專利名稱：一種SecA ATPase抑制劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種kcA ATPase抑制劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa, PA)，又名綠膿桿菌，是假單胞菌屬中的代表菌種。綠膿桿菌是一種非發(fā)酵革蘭氏陰性細(xì)菌，其營養(yǎng)要求不高，廣泛分布于醫(yī)院內(nèi)各種環(huán)境。它可以引起多種類型的感染，如菌血癥、肺炎、腹內(nèi)感染、傷口感染、燒傷感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在著外排多種物質(zhì)的主動外排系統(tǒng)(Active Efflux Systems)，因此多為天然耐多種抗生素菌株，感染后不易被控制。綠膿桿菌對有并發(fā)癥、使用插入式導(dǎo)管、進(jìn)行外科手術(shù)后的病人感染力特別強(qiáng)。研究顯示，醫(yī)院感染中超過60%的死亡率都與綠膿桿菌相關(guān)。綠膿桿菌通過感染病人，毒力可以增強(qiáng)；它甚至能攻擊原是健康的人們，引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、腎炎、胰腺炎等。由此可見，綠膿桿菌是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌，是燒傷、外科手術(shù)后呼吸道感染中的主要因素。 目前的臨床治療策略包括廣譜抗生素的使用(如氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、三代頭孢菌素)和革蘭氏陰性菌選擇性藥物的使用(如氨曲南和哌拉西林)，近年來又推出了 內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合氨基糖苷類或者氟喹諾酮類聯(lián)合治療。但是，廣譜抗生素的大量使用以及藥物的聯(lián)合治療導(dǎo)致了多藥耐藥株以及泛耐藥株的急速出現(xiàn)。近年來，除了多尼培南外沒有新的抗綠膿桿菌藥物入市。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新型低毒、高效抗綠膿桿菌藥物。從成千上萬個微生物代謝產(chǎn)物或其它來源的天然產(chǎn)物中篩選所需的抗菌藥物是非常艱難的一個過程。目前開發(fā)新型有用的天然產(chǎn)物藥物，雖然仍有很大的潛力，但研究工作的難度越來越大，耗時越來越長，需要的資金也越來越多。為擺脫篩選的盲目性，提高效率，有必要進(jìn)行定靶篩選，從細(xì)菌生存所必須的組成成分或者臨床有效抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來設(shè)計篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強(qiáng)、對耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。Sec途徑(即分泌途徑secretion pattiway)是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑。其中，SecA ATPase是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的“動力泵”，它通過ATP的水解循環(huán)驅(qū)使蛋白質(zhì)前體穿過細(xì)菌內(nèi)膜，在細(xì)菌中是獨(dú)有且不可缺少的。將^cA作為篩選抗菌藥物的靶點(diǎn)，有望建立有效的抗菌藥物篩選模型。然而，該項工作進(jìn)展緩慢，到目前為止仍然沒有有關(guān)可行方案的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述不足，本發(fā)明提供一種kcA ATPase抑制劑的篩選方法。本發(fā)明方法包括如下步驟1)配置如下反應(yīng)體系反應(yīng)物終濃度Hepes90 IlOmM
4
MgCl29 ‘ IlmM
MnCl21.8 2. 2mM
ATP9 IlmM
PEP0.9 1. ImM
NADH1.3 1. 7mM
SecAATPase2.5 3· 5μ g/ΙΟΟμ 1
丙酮酸激酶1.6 2. OU/lOOy 1
乳酸脫氫酶1.6 2. OU/lOOy 1
2)設(shè)置如下各反應(yīng)組
i)樣品實(shí)驗組向1)所述反應(yīng)體系中加入適量已知濃度的樣品溶液；
ii)陽性對照組-J毛等體積ddH20代替1)所述反應(yīng)體系中的kcAATPase，抑制率
設(shè)為100%，該組表征kcA ATPase的活性被完全抑制；iii)陰性對照組向1)所述反應(yīng)體系中加入等量的i)所述樣品溶液中除樣品本身外的溶劑及溶質(zhì)；3)反應(yīng)開始后，測定各反應(yīng)組OD340吸光值變化量，計算反應(yīng)抑制率，對反應(yīng)具有抑制作用的即為陽性樣品。上述步驟1)優(yōu)選反應(yīng)體系為
反應(yīng)物終濃度
HepesIOOmM
MgCl2IOmM
MnCl22mM
ATPIOmM
PEPImM
NADHCl. 5mM
SecA ATPase3μ g/ΙΟΟμ 1
丙酮酸激酶1. 8U/100y 1
乳酸脫氫酶1. 8U/100y 1
上述步驟2)中樣品為化合物時，優(yōu)選向200 μ 1反應(yīng)體系中加入1 μ 1
樣品溶液作為樣品實(shí)驗組；當(dāng)樣品為發(fā)酵液時，優(yōu)選按照10μ 1發(fā)酵液揮干后制成1的樣品溶液，加入反應(yīng)體系作為樣品實(shí)驗組。 上述步驟3)從各組反應(yīng)體系分別混合均勻后開始測定OD34tl吸光值。具體可按照以下方法進(jìn)行將2)各組反應(yīng)體系分別混勻后加入同一塊96孔板中，置于酶標(biāo)儀內(nèi)，開啟溫控為37°C進(jìn)行反應(yīng)。以反應(yīng)起始時間為0時刻，每隔2分鐘檢測一次各孔反應(yīng)體系在 340nm波長處的吸光值OD34tl,連續(xù)檢測50min (25次)。
結(jié)果分析
分別計算各孔的A0D34(1/min，
AN-AS
再依公式抑制率IR = 其中
AN-AP
χ 100%計算各孔的抑制率。
Δ N是陰性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量。Δ P是陽性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量。Δ S是樣品實(shí)驗孔平均每分鐘吸光值的變化量。在本發(fā)明實(shí)施方案中，通過體外表達(dá)綠膿桿菌kcAN68蛋白，分離純化得到 I^kCAN68蛋白，按照上述方法從組合化學(xué)庫、微生物次級代謝產(chǎn)物庫以及天然產(chǎn)物庫中共篩選5316個樣品，其中3220個化合物，2096個發(fā)酵液樣品，初篩陽性率79/5316 = 1.5%, 復(fù)篩陽性率49/5316 = 0.9% (以抑制率大于30 %為篩選陽性標(biāo)準(zhǔn))。其中，活性化合物三個，分別為 IMB202950U IMB2030271 和 IMB2039021，抑制率分別為 32. 8%、43. 0%和 66. 8%。抑菌試驗表明這三個化合物對綠膿桿菌均具有良好的抑制作用。本發(fā)明kcA ATPase抑制劑的篩選方法簡單可靠，效率高，成本低，是一種理想的抗生素篩選方法。
在不背離
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1樣品篩選本例中以綠膿桿菌SecA酶為例，說明抗菌藥物的篩選方法。一、重組I^akcANeS蛋白的制備l、pET20b/pasecAN68 質(zhì)粒的構(gòu)建以綠膿桿菌基因組DNA為模板，通過PCR方法擴(kuò)增paSeCAN68基因全序列(SEQ ID No. 3)。引物序列為上游引物 5’ GAGATATA CATATG TTTGCGCCTTTG 3’ ；下游引物 5’ AAGCTL ACAGCGCCTTCATGA 3，。斜體部分分別是Nde I和HindIII的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系包括
模板(基因組DNA)1 μ 1
上游引物(20pM)1 μ 1
下游引物(20pM)1 μ 1
2XPfu Mixture25 μ 1
無核酸酶ddH2022 μ 1
總體積50 μ 1
PCR反應(yīng)的條件為
95°C預(yù)變性5min
權(quán)利要求
1. 一種篩選kcAATPase抑制劑的方法，包括如下步驟: 1)配置如下反應(yīng)體系反應(yīng)物終濃度Hepes90 --IlOmMMgCl29 ‘IlmMMnCl21.8 . 2. 2mMATP9 IlmMPEP0.9 1. ImMNADH1.3 1. 7mMSecA ATPase2.5 3· 5μ g/ΙΟΟμ 1丙酮酸激酶1.6 2. OU/lOOy 1乳酸脫氫酶1.6 2. OU/lOOy 12)設(shè)置如下各反應(yīng)組i)樣品實(shí)驗組向1)所述反應(yīng)體系中加入適量已知濃度的樣品溶液；ii)陰性對照組用等體積ddH20代替1)所述反應(yīng)體系中的kcAATPase；iii)陽性對照組向1)所述反應(yīng)體系中加入等量的i)所述樣品溶液中除樣品本身外的溶劑及溶質(zhì)；3)反應(yīng)開始后，測定各反應(yīng)組OD34tl吸光值變化量，計算反應(yīng)抑制率，對反應(yīng)具有抑制作用的即為陽性樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系為 反應(yīng)物終濃度HepesIOOmMMgCl2 IOmMMnCl2 2mMATPIOmMPEPImMNADH1. 5mMSecA ATPase 3μ g/ΙΟΟμ 1丙酮酸激酶 1.8υ/100μ1乳酸脫氫酶 1.8υ/100μ1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步驟2)中樣品為化合物時，向 200 μ 1反應(yīng)體系中加入1 5mg/ml的樣品溶液作為樣品實(shí)驗組；當(dāng)樣品為發(fā)酵液時，按照10 μ 1發(fā)酵液揮干后制成1的樣品溶液，加入反應(yīng)體系作為樣品實(shí)驗組。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步驟3)將2)各組反應(yīng)體系分別混勻后加入同一塊96孔板中，置于酶標(biāo)儀內(nèi)，開啟溫控為37°C進(jìn)行反應(yīng)，以反應(yīng)起始時間為0 時刻，每隔2分鐘檢測一次各孔反應(yīng)體系在340nm波長處的吸光值OD34tl,連續(xù)檢測50min，結(jié)果分析分別計算各孔的A0D34(1/min，再依公式抑制率IR= -1fO χ οο%計算各孔的抑制率；AN -AP其中ΔN是陰性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量， ΔP是陽性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量， ΔS是樣品實(shí)驗孔平均每分鐘吸光值的變化量。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，抑制率大于30%的樣品為陽性樣品。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述SecAATPase為蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選SecA ATPase抑制劑的方法，該方法提供了一種優(yōu)化的ATPase酶活測定體系，建立了SecA蛋白ATPase活性抑制劑的蛋白水平篩選模型。本發(fā)明方法簡單可靠，效率高，成本低，是一種理想的抗生素篩選方法。運(yùn)用該篩選方法從化合物庫的3220個樣品中篩選得到可抑制綠膿桿菌SecA ATP酶的活性陽性化合物3個。從2096個微生物代謝粗提物中得到45個陽性樣品，篩選陽性率為0.9％(以抑制率大于30％為篩選陽性標(biāo)準(zhǔn))。
文檔編號C12Q1/32GK102212610SQ201010141329
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者余利巖, 李秋萍, 王宇, 趙莉莉, 魏玉珍 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所