一種重組卡介苗及其構(gòu)建與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組卡介苗及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核?。═uberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis) 引起的古老疾病，它與艾滋病、追疾并稱為當(dāng)今世界威脅人類健康的H大傳染病。研究 表明結(jié)核分枝桿菌基因組共編碼11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/t虹eonine p;roteinkinase，STPK)和兩種真核樣酪氨酸磯酸酶（PtpA和Pt地），它們在結(jié)核分枝桿菌感 染宿主巨瞻細(xì)胞的過程中可被分泌至宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中，送些蛋白分別與宿主細(xì)胞中不同 的蛋白分子相互作用，并且通過調(diào)控宿主細(xì)胞中各個祀蛋白的磯酸化水平來達(dá)到干擾真核 生物信號通路的目的。送些病原菌-宿主互作蛋白及其相關(guān)的炎癥和免疫信號通路將可能 為抗結(jié)核新藥設(shè)計提供全新的理想祀點。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)分泌的PtpA蛋白屬于低分子量酪氨酸磯酸醋酶家 族，也叫做Low MW PTPs。研究表明；PtpA蛋白與真核細(xì)胞中的酪氨酸磯酸醋酶有很強的相 似性，它在病原宿主互作過程中起著重要的作用，參與調(diào)控多種重要的生理病理過程。促分 裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinases, MAP激酶，MAPK)級聯(lián)反應(yīng)通 路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮 關(guān)鍵作用。JNK和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的兩個重要分支，它們在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分 化、細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用，而JNK和p38蛋白激酶分別 是兩個信號通路的中的關(guān)鍵調(diào)控因子。當(dāng)外界有細(xì)胞因子（TNF，IL-I目）、生長因子巧GF)、 特定抗原，W及紫外線和放射線等存在時，JNK和P38蛋白就會接受上游信號分別被磯酸化 活化成P-JNK和P-P38,并且進(jìn)一步磯酸化激活下游蛋白，進(jìn)而激活信號通路，調(diào)控多種細(xì) 胞因子（如TNF、IL-I目等）的轉(zhuǎn)錄水平。
[0004] 卡介苗（B賄問世已80余年，全球大多數(shù)國家將其列入計劃免疫接種項目。實踐 表明，卡介苗是一種安全的疫苗，它的副作用輕微。目前已有30億W上的人接種了 BCG，并 且每年有1億左右的新生兒接種此疫苗。它可較好的阻止年幼兒結(jié)核及結(jié)核性腦膜炎的發(fā) 生。然而，它不能保護(hù)最常見的成人肺結(jié)核的發(fā)生。盡管發(fā)表文獻(xiàn)綜合有效值為50%，但據(jù) 估計其對結(jié)核病死亡的預(yù)防效果僅占5%，因此，有必要開發(fā)更有效的疫苗取代現(xiàn)行BCG疫 苗。
[0005] 本發(fā)明構(gòu)建了敲除了 PtpA 的 BCG (卡介苗，BaciIlusCalmette-Gu紅in,簡稱 BCG)， 解除了 PtpA對JNK和p38信號通路的抑制進(jìn)而促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，細(xì)胞因子水平升 高可W更有效的調(diào)節(jié)機體參與免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)，刺激免疫細(xì)胞活化、增殖和分化等，使 機體產(chǎn)生自然的抗體等生物物質(zhì)，用W提升生物體的對病原的辨認(rèn)和防御功能；因此該重 組BCG可W作為更高效的BCG重組疫苗開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組卡介苗度CG)，是敲除了野生BCG中編 碼PtpA蛋白的基因。
[0007] 所述PtpA蛋白是能抑制JNK和p38信號通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA,其氨 基酸序列如SEQ ID NO ;1所示。
[000引所述重組BCG解除了 PtpA對于JNK和p38信號通路的抑制，并能促進(jìn)巨瞻細(xì)胞分 泌細(xì)胞因子，可用作制備BCG疫苗。
[0009] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種所述重組BCG的構(gòu)建方法，是將BCG 中編碼PtpA蛋白的基因進(jìn)行敲除。
[0010] 在所述方法的一種實施方式中，通過同源重組敲除BCG中編碼PtpA蛋白的基因。
[0011] 所述方法的一種實施方式包含W下步驟：
[001引 （1)將PJV53質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到BCG感受態(tài)中，在含有卡郝霉素的7H10平板上篩選陽性 克??；所述PJV53質(zhì)粒可W在BCG中轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)外源片段同源重組的酶；
[0013] (2)挑取陽性克隆，接種于含有卡郝霉素抗性的7H9培養(yǎng)基中37攝氏度培養(yǎng)20 天，離必收獲攜帶PJV53基因的BCG并制備感受態(tài)待用；
[0014] (3)合成序列如SEQ ID NO. 4所示的帶有篩選標(biāo)記的PtpA上下游基因融合片段 AD ；
[001引 （4)將上述基因片段AD電轉(zhuǎn)到步驟似準(zhǔn)備的BCG感受態(tài)中；在含有潮霉素抗性 的7H10平板上篩選陽性克??；
[0016] 巧)Southern Blot法鑒定陽性克隆，獲得敲除了 PtpA的重組BCG。
[0017] 本發(fā)明通過雙英光素酶體系及Western Blot證明PtpA可W高效地抑制JNK和 p38信號通路的激活，進(jìn)一步通過化ISA和QRT-PCR實驗證明重組BCG可W在較低C即條 件下有效促進(jìn)巨瞻細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌。此外動物實驗也證明與野生型BCG感染結(jié)果相 比，重組BCG感染的小鼠血液中IL-I化水平升高，小鼠脾臟中IL-I目，TNF等細(xì)胞因子的 水平也明顯上升。細(xì)胞因子水平升高可W更有效的調(diào)節(jié)機體參與免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)，刺 激免疫細(xì)胞活化、增殖和分化等，使機體產(chǎn)生自然的抗體等生物物質(zhì)，用W提升生物體的對 病原的辨認(rèn)和防御功能；W上結(jié)果提示：BCG重組菌株將具有接種量更低、更高效等諸多優(yōu) 點，可W作為一種新的更為高效的BCG重組疫苗而被開發(fā)使用。
【附圖說明】
[001引 圖1 =PtpA抑制JNK和p38信號通路
[0019] A、雙英光素酶報告體系證明PtpA抑制JNK和p38信號通路
[0020] B、Western Blot實驗證明PtpA抑制JNK和p38信號通路
[0021] 圖2 ;重組BCG可W促進(jìn)巨瞻細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌
[0022] A、QRT-PCR結(jié)果證明重組BCG可使巨瞻細(xì)胞tnf mRNA水平升高
[002引 B、QRT-PCR結(jié)果證明重組BCG可使巨瞻細(xì)胞il化mRNA水平升高
[0024] C、ELISA結(jié)果證明重組BCG可W促進(jìn)巨瞻細(xì)胞細(xì)胞因子TNF分泌 [00巧]D、ELISA結(jié)果證明重組BCG可W促進(jìn)巨瞻細(xì)胞細(xì)胞因子IL-I目分泌 [002引 圖3 ;重組BCG可W促進(jìn)小鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子分泌
[0027] A、QRT-PCR結(jié)果證明重組BCG感染的小鼠脾臟內(nèi)tnf mRNA水平升高
[002引 B、QRT-PCR結(jié)果證明重組BCG感染的小鼠脾臟內(nèi)il化mRNA水平升高
[0029] C、QRT-PCR結(jié)果證明重組BCG感染的小鼠脾臟內(nèi)ill2b mRNA水平升高
[0030] D、ELISA結(jié)果證明重組BCG感染的小鼠血液中細(xì)胞因子IL-I化水平升高
[0031] 圖4;敲除片段的獲得
【具體實施方式】
[0032] 實施例1P化A抑制JNK和p38信號通路
[0033] 可W抑制JNK和p38信號通路的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0034] (A)雙英光素酶報告體系及Western Blot實驗：
[0035] (1)檢測前首先將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)到24孔板中，培養(yǎng)過夜；
[0036] (2)每孔同時轉(zhuǎn)染pFA2-(Jun、Gal4-Luc英光素酶報告基因質(zhì)粒、P化-TK(翊圣生 物）和RacL61質(zhì)粒（將RacL61基因插入到p3xFlagCMV載體中），同時轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染含編 碼PtpA的基因的質(zhì)粒p3xFlag CMV