專利名稱：：一種含貝母的中成藥中川貝母的分子生物學(xué)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種基于基因組RAPD分析的、用于各種含貝母的中成藥中川貝母的分子生物學(xué)鑒定方法。
背景技術(shù)：
：貝母為百合科Liliaceae貝母屬FritillariaL.多種植物的干燥鱗莖，是常用中藥之一，2010年版《中華人民共和國藥典》收載貝母分為五大類川貝母、湖北貝母、平貝母、伊貝母、浙貝母，其中川貝母為百合科植物卷葉貝母F.CirrhosaD.Don、暗紫貝母F.unibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肅貝母F.przewalskiiMaxim,exBatal、梭砂貝母F.delavayiFranch、太白貝母F.taipaiensisP.Y.Li禾口瓦布貝母F.wabuensisS.Y.TangetS.C.Yueh的干燥鱗莖。由于川貝母療效良好及資源稀少等原因，始終是貝母類藥材中最為昂貴的品種，因此藥材市場上以及各種含貝母的中成藥中也屢見用其他貝母冒充川貝母的現(xiàn)象。常規(guī)的性狀、顯微以及理化鑒定方法不能將它們區(qū)別開，而分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使得各種貝母的準確鑒定成為了可能。目前對于川貝母的DNA分子鑒定，有采用聚合酶鏈反應(yīng)_限制性酶切圖譜鑒定方法PCR-RFLP(中國發(fā)明專利CN03131798.7)和特異引物PCR方法(PlantaMed2003；69184-186)，前者可將川貝母與其他貝母藥材區(qū)別開，后者能鑒別卷葉貝母。但是，這些方法對供試材料的要求較高，只能鑒定新鮮鱗莖和葉子，而不能對各種含貝母的中成藥，如片齊U、散劑、丸劑等制劑中原料藥材進行準確鑒定。因此尋找鑒定中成藥中川貝母的方法具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種基于基因組RAPD分析的含貝母中成藥中貴重原料藥川貝母的鑒定方法，它克服了常規(guī)鑒定方法如性狀、顯微、理化鑒定的不足。本發(fā)明含貝母中成藥中川貝母的鑒定方法包括建立川貝母的隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜和待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜，將兩者進行比對，在待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜中找到與標準圖譜對應(yīng)的條帶，則判定待鑒定中成藥中貝母成分為川貝母，反之則不是川貝母。上述方法中，建立隨機擴增多態(tài)DNA圖譜的方法包括a、標準品或中成藥經(jīng)處理粉碎成細粉后，預(yù)處理除色素，用CTAB法提取各基因組DNA。b、將所提取基因組DNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)，得到隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物。C、用瓊脂糖凝膠對隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物進行電泳，電泳后在紫外光下照相，這一步驟也是本領(lǐng)域常規(guī)的方法，采用標準品的則得到隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜，采用待鑒定中成藥的則得到待鑒定中成藥的隨機擴增多態(tài)DNA圖譜。電泳較好的方法是用1.5%的瓊脂糖凝膠分別對隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物進行電泳分離，GelRad直接加在凝膠中，上樣量IOyLJnZyL6Χ凝膠加樣緩沖液，IOOV下恒壓電泳lh。電泳結(jié)束后用GelDoc2000在紫外光下照相。本發(fā)明中，基因組DNA預(yù)處理優(yōu)選的方法是經(jīng)組成為200μmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH8.0;50μmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0和250μmol/L氯化鈉的TNE液和2%的β-巰基乙醇冰浴30min。本發(fā)明中，優(yōu)選的提取基因組DNA的CTAB提取液為4%十六烷基三甲基溴化銨；lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH8.0;20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0;1.4mol/L氯化鈉；9%聚乙烯吡咯烷酮；0.1%β-巰基乙醇和0.牛血清白蛋白。優(yōu)選的水浴溫度為90°C，水浴時間2h。提取過程中加入1/3體積醋酸鉀冰浴去蛋白，沉淀DNA時加入1/2體積的5mol/L氯化鈉使多糖盡可能留在溶液中。本發(fā)明中，優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)條件如下10X聚合酶鏈式反應(yīng)緩沖液2.5μL；濃度為IU/μL的TaqDNA聚合酶1.5μL；濃度為25謹ol/L的氯化鎂2μL；濃度為10μmol/L的隨機擴增多態(tài)引物0.75μL；濃度為IOmmol/L的dNTPs0.75μL；模板DNA1.5μL；滅菌超純水16μL0本發(fā)明中，優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)擴增程序如下95°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，擴增40個循環(huán)；最后于72°C延伸IOmin補齊反應(yīng)。本發(fā)明中，優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)的引物為下列引物之一TCACGTCCAC(上海生工生物工程公司合成，編號S88)、CAGCTCACGA(編號S92)、GGGAATTCGG(編號S126)、GGGCCACTCA(編號S201)、AGGGAACGAG(編號S17)、GAAACGGGTG(編號S27)、GGGTAACGCC(編號S29)、GTGAGGCGTC(編號S62)。更優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)的引物為下列引物之一S88TCACGTCCAC、S92CAGCTCACGA、S126GGGAATTCGG、S201GGGCCACTCA。其中S88在約550bp處產(chǎn)生川貝特異性條帶，S92的特異性條帶出現(xiàn)在約250bp處，在約200bp處有S126擴增的特異性條帶，S201在約500bp分子量處有川貝特異條帶。還優(yōu)選的聚合酶鏈式反應(yīng)的引物為下列引物之一S17AGGGAACGAG、S27GAAACGGGTG、S29GGGTAACGCC、S62GTGAGGCGTC,這幾個引物能將川貝類內(nèi)六種川貝母鑒別開。其中S62能清晰地鑒別6個不同基源川貝，S卩暗紫貝母、甘肅貝母、卷葉貝母、梭砂貝母、太白貝母、瓦布貝母，每個種都有特異性條帶；S17、S27、S29中太白貝母和瓦布貝母的主條帶相近，其它四種川貝母均有特異性條帶。本發(fā)明的效果體現(xiàn)在下述方面1)本發(fā)明采用RAPD分子標記構(gòu)建含貝母的中成藥中川貝母成分的指紋圖譜，使中成藥中川貝母成分的準確鑒定成為可能，對于保證藥材基源的準確性和穩(wěn)定性具有重要的作用，與常規(guī)鑒定方法相比有取樣少、不受植物生長環(huán)境條件和加工影響等優(yōu)點。2)本發(fā)明對PCR擴增反應(yīng)體系和擴增程序進行了優(yōu)化，使結(jié)果更為穩(wěn)定和可靠。3)本發(fā)明所選擇隨機擴增多態(tài)引物，除了可以鑒定貝母中成藥中川貝類與其它類貝母，還可以用于川貝母的六個基源鑒別。4)本發(fā)明能用來鑒別不同劑型的貝母中成藥中川貝母成分，如散劑、片劑、膠囊等。5)利用本發(fā)明所提供的指紋圖譜很容易實現(xiàn)中成藥成分鑒定的自動化。6)本發(fā)明除了可用于川貝中成藥鑒定以外，還可以借鑒用于其它中成藥中貴重原料藥的鑒定。圖1為引物S88對蛇膽貝母散的RAPD擴增產(chǎn)物電泳2為引物S62對蛇膽貝母散的RAPD擴增產(chǎn)物電泳圖具體實施例方式實施例1本實施例用收集到的川貝母六個基源的十二個干燥鱗莖和其它四類貝母各一個干燥鱗莖與蛇膽按蛇膽川貝散組成比例(61)配制各蛇膽貝母散做為供試材料(見表1)，提取基因組DNA，進行指定引物的RAPD分子標記分析，用瓊脂糖凝膠電泳條帶建立標準指紋圖譜，用于中成藥川貝成分的鑒定。具體操作步驟如下1)、各蛇膽貝母散粉碎成極細粉后，再經(jīng)TNE液[200μπιΟ1/1三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液，PH8.0；50μmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0和250μmol/L氯化鈉]預(yù)處理，用改進的CTAB法提取基因組DNA。操作如下(1)稱取0.Ig粉末于一2mL離心管中，加入TNE液1500μL和β-巰基乙醇30μL，冰浴30min后4°CIOOOOrpm離心IOmin；(2)棄上清，加4XCTAB[4%十六烷基三甲基溴化銨；lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH8.0;20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0;1.4mol/L氯化鈉；9%聚乙烯吡咯烷酮]β-巰基乙醇和1.5yL牛血清白蛋白，混勻，90°C水浴2h；(3)加入I/3體積醋酸鉀后冰浴3Omin,4°C12000rpm離心Ιδπη；(4)取上清于另一2mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(241),IlOOOrpm離心IOmin；(5)取上清于另一2mL離心管中，加入1/10體積的10%CTAB[10%十六烷基三甲基溴化銨，0.7mol/L氯化鈉]，輕輕混勻，室溫放置lOmin，再加等體積的氯仿-異戊醇(241)，混合均勻，IlOOOrpm離心IOmin,重復(fù)抽提2次；(6)吸取上清液，加入1/2倍體積的5mol/L氯化鈉和0.7倍體積的異丙醇(_20°C預(yù)冷)，于_20°C冷凍2h；(7)40C12000rpm離心15min，倒出上清液，將離心管倒置于吸水紙上吸干液體，向管內(nèi)加入70%乙醇約200μL清洗2次，每次清洗后4°C12000rpm離心3min，輕輕倒掉殘留的乙醇。(8)干燥后，加入50μL滅菌超純水，放入4°C冰箱中備用。2)、將所提取基因組DNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)，得到隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物。其中，聚合酶鏈式反應(yīng)條件如下10X聚合酶鏈式反應(yīng)緩沖液2.5μL；濃度為IU/μL的TaqDNA聚合酶1.5μL；濃度為25mmol/L的氯化鎂2μL；濃度為10μmol/L的隨機擴增多態(tài)引物0.75μL；濃度為10mmol/L的dNTPs0.75μL；模板DNA1.5μL；滅菌超純水16μL。聚合酶鏈式反應(yīng)擴增程序為95°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，擴增40個循環(huán)；最后于72°C延伸IOmin補齊反應(yīng)。聚合酶鏈式反應(yīng)所述的引物為S88TCACGTCCAC。3)、用1.5%的瓊脂糖凝膠分別對隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物進行電泳分離，GelRad直接加在凝膠中，上樣量IOyL,力口2yL6XLoadingBuffer，IOOV下恒壓電泳Ih；4)、電泳結(jié)束后用GelDoc2000在紫外光下照相，得到中成藥中川貝母成分的隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜。表1中成藥原料產(chǎn)地<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1為引物S88(TCACGTCCAC)對十六個蛇膽貝母散的RAPD標記分析電泳圖，其中1為空白對照；2、3為蛇膽瓦布貝母散(所用瓦布貝母依次為W2、Wl)；4、5為蛇膽太白貝母散(所用太白貝母依次為T2、Tl)；6、7為蛇膽梭砂貝母散(所用梭砂貝母依次為S2、S1)；8、9為蛇膽卷葉貝母散(所用卷葉貝母依次為J2、Jl)；10、11為蛇膽甘肅貝母散(所用甘肅貝母依次為G2、Gl)；12、13為蛇膽暗紫貝母散(所用暗紫貝母依次為A2、A1)；14為蛇膽浙貝母散；15為蛇膽伊貝母散；16為蛇膽平貝母散；17為蛇膽湖北貝母散；M為200bpDNALaddero可以看出該引物能鑒別蛇膽川貝散與其它蛇膽貝母散(箭頭所示為蛇膽川貝散特異條帶)。實施例2本實施例供試材料和操作步驟同實施例1，其中隨機擴增多態(tài)引物為S62GTGAGGCGTC，建立標準指紋圖譜用于中成藥川貝不同基源的鑒定。圖2為引物S62(GTGAGGCGTC)對十六個蛇膽貝母散的RAPD標記分析電泳圖，標記與圖1相同。可以看出該引物能鑒別蛇膽川貝散中各川貝母的基源(箭頭所示為各蛇膽川貝散的特異條帶)。權(quán)利要求一種含貝母中成藥中川貝母的鑒定方法，其特征是包括建立中成藥中川貝母的隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜和待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜，將兩者進行比對，在待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜中找到與標準圖譜對應(yīng)的條帶，則判定待鑒定中成藥中貝母成分為川貝母，反之則不是川貝母。2.權(quán)利要求1的鑒定方法，建立隨機擴增多態(tài)DNA圖譜的方法包括a、標準品或中成藥經(jīng)處理粉碎成細粉后，預(yù)處理除色素，用CTAB法提取各基因組DNA；b、將所提取基因組DNA進行聚合酶鏈式擴增反應(yīng)，得到隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物；c、用瓊脂糖凝膠對隨機擴增多態(tài)DNA產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)束后在紫外光下照相，得到隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜或待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜。3.權(quán)利要求2的鑒定方法，其中聚合酶鏈式反應(yīng)條件如下10X聚合酶鏈式反應(yīng)緩沖液2.5iiL；濃度為1U/iiL的TaqDNA聚合酶1.5yL；濃度為25mmol/L的氯化鎂2yL；濃度為10umol/L的隨機擴增多態(tài)引物0.75iiL；濃度為lOmmol/L的dNTPs0.75uL；模板DNA1.5uL；滅菌超純水16uL。4.權(quán)利要求2的鑒定方法，其中聚合酶鏈式反應(yīng)擴增程序如下95°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，擴增40個循環(huán)；最后于72°C延伸lOmin補齊反應(yīng)。5.權(quán)利要求2的鑒定方法，其中聚合酶鏈式反應(yīng)引物的堿基序列選自TCACGTCCAC、CAGCTCACGA、GGGAATTCGG、GGGCCACTCA、AGGGAACGAG、GAAACGGGTG、GGGTAACGCC或GTGAGGCGTC。6.權(quán)利要求5的鑒定方法，其中聚合酶鏈式反應(yīng)引物的堿基序列選自TCACGTCCAC、CAGCTCACGA、GGGAATTCGG或GGGCCACTCA。7.權(quán)利要求5的鑒定方法，其中聚合酶鏈式反應(yīng)引物的堿基序列選自AGGGAACGAG、GAAACGGGTG、GGGTAACGCC或GTGAGGCGTC。全文摘要本發(fā)明屬于中藥鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公開了一種含貝母的中成藥中川貝母的分子生物學(xué)鑒定方法，其特征是本發(fā)明基于基因組RAPD分析，建立川貝母的隨機擴增多態(tài)DNA標準圖譜和待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜，將兩者進行比對，在待鑒定中成藥隨機擴增多態(tài)DNA圖譜中找到與標準圖譜對應(yīng)的條帶，則判定待鑒定中成藥中貝母成分為川貝母，反之則不是川貝母。本發(fā)明克服了常規(guī)鑒定方法如性狀、顯微、理化鑒定的不足。文檔編號C12Q1/68GK101831494SQ20101015594公開日2010年9月15日申請日期2010年4月27日優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日發(fā)明者徐傳林,李會軍,李萍申請人:中國藥科大學(xué)