件94°C 3min;然后 94°C 30s, 57°C 45s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin ；4°C保存；(3)瓊脂糖凝膠電泳將0. 4g瓊脂糖和20mL 50XTAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取8 μ L點(diǎn)于已凝固 的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(4)判斷結(jié)果如果擴(kuò)增出一條445bp特異性片段，則表明待檢組織羊痘病毒陽(yáng)性；如果沒(méi)有擴(kuò)增出片段，則表明待檢組織羊痘病毒陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)羊痘病毒的引物對(duì)，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序。本發(fā)明還公開(kāi)了包含上述引物對(duì)的檢測(cè)試劑盒及利用該試劑盒檢測(cè)羊痘病毒的方法。由于本發(fā)明采用的引物來(lái)自羊痘病毒不同基因中高度保守的區(qū)域，采用該引物對(duì)能準(zhǔn)確、快速、方便的判別病料中是否含有羊痘病毒，靈敏度達(dá)0.5pg；本研究針對(duì)羊痘病毒不同基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立一種PCR檢測(cè)羊痘病毒的方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點(diǎn)，是一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)羊痘的方法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101948930SQ20101012468
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者張志成, 戴薇, 戴鼎震, 方光遠(yuǎn), 陸靜靜, 陳麗華, 陳瓊, 陳鐘鳴 申請(qǐng)人:金陵科技學(xué)院