專利名稱：參與顯花植物花粉自交不親和性異交親和性控制的蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及與顯花植物，如茄科類自交不親和性花粉異交親和性控制的相關(guān)蛋白質(zhì)及其編碼基因SSK1，以及利用轉(zhuǎn)基因RNAi下調(diào)花粉中該基因的表達(dá)所起到的花粉異交親和性喪失的功能；同時還涉及對該基因所編碼的蛋白序列比較分析等。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是DNA重組技術(shù)之一，轉(zhuǎn)基因植物自1983年首次在煙草中獲得成功以后，至今已有35科120多種植物中獲得成功。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過外源基因的導(dǎo)入， 使得作物具有其原本沒有的優(yōu)良的品質(zhì)和屬性，因此可以提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，減少除草劑和殺蟲劑等農(nóng)藥的使用量，進(jìn)而可以節(jié)省大量的勞動力，是解決全球糧食問題和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要的手段。自20世紀(jì)80年代以來，隨著生物基因工程技術(shù)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在生產(chǎn)上大面積的推廣應(yīng)用。據(jù)2009年2月23日年農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國際服務(wù)組織(ISAAA)發(fā)布的《2008年度全球生物技術(shù)作物商業(yè)化現(xiàn)狀報告》統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積有1. 02億hm2，種植國家有22個[1]。但是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)同樣也是一把“雙刃劍”。在作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶給人們巨大的科學(xué)發(fā)展、經(jīng)濟效益和社會效益的同時，同樣也對生態(tài)環(huán)境和人類健康等多方面可能造成的潛在的危險 。這些關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物安全性的問題受到越來越多的關(guān)注。目前認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物所可能帶來的安全性問題主要表現(xiàn)在如下幾個方面。第一，轉(zhuǎn)基因作物可能造成環(huán)境和健康的生物安全性問題。轉(zhuǎn)基因作物通常帶有抗性篩選基因，有人認(rèn)為這些抗性標(biāo)記有可能影響人類抗生素藥物的治療效果。另外目前轉(zhuǎn)基因作物所帶有轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因大多為抗蟲、抗病類基因，轉(zhuǎn)基因的方法也通常為病原菌或是病毒介導(dǎo)，因此帶有這些基因的病原菌和病毒的外流有可能產(chǎn)生新的致病性病毒^。第二，轉(zhuǎn)基因作物可能造成生態(tài)安全性風(fēng)險。具有抗除草劑的抗性轉(zhuǎn)基因作物的抗性基因可能通過物種間的基因流動轉(zhuǎn)移至雜草或是近緣野生型品種上，使得這些雜草和野生種具有抗除草劑的抗性，多次轉(zhuǎn)移后可能成為 “超級雜草”，進(jìn)而破壞生態(tài)系統(tǒng)tt_6]。此外，作為外來品種的轉(zhuǎn)基因作物，通常具有“選擇優(yōu)勢”，可能會影響植物基因庫的遺傳結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致野生等位基因的以及其它遺傳資源的丟失， 進(jìn)而影響生態(tài)系統(tǒng)中物種的種類和種群的數(shù)量，使得生物多樣性的喪失[6]。第三，轉(zhuǎn)基因作物有可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因食品安全性的問題。已有研究報道提示，轉(zhuǎn)基因作物在飼喂小鼠時可以造成潛在的危害[7’8]?？偠灾?，這上述的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灪妥魑锏臐撛诘娘L(fēng)險提示我們對于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灪娃D(zhuǎn)基因作物的有效的安全性的控制是必須的M。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灪娃D(zhuǎn)基因作物的造成風(fēng)險的主要的原因是轉(zhuǎn)基因在不同物種間和品種間的流動和轉(zhuǎn)移，即基因漂流。基因漂流(gene flow/dispersal)指的是基因通過花粉授粉雜交等途徑在種群之間擴散的過程。轉(zhuǎn)基因植物基因漂流的途徑有三種。其一是通過轉(zhuǎn)基因植物的種子或組織的擴散；其二是通過轉(zhuǎn)基因植物的花粉向同種或近緣種植物雜交擴散；其三則是通過非同種生物間，例如植物的病原菌等發(fā)生基因的漂流。在這三種途徑中， 通過花粉進(jìn)行的基因漂流的速度最快，影響范圍也最廣。因此，對于降低植物轉(zhuǎn)基因的漂流風(fēng)險一個有效的方法是改變其轉(zhuǎn)基因花粉的育性和親和性。Mariani等人于1990年利用絨氈層特異啟動子TA^啟動子驅(qū)動重組B-葡萄糖醛酸酶或核糖核酸酶基因(RNase Tl或 barnase)在轉(zhuǎn)基因煙草和油菜的絨氈層中表達(dá)從而選擇性的破壞絨氈層，以獲得雄性不育株_。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于小麥、水稻和番茄等經(jīng)濟作物[11_14]。隨后，也有利用RNAi技術(shù)抑制花粉發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)而構(gòu)建雄性不育株的研究報道[15]。由此可見，通過轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生雄性不育系而限制轉(zhuǎn)基因植物基因漂流有效的方法。但是，目前在構(gòu)建了雄性不育系的這些株系中，盡管產(chǎn)生的雄性不育系顯著的限制了轉(zhuǎn)基因的漂流，但同時也使得得到的轉(zhuǎn)基因株系沒有辦法自交，因此也無法得到相應(yīng)的純合體，不利于育種。因此，找到一種既可以抑制轉(zhuǎn)基因的漂流，但卻可以不影響自交的方法對于分子育種有一定的意義。自交不親和性是自然界中天然存在的一種種內(nèi)生殖隔離障礙，指的是顯花植物自己的雌蕊可以特異性的識別自己的花粉，從而可以抑制其完成傳粉受精的過程[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)，茄科、車前科、玄參科和薔薇科的植物大多具有自交不親和性，它們所采用的自交不親和性為核酸酶類型的配子體自交不親和性。在這些植物中，控制花柱和花粉的自交不親和性的因子分別為S-核酸酶(S-RNase)和SLF，花柱因子S-核酸酶起到的是細(xì)胞毒性的作用，而花粉因子SLF的主要作用是抑制異己的S-核酸酶的毒性作用從而保證花粉在異花授粉時可以不被抑制而完成傳粉受精的過程[16’17]。植物的自交不親和性只是涉及到花粉在傳粉過程中花粉的萌發(fā)以及花粉管的生長，而并不影響花粉本身的發(fā)育以及植株的其它的性質(zhì)，因此一方面利用轉(zhuǎn)基因的方法改變花粉的自交不親和性可以產(chǎn)生新類型的雄性不育系，以有效的抑制轉(zhuǎn)基因的漂流，降低轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灪娃D(zhuǎn)基因作物可能造成的風(fēng)險；另外一方面也可以同時改變花柱的自交不親和性使得產(chǎn)生的這類新型的雄性不育系可以完成自交產(chǎn)生純合體，因此有利于通過該方法建立茄科類經(jīng)濟作物優(yōu)秀品質(zhì)、性狀控制的基因庫， 從而利于育種工作的進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從核酸酶類型的配子體自交不親和性的研究和利用出發(fā)，從茄科的雜交矮牽牛(Petunia hybrida)中研究發(fā)現(xiàn)并克隆了一個參與控制核酸酶類型配子體自交不親和性的因子，命名為PhSSKl (PhSLF-interacting-Skpl-Likel)。研究表明，該基因通過與自交不親和性的花粉因子相作用，協(xié)助花粉因子完成在異花授粉后傳粉受精過程的正常進(jìn)行， 該基因是花粉特異表達(dá)的基因，不具有基因型特異性。通過RNAi顯著下調(diào)花粉中該基因的表達(dá)可以有效抑制帶有轉(zhuǎn)基因片段花粉在與具有正常自交不親和性的雜交矮牽牛授粉時的親和性；同時，卻并不抑制該類型花粉在授粉花柱自交不親和性功能喪失的突變體矮牽牛時的親和性。因此該方法是一類新的可以抑制轉(zhuǎn)基因漂流的控制技術(shù)，同時該方法還適用于茄科類的新型的構(gòu)建雄性不親和系的技術(shù)。針對上述內(nèi)容，本發(fā)明的目的是提供一個新的參與控制茄科類自交不親和性花粉特異的基因。本發(fā)明所提供基因，名稱為PhSSKl (PhSLF-interacting SKPl-Likel)，來源于雜交矮牽牛(Petunia hybrida)，是下列核苷酸序列之一
1) DNA 序列；2)編碼蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與限定的核苷酸序列能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核苷酸序列；4)與限定的氨基酸序列具有75%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供WiSSKl基因所編碼蛋白質(zhì)，來源于雜交矮牽牛，是下列蛋白質(zhì)序列之一1)由WiSSKl基因編碼的蛋白質(zhì)序列；2)與限定氨基酸序列具有75%以上的同源性，且具有相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列。3)具有限定氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將限定氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與限定氨基酸殘基序列相同活性的由限定蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。。本發(fā)明的第三個目的是提供一種WiSSKl-RNAi的轉(zhuǎn)基因載體，用于構(gòu)建一種通過抑制花粉的親和性的雄性不親和性的轉(zhuǎn)基因材料，該材料可以有效避免轉(zhuǎn)基因漂流，便于建立優(yōu)良品質(zhì)、屬性控制的種質(zhì)基因庫。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因植物均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中的細(xì)胞系可以是真核的也可以是原核的。具體表述如下1、一種參與顯花植物花粉自交不親和性異交親和性控制的相關(guān)蛋白質(zhì)或其功能類似物，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述功能類似物是SEQID NO 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列且具有與所述蛋白質(zhì)相同的功能的類似物，或者與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少75%的同源性的功能類似物。2、根據(jù)以上1所述的蛋白質(zhì)或其功能類似物，其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。3、一種編碼以上1或2所述的蛋白質(zhì)或其功能類似物的基因。4、根據(jù)以上3所述的基因，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。5、一種基因，其是以上3或4所述基因的核苷酸序列經(jīng)過取代，缺失或添加一個或多個核苷酸且與以上3或4所述基因具有相同功能的突變體、等位基因或衍生物。6、一種含有以上3、4或5所述的基因或其片段的載體。7、以上6所述的載體，其為植物表達(dá)載體。8、以上7所述的載體，其為WiSSKl-RNAi轉(zhuǎn)化載體。9、一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有以上3、4或5所述的基因序列或其片段。10、一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有以上6-8中任一項所述的載體。11、根據(jù)以上10的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。12、一種在顯花植物中造成花粉異交親和性喪失的方法，包括用以上8中所述的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。13、按照以上12所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化包括轉(zhuǎn)化RNAi干擾法。
14、按照以上12所述的方法，其中所述顯花植物是茄科植物，包括雜交矮牽牛。


下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖IPhSSKl基因的DNA序列。圖2WiSSKl基因編碼的氨基酸序列。圖3PhSSKl基因的基因型分析和表達(dá)譜分析。(A)不同基因雜交矮牽牛中W1SSKl 的DNA印跡雜交分析。待檢測DNA分別經(jīng)EcoR V和EcoR I單酶切消化，并分別使用WiSSKl 基因全長以及部分片段(l_789bp)為探針進(jìn)行雜交分析，右側(cè)的數(shù)字為條帶的分子量大小，單位為Kb。(B)雜交矮牽牛中各個組織中WiSSKl表達(dá)的RT-PCR分析，Tubulin為對照。 (C)各個基因型雜交矮牽牛中WiSSKl表達(dá)的組織特異性分析?？v坐標(biāo)為W1SSKl mRNA的相對量。(D)各個基因型雜交矮牽牛不同組織中WiSSKl蛋白的免疫印跡檢測?？贵w為W1SSKl 的抗體，麗春紅染色為上樣對照。圖4PhSSKl_RNAi轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建示意圖。其中NOS轉(zhuǎn)錄終止子為原始ρΒΙΙΟΙ載體上的轉(zhuǎn)錄終止子。PhSSKl基因組DNA中白色的區(qū)域為WiSSKl基因的兩個外顯子，灰色的區(qū)域內(nèi)含子。圖5PhSSKl_RNAi轉(zhuǎn)基因Ttl代植株的分子分析。㈧Ttl代植株的DNA印跡雜交分析。待檢測DNA經(jīng)EcoRV單酶切消化，使用WiSSKl基因全長為探針進(jìn)行雜交分析，黑色箭頭所指出的條帶為受體植株內(nèi)源的WiSSKl基因，右側(cè)的數(shù)字為條帶的分子量大小，單位為 Kb。(B) T0代植株花粉WiSSKl的qRT-PCR分析，縱坐標(biāo)為WiSSKlmRNA的相對含量(野生型受體花粉的WiSSKl的mRNA量為1)。PhSKPl_2是另外一個從矮牽?；ǚ壑锌寺〉玫降?SKPl同源基因，在此作為WiSSKl下調(diào)的實驗對照。(C)左側(cè)圖為Ttl代植株花粉中WiSSKl 蛋白的免疫印跡分析，Tubulin為上樣對照。右側(cè)的柱狀圖為蛋白免疫印跡結(jié)果經(jīng)定量軟件Quantity One分析定量的相對蛋白含量，計算時選用Tubulin為參照蛋白。圖6PhSSKl_RNAi轉(zhuǎn)基因T1代植株的分子分析。(A)檢測植株的DNA經(jīng)EcoRV單酶切消化，以WiSSKl基因全長為探針進(jìn)行DNA印跡雜交分析。黑色箭頭指示的是植株內(nèi)源的W1SSKl拷貝，各個圖右側(cè)的數(shù)字表示片段的分子量的大小，單位為Kb。(B)T1代植株花粉WiSSKl的qRT-PCR分析，縱坐標(biāo)為WiSSKl mRNA的相對含量。PhSKPl_2為實驗的對照。圖7PhSSKl_RNAi轉(zhuǎn)基因植株為父本與雜交后代的基因型分析。圖中包含有 4張小圖，每張小圖為單個轉(zhuǎn)基因植株的分析結(jié)果。T-DNA為I^hSSKl-RNAi轉(zhuǎn)基因片段，Sv 和分別代表檢測的不同單倍型S-核酸酶。檢測的前兩泳道為測交的母本和父本對照。。圖8親和種矮牽牛(St^)的花柱自交不親和性功能分析。(A)親和種矮牽牛&& 和不親和矮牽牛S1S1A3Ai和SvSv花柱中S-核酸酶的核酸酶活性膠分析。左側(cè)的數(shù)字表示蛋白質(zhì)的分子量大小，單位為KD，黑色箭頭所指示的為活性核酸酶的條帶。￠) 中S-核酸酶的免疫印跡分析。Str核酸酶為大腸桿菌(E.coli)表達(dá)蛋白，其余四道為個基因型植株的花柱總蛋白的檢測結(jié)果。左側(cè)的數(shù)字表示蛋白質(zhì)的分子量大小，單位為KD。黑色方框所指示的為檢測到的S-核酸酶(S-RNase)，星號所示的為花柱蛋白中檢測到的非特異的條帶。上樣對照為考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白膠。圖9PhSSKl_RNAi轉(zhuǎn)基因植株為父本與&&雜交后代的基因型分析。圖中包含有4張小圖，每張小圖為單個轉(zhuǎn)基因植株的分析結(jié)果。T-DNA為W1SSKl-RNAi轉(zhuǎn)基因片段，S。、 Sv和分別代表檢測的不同單倍型的S-核酸酶。檢測的前兩泳道為測交的母本和父本對照。。序列說明SEQ ID NO :1 是 PhSSKl 基因的 DNA 序列；禾口SEQ ID NO 2是PhSSKl基因編碼的氨基酸序列。
具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發(fā)明，但是所述實施例僅是為了舉例說明， 而并非對本發(fā)明的限定。實施例11、矮牽牛材料溫室中生長的基因型為S3lS3l> S3S3> SvSv, S3lSv和&&的雜交矮牽牛，這里S 代表的為植物自交不親和性位點(S位點)的基因型，下標(biāo)^，3，v和。分別代表不同的單倍型。其中SSp S3S3, s%sv購自美國北伊利諾伊大學(xué)生命科學(xué)系和植物分子生物學(xué)中心，
和SvSv基因型為我們通過對雜交矮牽牛進(jìn)行剝蕾強制授粉(即在花發(fā)育早期，在S-核酸酶尚未表達(dá)前，即在矮牽?；ɡ匍L度約為3厘米左右，將其剝開進(jìn)行強制收粉)得到的， 4 為購自北京中農(nóng)新泰科農(nóng)業(yè)技術(shù)公司。在上述矮牽牛材料中，S1S1, S3LS3L> S3S3> SvSv和 S3lSv為具有正常自交不親和性的雜交矮牽牛，&&為花柱自交不親和性功能喪失的自交親和的雜交矮牽牛。2、PhSSKl基因的克隆經(jīng)過對國際茄科基因組計劃網(wǎng)站(SGN，SOL Genomics Network, http:// solgenomics.net/)上發(fā)布了一萬余條矮牽牛的EST及其編碼蛋白的分析，發(fā)現(xiàn)其中一個被預(yù)測來源于雄蕊組織的單基因編碼的蛋白與一個從車前科金魚草中鑒定克隆得到的參與到核酸酶類型的自交不親和性的花粉因子AhSSKl相似，在系統(tǒng)進(jìn)化上也有緊密的聯(lián)系， 將其命名為WiSSKl。經(jīng)過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)(RACE)，我們得到了 WiSSKl的全長編碼序列。具體步驟如下，提取雜交矮牽?；ǚ鄣目俁NA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 然后采用5，的特異引物(引物序列為5，-ATAAAGCTTATGGCATCAGAAAAGAAAATG-3，)禾口 3， 的 CDSIII 引物(引物序歹Ij :5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’ )進(jìn)行 PCR 擴增，反應(yīng)條件為 94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，;35 個循環(huán)；72°C lOmin，切膠回收測序得到了 WiSSKl基因全長。WiSSKl基因全長有113^ρ，有兩個外顯子和一個內(nèi)含子，編碼179氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(圖1和圖2 ；SEQ ID NO 1和2)。3, PhSSKl的基因型分析和表達(dá)譜分析分別提取了 S1S1J3LS3L和4 基因型矮牽牛的基因組DNA，進(jìn)而用EcoRV和EcoRI 酶切消化，以WiSSKl基因組全長為探針進(jìn)行了 DNA印跡雜交分析，檢測結(jié)果顯示W(wǎng)iSSKl基因在各個基因型的雜交矮牽牛中不具有單倍型特異性。通過RT-PCR、qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交的方法檢測WiSSKl在矮牽牛各組織中的表達(dá)情況。PhSSKl RT-PCR的引物為正向引物5' -CAA TCG TAA GAC CATAGT AAA-3 ‘，反向引物 5' -GGA ATT ATT GGT CGA CCC TGT-3 ‘，反應(yīng)條件為 94°C 5min ；940C 30s, 580C 30s, 72°C 90s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin,電泳檢測。qRT-PCR 的引物為正向引物 5' -GAC ACT AAA ATC AAA CGA TGA CCA A_3'，反向引物為 5' -TCA TGT TCT TGA GCA TTT CAG ATT G-3'，反應(yīng)條件為 95°C，IOmin ;95°C，15s，60°C，lmin，40 個循環(huán)。蛋白質(zhì)免疫印跡雜交使用的抗體為兔源的WiSSKl的抗體(購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物中心)。mRNA和蛋白質(zhì)檢測的結(jié)果顯示該基因為一個花粉特異表達(dá)的基因(圖 3)。實施例21、PhSSKl-RNAi轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建為了研究W1SSKl的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了用于通過RNAi干擾的方法降低矮牽牛花粉中WiSSKl表達(dá)的雙源轉(zhuǎn)化載體。構(gòu)建的過程如下采用的原始載體為Clontech公司的PBIlOl雙源轉(zhuǎn)化載體，該載體的大小為12. 2Kb ；通過HindIII和)(baI連入了花粉特異的表達(dá)基因Lat52的啟動子[18]；由于WiSSKl本身具有一個500bp (沈5_76幻的內(nèi)含子， 因此，在構(gòu)建RNAi載體時保留WiSSKl基因序列1-789，以其⑶S序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST比對，選取WiSSKl編碼序列下游從1489，長為289bp的特異區(qū)段的反向互補序列構(gòu)建形成siRNA的區(qū)段，整個PhSSK-RNAi轉(zhuǎn)錄區(qū)通過XbaI和kal雙酶切接入ρΒΙΙΟΙ載體； 轉(zhuǎn)錄終止使用載體PBIlOl上的原始的NOS轉(zhuǎn)錄終止子(圖4)。在整個構(gòu)建的過程中使用的工程菌株為E. coli DH5 α (購自hvitrogen生物公司)。2、轉(zhuǎn)基因Ttl代植株的獲得和鑒定通過葉盤轉(zhuǎn)化的方法用構(gòu)建好的W1SSKl-RNAi載體轉(zhuǎn)化具有嚴(yán)格自交不親和性的矮牽牛，受體的基因型為S3Jp具體轉(zhuǎn)化步驟如下用W1SSKl-RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后進(jìn)而將帶有轉(zhuǎn)基因載體的農(nóng)桿菌菌液與消毒后切成小塊的雜交矮牽牛葉片共培養(yǎng)，進(jìn)而誘導(dǎo)，篩選愈傷，培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)而，分別提取了野生型受體植株和轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA，用EcoRV進(jìn)行完全的酶切消化，以W1SSKl基因的全長序列作為探針進(jìn)行雜交分析。鑒定得到了 7個獨立的轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為B、El、J2、K4、H6、J4和M8。進(jìn)而，我們檢測了這7株轉(zhuǎn)基因株系的花粉中W1SSKl的表達(dá)情況。通過 qRT-PCR(所需引物和反應(yīng)條件與實施例1中的qRT-PCR引物和反應(yīng)條件相同)和蛋白質(zhì)免疫印跡分析(WiSSKl抗體(購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物中心))的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因PhSSKl-RNAi顯著下調(diào)了 Ttl代植株花粉中PhSSKl的表達(dá)。此外，通過qRT-PCR 還檢測了花粉中另外一個Skpl-Iike的基因，PhSKPl-2的表達(dá)。使用的引物序列為正向引物 5' TGG ATC TCA CAT GCC AGA CTG T 3'，反向引物 5' TTC TTAATG TTG AAC GTC TTC CTT ATC T 3'，反應(yīng)條件按照96°C 10分鐘；96°C 15秒，60°C 1分鐘，40個循環(huán)，進(jìn)行。檢測結(jié)果顯示該基因表達(dá)并不受到轉(zhuǎn)基因的影響，因此表明轉(zhuǎn)基因WiSSKl-RNAi載體是特異性的下調(diào)WiSSKl的表達(dá)，沒有“誤擊”現(xiàn)象的存在(圖5)。我們對得到的轉(zhuǎn)基因Ttl代植株的表型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示W(wǎng)iSSKl-RNAi轉(zhuǎn)基因并沒有引起轉(zhuǎn)基因植株整個植株生長發(fā)育發(fā)生顯著的改變，花柱授粉行為和結(jié)實情況也沒有受到影響。但是，對于花粉授粉行為的檢測中發(fā)現(xiàn)，盡管花粉在自交授粉時仍然表現(xiàn)為嚴(yán)格的自交不親和性，但是在通常是異交親和授粉的情況下，轉(zhuǎn)基因的花粉卻表現(xiàn)出不親和和結(jié)實情況顯著下降的授粉行為的異常，提示轉(zhuǎn)基因下調(diào)花粉中WiSSKl表達(dá)后影響了花粉的育性或者是自交不親和性，或者二者兼有之。
3、轉(zhuǎn)基因T1代植株的獲得和鑒定為了檢測W1SSKl-RNAi轉(zhuǎn)基因后對于花粉親和性和育性的影響，我們選擇轉(zhuǎn)基因植株J2和K4作為研究對象。選用基因型為SvSv的自交不親和野生型植株作為父本與上述兩株轉(zhuǎn)基因植株雜交得到T1代植株。所得到的1\代植株的基因型均為i^Sv。隨后我們對得到的T1帶植株進(jìn)行了 DNA印跡雜交分析，檢測了 5株K4的后代和12株J2的后代。由于這些T1代的父本均為SvSv，因此它們分別命名為VJ和VK。DNA印跡雜交分析中以WiSSKl 基因全長為探針進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示12株VJ中有9株(VJ2、VJ4、VJ5、VJ6、VJ7、VJ8、 VJ10、VJ11和VJ12)帶有轉(zhuǎn)基因拷貝，5株VK中的3株(VK1、VK2和VK3)帶有轉(zhuǎn)基因片段， 這些帶有轉(zhuǎn)基因拷貝的T1代植株所帶的轉(zhuǎn)基因拷貝的帶型與其母本一致，表明K4和J2中的轉(zhuǎn)基因片段的插入是以4個轉(zhuǎn)基因片段形成的一個連鎖群插入的。隨后我們對于得到的轉(zhuǎn)基因T1代植株花粉中W1SSKl的表達(dá)進(jìn)行了分析。以 qRT-PCR的方法(檢測的方法和引物與實施例1中的qRT-PCR相同)檢測了這些植株花粉中W1SSKl的mRNA含量。結(jié)果提示，在檢測的轉(zhuǎn)基因T1代的花粉中該基因的表達(dá)同樣受到了顯著的下調(diào)(圖6)。4、顯著降低花粉中W1SSKl的表達(dá)可以導(dǎo)致花粉異交親和性或育性的喪失隨后我們對于得到的轉(zhuǎn)基因T1代植株花粉的授粉行為進(jìn)行了檢測分析。在自花授粉和異花授粉的時候轉(zhuǎn)基因T1植株的花粉的授粉行為和結(jié)實情況沒有受到顯著的影響。 但是由于我們檢測的轉(zhuǎn)基因T1代植株為雜合體，因此為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因花粉的授粉行為，我們對以轉(zhuǎn)基因植株為父本與親和授粉后的子代進(jìn)行了基因型分析。分析方法為特異性引物進(jìn)行PCR，共分析了 3個基因，其中T-DNA為轉(zhuǎn)基因WiSSKl-RNAi的拷貝， PhS3L-RNase和WiSv-RNase分別為和Sv單倍型的S-核酸酶，用于植株的S基因型鑒定。 引物序列如下所示T-DNA(PhSSKl-RNAi)正向引物 5' -AGA CAC ACA CAA AGA GAA GGA G-3'，反向引物 5' -CAA CCC AAC CCG TTC ATT TAC-3 ‘ ；Ph&L-RNase (引物正向引物 5' -TGT GAC GAT CAC TGA AAT AAA T-3'，反向引物 5' CGA AGA AAG GAA TAT GTTCAT CC-3'； PhSv-RNase 引物正向引物 5' -GAT TAC GGA CGA AGC TGA TTG-3‘，反向引物 5' -GAA ACT TAA TTA TGG GTC CAT AAT CC_3'。所有的PCR 反應(yīng)條件是94°C 5min ；94 °C 30s，58°C 30s, 72 °C 60s, 35 個循環(huán)； 72°C IOmin0然后PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。我們共檢測分析了 4個轉(zhuǎn)基因T1代的后代，每個后代群體的個體數(shù)為M個(滿足統(tǒng)計學(xué)的要求)，進(jìn)而對于檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。分析結(jié)果顯示，在后代群體中很少有帶有轉(zhuǎn)基因拷貝的個體，因此表明轉(zhuǎn)基因植株中帶有T-DNA的花粉在異交親和授粉時不能正常完成傳粉受精的過程，因此T-DNA不能傳遞到下一代的個體中。該結(jié)果提示自交不親和性矮牽?；ǚ壑蠾iSSKl表達(dá)降低后會導(dǎo)致花粉親和性或育性的下降，可以表現(xiàn)出類似雄性不育的特征(圖7和表1，圖7中僅顯示了 M株后代個體中的20株，但表1中的統(tǒng)計學(xué)分析是基于全部M株后代個體進(jìn)行的)。表1 PhSSKl-RNAi轉(zhuǎn)基因植株T1代為父本與雜交后代的基因型分離統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種參與顯花植物花粉自交不親和性異交親和性控制的相關(guān)蛋白質(zhì)或其功能類似物，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述功能類似物是SEQID NO 2 所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列且具有與所述蛋白質(zhì)相同的功能的類似物，或者與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少75% 的同源性的功能類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其功能類似物，其具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)或其功能類似物的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其具有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
5.一種基因，其是權(quán)利要求3或4所述基因的核苷酸序列經(jīng)過取代，缺失或添加一個或多個核苷酸且與權(quán)利要求3或4所述基因具有相同功能的突變體、等位基因或衍生物。
6.一種含有權(quán)利要求3、4或5所述的基因或其片段的載體。
7.權(quán)利要求6所述的載體，其為植物表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求7所述的載體，其為WiSSKl-RNAi轉(zhuǎn)化載體。
9.一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有權(quán)利要求3、4或5所述的基因序列或其片段。
10.一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有權(quán)利要求6-8中任一項所述的載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
12.—種在顯花植物中造成花粉異交親和性喪失的方法，包括用權(quán)利要求8中所述的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
13.按照權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化包括轉(zhuǎn)化RNAi干擾法。
14.按照權(quán)利要求12所述的方法，其中所述顯花植物是茄科植物，包括雜交矮牽牛。
全文摘要
本發(fā)明公開了參與顯花植物，如茄科類植物花粉自交不親和性異交親和性控制的相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因，以及通過轉(zhuǎn)基因下調(diào)該基因的表達(dá)在防止轉(zhuǎn)基因漂流和建立品種的種質(zhì)基因庫方面的應(yīng)用。本發(fā)明提供PhSSK1-RNAi載體和含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的基因在揭示顯花植物，如茄科類自交不親和性的分子機理具有重要理論意義，通過轉(zhuǎn)基因RNAi下調(diào)花粉中該基因的表達(dá)可以導(dǎo)致花粉在異花授粉時親和性的喪失，對于防止茄科類轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的擴散和構(gòu)建茄科經(jīng)濟作物如馬鈴薯和番茄等材料的優(yōu)秀性狀控制基因庫有重要的作用和意義。
文檔編號C12N15/82GK102234324SQ201010162148
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者李群, 薛勇彪, 趙仲華, 趙嵐, 黃劍 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所