專利名稱：肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株及其建立方法，具體涉及能穩(wěn)定表達紅色 熒光蛋白(RFP)、具肺靶向轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞株HCCLM3-R-LM1及其建立方法，屬于微 生物動物細(xì)胞系技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國乃至全球的高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位列 惡性腫瘤第二位。臨床上有多種方法治療肝癌，如手術(shù)切除、TACE、瘤內(nèi)酒精注射、射頻治療 和放射治療等，但長期療效有限。根據(jù)復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所對9，800多例肝癌手術(shù)患者的 臨床長期隨訪資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，肝癌患者手術(shù)后5年的生存率仍低于50%，其主要死亡原因 為肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。臨床上肝癌患者常出現(xiàn)肝外淋巴結(jié)和肺臟轉(zhuǎn)移，而目前國內(nèi)外缺乏相應(yīng)的研究 對象，對肝癌細(xì)胞的器官靶向性轉(zhuǎn)移分子機理知之甚少，也缺乏必要的干預(yù)手段。為此， 復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所在世界上率先建立了具有自主知識產(chǎn)權(quán)和國家專利的裸鼠人肝癌轉(zhuǎn) 移模型(LCI-D20) (Sun FX, et al. Int J Cancer. 1996 ;66 :239_243.)，克隆到了具有高 轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系(MHCC97) (Tian J，et al. Br J Cancer. 1999 ；81 814-821.), 篩選出了具有相同遺傳背景的、不同轉(zhuǎn)移潛能的系列肝癌細(xì)胞株(MHCC97-H，MHCC97-L) (LiY, et al. World J Gastroenterol. 2001 ；7 630-636.專利號 WO 2003/087766 A3, ZL2003 1 0122611. 5)和高轉(zhuǎn)移特性的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HCCLM3和HCCLM6(J Cancer ResClin Oncol. 2004 ；130 :187_196 J Cancer Res Clin Oncol. 2004 ；130 :460_468 ； 中華醫(yī)學(xué)雜志.2004 ；84 675-679 ；Cancer Genet Cytogenet. 2005 ；158 180-183 ； Clin CancerRes. 2006 ；12 :7140_7148)，并進一步發(fā)展了 RFP 和 GFP 熒光標(biāo)記的肝癌 細(xì)胞(HCCLM3RFP/GFP，HCCLM6RFP/GFP)和相應(yīng)的熒光可視肝癌轉(zhuǎn)移模型(Yang Bff, et al. EurJ Gastroenterol Hepatol. 2008 ；20-1077-1084.專利申請?zhí)?00710045676. 2 ；和 200710045675. 8)。國內(nèi)外文獻中均未見到關(guān)于能穩(wěn)定表達熒光的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定表達熒光的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株及其建立方法， 更具體的是建立染色體整合型、穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白編碼基因的、具有肺靶向轉(zhuǎn)移能力 的人肝癌細(xì)胞系。本發(fā)明以紅色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R為母細(xì)胞，采用裸鼠皮下及肝臟 原位移植瘤模型自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移篩選，肺轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞再進行體外克隆擴增純化的方法， 建立了一種肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株(HCCLM3-R-LM1)。已于2010年3月3日保藏，保藏 單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號3644，分類命名肺靶向轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株(HCCLM3-R-LM1)。所述紅色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R參見中國專利200710045676. 2。已于 2010年3月3日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號3643，分類命名表達紅色熒光蛋白的人肝 癌細(xì)胞株(HCCLM3-R)。所述裸鼠皮下及肝臟原位移植瘤模型參見中國專利200710045675. 8。本細(xì)胞株具有以下生物學(xué)特性1、與母細(xì)胞具有相同的遺傳背景，細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑 制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，均分泌AFP蛋白；2、可穩(wěn)定表達高強度紅色熒光轉(zhuǎn)染的紅色熒光蛋白編碼基因與中國專利 200710045676. 2中所述具有序列1的紅色熒光蛋白RFP相同，經(jīng)過基因改造，能夠有效延緩 熒光淬滅時間，增加熒光表達強度，在激發(fā)波長為560nm、發(fā)射波長為585nm的條件下，可用 熒光顯微鏡進行觀察；3、遺傳性狀穩(wěn)定、可在常規(guī)條件下連續(xù)傳代。4、與母細(xì)胞相比，除了具有母細(xì)胞所具有的生物學(xué)特性以外，還表現(xiàn)出另外兩個 特征，其一，比母細(xì)胞具有更強的轉(zhuǎn)移能力；其二，與母細(xì)胞包含不同靶向轉(zhuǎn)移亞克隆的高 異質(zhì)性相比，本細(xì)胞異質(zhì)性更低，具有肺靶向轉(zhuǎn)移克隆選擇優(yōu)勢，在裸鼠肝臟原位移植后第 2周首先出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率約為42. 9%，第3周約為85. 7%，至第4周100%出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移， 而腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在第3周開始出現(xiàn)，約57. 1%，第4周約71. 5%，晚期可全身轉(zhuǎn)移。所述的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株的建立方法，其特征在于，具體步驟為以紅 色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R為母細(xì)胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，得到皮下腫瘤小 塊；建立裸鼠肝臟移植瘤模型，將皮下腫瘤小塊植入裸鼠的肝臟表面；42天后，處死裸鼠， 開胸取出完整兩肺，將肺轉(zhuǎn)移灶組織碾磨、離心得到細(xì)胞沉淀，經(jīng)培養(yǎng)和逐級克隆，分選獲 得肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株。本發(fā)明以高轉(zhuǎn)移特性肝癌細(xì)胞株HCCLM3R為母本細(xì)胞，采用裸鼠肝臟原位腫瘤移 植模型(參見申請專利200710045675. 8)中的肺轉(zhuǎn)移灶肝癌細(xì)胞作為克隆對象，經(jīng)體外培 養(yǎng)擴增獲得；肺靶向轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1經(jīng)裸鼠肝臟原位腫瘤移植模型確認(rèn)首 先發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；所獲肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1與母本肝癌細(xì)胞HCCLM3R具有相同的遺傳背 景；具有表達高強度紅色熒光、遺傳性狀穩(wěn)定、可連續(xù)傳代、肺靶向轉(zhuǎn)移克隆選擇優(yōu)勢等特 性。本發(fā)明獲得紅色熒光表達的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1在體外常規(guī) 的二維及三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長良好，可用于肝癌轉(zhuǎn)移尤其是器官靶向轉(zhuǎn)移分子機理的 研究；或作為抗肝癌轉(zhuǎn)移新藥療效判別的效應(yīng)細(xì)胞。此外，還可作為裸鼠皮下接種的肝癌細(xì) 胞，用于裸鼠皮下和肝臟原位熒光示蹤肝癌模型的建立，為盡早發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)人肝癌器官 靶向轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的變化提供參考，以及為在體抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥或其他干預(yù)治療的效 果評估提供便利。本發(fā)明在肝癌基礎(chǔ)研究及藥物臨床前期研究中具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的社 會與經(jīng)濟價值。


圖1為不同時間節(jié)點裸鼠肺中的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況示意圖；圖2為不同時間節(jié)點裸鼠腹腔淋巴結(jié)中的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況示意圖；
圖3為不同時間節(jié)點裸鼠肺和腹腔淋巴結(jié)中的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量示意圖；圖4為不同時間節(jié)點裸鼠肺和腹腔淋巴結(jié)中的肝癌細(xì)胞熒光面積示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。實施例11、建立HCCLM3R裸鼠皮下移植瘤模型BALB/c nu/nu雄性裸鼠，5_6周齡，體重 15-18克，飼養(yǎng)在無特定病原體的我所裸鼠室中。背部左側(cè)皮下注射體外培養(yǎng)的肝癌高轉(zhuǎn)移 熒光細(xì)胞HCCLM3R，劑量為2X107細(xì)胞/只，生長4周后無菌取皮下腫瘤，切成Imm3左右的 腫瘤小塊、供后續(xù)實驗。2、建立HCCLM3R裸鼠肝臟移植瘤模型定位裸鼠肝臟、消毒肝臟外皮膚、無菌切開 皮膚暴露小鼠肝臟、用鑷子分離肝包膜并劃開一個小口，將腫瘤小塊植入肝臟表面，縫合肝 包膜和皮膚。3、肺轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞的獲取原位移植瘤生長至第42天，處死裸鼠，開胸取出完 整兩肺，觀察肺轉(zhuǎn)移灶大小和數(shù)目(Leica熒光體視顯微鏡，IPP軟件)，經(jīng)熒光定位取5_10 個2mm3的肺轉(zhuǎn)移灶組織。4、肺轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞的克隆和擴增用200目的濾網(wǎng)，將肺轉(zhuǎn)移灶組織碾磨成細(xì) 胞懸液，離心(1500rpmX5min)取細(xì)胞沉淀。用1 XPBS液洗滌3次后，轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞重 懸于含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，置37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)和逐級克隆，直至分選 獲得單克隆肝癌細(xì)胞，常規(guī)液氮保存?zhèn)溆谩?、肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1的功能鑒定制備肺轉(zhuǎn)移性 HCCLM3-R-LM1肝癌細(xì)胞裸鼠皮下和肝臟原位移植瘤。每隔一周處死肝癌原位移植瘤的裸 鼠，觀察不同時間節(jié)點裸鼠肺和淋巴結(jié)中的肝癌轉(zhuǎn)移情況。圖1和圖2分別為不同時間節(jié) 點裸鼠肺和腹腔淋巴結(jié)中的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況示意圖；圖3為不同時間節(jié)點裸鼠肺和腹腔 淋巴結(jié)中的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量示意圖；圖4為不同時間節(jié)點裸鼠肺和腹腔淋巴結(jié)中的肝癌 細(xì)胞熒光面積示意圖。結(jié)果表明，本發(fā)明所獲的肺靶向轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1經(jīng)裸鼠肝臟原位 腫瘤移植模型確認(rèn)首先發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，隨后陸續(xù)出現(xiàn)全身其它部位轉(zhuǎn)移；其與母本肝癌細(xì)胞 HCCLM3R具有相同的遺傳背景；具有表達高強度紅色熒光、遺傳性狀穩(wěn)定、可連續(xù)傳代、肺 靶向轉(zhuǎn)移克隆選擇優(yōu)勢等特性。經(jīng)體外長期連續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，紅色熒光表達強度高、熒光不易 被淬滅，熒光表達穩(wěn)定，是較為理想的熒光示蹤、器官靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞?？稍隗w外二 維及三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中作為熒光標(biāo)記的實驗細(xì)胞，用于肝癌轉(zhuǎn)移的分子機理研究；也可 作為療效判別細(xì)胞用于抗肝癌轉(zhuǎn)移新藥的療效觀察；也可作為裸鼠皮下接種的熒光標(biāo)記肝 癌細(xì)胞，用于熒光可視人肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌裸鼠皮下模型和肝臟原位模型的建立，用于 肝癌轉(zhuǎn)移早期生物學(xué)行為的監(jiān)視，以及在體藥物或其他干預(yù)治療效果的評估。
權(quán)利要求
一種肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株，母細(xì)胞為紅色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R，其特征在于，所述細(xì)胞為分類命名肺靶向轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株HCCLM3-R-LM1，保藏編號3644，具有以下生物學(xué)特性細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，均分泌AFP蛋白，可穩(wěn)定表達高強度紅色熒光，遺傳性狀穩(wěn)定、可在常規(guī)條件下連續(xù)傳代、肺靶向轉(zhuǎn)移克隆選擇優(yōu)勢，在裸鼠肝臟原位移植后第2周42.9％出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，第3周有85.7％出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，第4周達100％，而腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率第3周57.1％，第4周為71.5％，晚期可全身轉(zhuǎn)移。
2.如權(quán)利要求1所述的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株，其特征在于，所述肺靶向轉(zhuǎn)移性 人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R-LM1的熒光顯微鏡觀察條件是激發(fā)波長560nm，發(fā)射波長585nm。
3.權(quán)利要求1所述的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株的建立方法，其特征在于，具體步驟 為以紅色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R為母細(xì)胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，得到皮 下腫瘤小塊；建立裸鼠肝臟移植瘤模型，將皮下腫瘤小塊植入裸鼠的肝臟表面；42天后，處 死裸鼠，開胸取出完整兩肺，將肺轉(zhuǎn)移灶組織碾磨、離心得到細(xì)胞沉淀，經(jīng)培養(yǎng)和逐級克隆， 分選獲得肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明提供了肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株及其建立方法。所述的肺靶向轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株，其特征在于，母細(xì)胞為紅色熒光蛋白表達肝癌細(xì)胞HCCLM3-R，所述細(xì)胞為分類命名肺靶向轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株HCCLM3-R-LM1，保藏編號3644，具有以下生物學(xué)特性細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，均分泌AFP蛋白、肺靶向轉(zhuǎn)移克隆選擇優(yōu)勢。所述的建立方法包括采用裸鼠皮下及肝臟原位移植瘤模型自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移篩選，肺轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞再進行體外克隆擴增純化。本發(fā)明在肝癌基礎(chǔ)研究及藥物臨床前期研究中具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的社會與經(jīng)濟價值。
文檔編號C12R1/91GK101831405SQ20101015328
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者吳偉忠, 孫惠川, 李薇薇, 樊嘉, 湯釗猷, 王魯, 欽倫秀, 陶中華 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院