專(zhuān)利名稱(chēng)：一種A.xylosoxidans LHB21菌株中編碼鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程、酶工程、微生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種木糖氧 化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans LHB21,簡(jiǎn)寫(xiě)為 A. xylosoxidans LHB21)菌株 (該菌株購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，編號(hào)為CGMCC 1.2679)中編碼鄰苯二酚2， 3-雙加氧酶(catechol 2，3-dioxygenase，C230)的基因(C230)。
背景技術(shù)：
鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(catechol 2，3-dioxygenase，C230)催化鄰苯二酚 的鄰位裂解，存在多種芳香烴降解微生物中，是芳香族化合物降解的關(guān)鍵酶。自1961年 Kojima首次報(bào)道了來(lái)源于惡臭假單飽菌(Pseudomonas putida mt_2)的鄰苯二酚2， 3-雙加氧酶以來(lái)目前已報(bào)道含有鄰苯二酚2，3-雙加氧酶及雙加氧酶區(qū)基因的微生物有 Pseudomonas, Comamonas, A. eutrophus335, A. xylosoxidansKF 701, RhodococcusV 49, Balillus stearothermophilus，這些微生物產(chǎn)生的C230在理化性質(zhì)、催化活性、酶作用底 物等方面都有不同程度的差別，對(duì)各種細(xì)菌C230基因的研究有助于滿足不同環(huán)境條件對(duì) C230提出的要求，使多方向、多途徑、高效率消除芳烴類(lèi)致癌物質(zhì)成為可能，因此尋找不同 細(xì)菌來(lái)源的C230基因及表達(dá)產(chǎn)物就顯得至關(guān)重要。許多能利用芳香族化合物生長(zhǎng)的微生物都具有鄰苯二酚2，3-雙加氧酶，因此對(duì) 該酶基因的監(jiān)測(cè)可一定程度反映微生物的種類(lèi)與數(shù)量。Junca (2003), Mesarch (2000, 2004) 等根據(jù)鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)或定量環(huán)境中鄰苯二酚2，3-雙加氧酶 基因，分析土壤中微生物的多樣性。鄰苯二酚2，3-雙加氧酶催化鄰苯二酚的苯環(huán)裂解的 產(chǎn)物為黃綠色的2-羥粘糠酸半醛，在375nm處有最大吸收。該酶促顯色反應(yīng)檢測(cè)簡(jiǎn)便快 速，鄰苯二酚2，3_雙加氧酶是較為理想的選擇性標(biāo)記，在基因工程等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng) 用。許華夏O005)等對(duì)菲降解實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)菌的雙加氧酶活力與其菲的降解率存在 較好的相關(guān)性，對(duì)細(xì)菌降解菲具有指示作用，可將雙加氧酶活力作為菲降解率變化的評(píng)價(jià) 指標(biāo)。P. putida質(zhì)粒pQM899編碼的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶被用于洗必泰等消毒劑的殺 菌性能評(píng)估(Edghil等，1999)。Shindo (1995)等和Unniraman ^)03)等在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域利用 P. aeruginosa的鄰苯二酚2，3_雙加氧酶作為標(biāo)記基因，用于監(jiān)測(cè)Sv40和魯斯氏肉瘤病毒 的表達(dá)，并作為Mycobacetriumsmegmatis基因轉(zhuǎn)錄的報(bào)告基因。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)理論的不斷發(fā)展，基因工程技術(shù)的不斷成熟，C230基因工 程技術(shù)的研究已經(jīng)開(kāi)始。Kobayashi T (1995)等在大腸桿菌W3110中進(jìn)行了 xylE基因的過(guò) 度表達(dá)，表達(dá)量接近總可溶蛋白的15%。蔡在龍(1996)等通過(guò)PClUfpTG 402上的xylE 基因進(jìn)行擴(kuò)增，克隆于PUC 118 N和pUC 119 N上，在證明未發(fā)生突變后將其進(jìn)一步克隆于 高表達(dá)載體PJLA 503，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)42°C誘導(dǎo)，獲得了高表達(dá)的基因產(chǎn)物，表達(dá)量 占全菌總蛋白的34.2%。張煒(1998)等研究了含有pheB基因的高表達(dá)載體pJLA 503，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌TGl后得到高表達(dá)phe B基因的工程菌，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的34.6%。但這些研究中C230基因都來(lái)源于中溫微生物，最適溫度是在中溫條件下，缺少耐冷機(jī)制，不適 合在寒冷地區(qū)作用。因此需要耐冷高效的C230表達(dá)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供一種分離的C230基因，其來(lái)源于一種木糖氧化無(wú)色桿菌 (Achromobacterxylosoxidans LHB21,簡(jiǎn)寫(xiě)為 A. xylosoxidans LHB21)菌株。該 C230 基 因如SEQ ID NO :1所示，全長(zhǎng)為924bp，是以ATG起始密碼子開(kāi)始，TGA終止密碼子結(jié)束。 該C230基因編碼307個(gè)氨基酸殘基，如SEQ ID NO :2所示，所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子量為 35. 16kDa，所表達(dá)蛋白質(zhì)的酶活為32U/mg。本發(fā)明提供以下技術(shù)方案提供一種分離自木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans LHB21，簡(jiǎn)寫(xiě) 為A. xylosoxidans LHB21)的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因，其具有如SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列。提供一種由權(quán)利要求1所述的基因編碼的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶，其具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。提供一種重組克隆載體，其包含權(quán)利要求1所述的基因。提供一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1所述的基因。提供一種由權(quán)利要求3所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。提供一種由權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。


圖1 表示菌株A. xylosoxidansLHB21基因組DNA電泳圖，其中M表示DNA標(biāo)準(zhǔn) λ -HindIII digest，1，2，3 表示菌株 A. xylosoxidans LHB21 基因組 DNA。圖2 表PCR產(chǎn)物電泳圖，M表示DL2, OOODNA Marker, A表示PCR產(chǎn)物。圖 3 表示克隆載體 pMD19-T Simple Vector 圖譜。圖4 表示表達(dá)載體pET_32a(+)的酶切圖譜。圖5 表示構(gòu)建的融合基因表達(dá)載體pDSFLOl的酶切圖譜。圖 6 表示 SDS-PAGE 電泳圖，其中 M 表示 Protein MW marker (Broad) (kDa)，A 表 示誘導(dǎo)細(xì)胞，B表示pET-32a(+)上清，C表示pET_32a (+)沉淀，D表示pDSFLOl全細(xì)胞，E 表示pDSFLOl上清，F(xiàn)表示pDSFLOl沉淀。
圖7 表示SDS-PAGE電泳圖；其中A表示目的蛋白質(zhì)分子量為35. 16KDa，B表示融合蛋 白分子量為51. 59KDa。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 菌株A. xylosoxidans LHB21基因組DNA提取^ffi TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2. O(Code No. DV810A)提取菌株A. xylosoxidans LHB21基因組DNA，具體操作如下1.菌體培養(yǎng)挑單菌落接種至1 細(xì)1的LB(組分濃度(W/V):蛋白胨1%，酵母 膏0. 5%,NaCll% )液體培養(yǎng)基中30°C過(guò)夜培養(yǎng)。2.取1 細(xì)1的過(guò)液培養(yǎng)菌液，10, OOOrpm離心2分鐘，棄上清。
3.用150ul的SP Buffer (含foiase Al)充分懸浮細(xì)菌沉淀。4.加入20ul的Lysozyme溶液，均勻混合后室溫靜置5分鐘。5.加入30ul的EDTA Buffer,均勻混合后室溫靜置5分鐘。6.加入200ul的Solution Α,劇烈振蕩后65°C保溫10分鐘。7.加入 400ul 的 Solution B,劇烈振蕩 15 秒。8.加入650ul的Solution C，上下顛倒均勻混合。9. 12，OOOrpm 離心 1 分鐘。10.棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液(無(wú)色下層)移入預(yù)先置于1. 5ml離心管上 的 FilterCup 中，12，OOOrpm 離心 1 分鐘。11.棄去Filter Cup，在濾液中加入450ul的DB Buffer，均勻混合。12.將試劑盒中的Spin Column插到負(fù)壓裝置的插口上，將上述操作步驟11的混 合液轉(zhuǎn)移到Spin Column中，開(kāi)啟調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置，緩慢吸走Spin Column中溶液。13.將負(fù)壓調(diào)至最大，向 Spin Column 中加入 500ul 的 Rinase AJlJ^Spin Column 中溶液。14.向 Spin Column 中加入 700ul 的 Rinase B，吸盡 Spin Column 中溶液。15.重復(fù)操作14，然后從負(fù)壓裝置上取下Spin Column，將其安置于試劑盒中的 Collection Tube 上。16. 12，OOOrpm 離心 1 分鐘。17.將Spin Column安置于新的1. 5ml的離心管上，在Spin Column中央處加入 60ul的滅菌蒸餾水，室溫靜置1分鐘。18. 12，OOOrpm 離心 1 分鐘洗脫 DNA。對(duì)A. xylosoxidans LHB21菌株基因組DNA的純度及完整性檢測(cè)如下用 紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA溶液沈0歷、280nm的OD值，并用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè) A. xylosoxidans LHB21 菌株 DNA 的完整性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OD260/OD280 = 2 . 0 > 1. 8， 說(shuō)明提取到高純度的A. xylosoxidansLHB21菌株基因組DNA ；電泳結(jié)果表明提取到的 A.xylosoxidansLHB21菌株基因組DNA是完整的(圖1)。在圖1中，M表示λ-Hind III marker, A 表示 A. xylosoxidans LHB21 菌株基因組 DNA。實(shí)施例2 :C230基因PCR克隆1. PCR法克隆C230基因1. 1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)A. xylosoxidans kf701 菌株的 C230 基因(如 SEQ ID N0:3 所示)，設(shè)計(jì)并 合成用于C230基因擴(kuò)增的寡核苷酸引物，在上游引物FO的5'端設(shè)計(jì)了 Nco I酶切位點(diǎn)， 下游引物RO的5'端設(shè)計(jì)了 Hind III酶切位點(diǎn)。PCR引物
F5'-ATGAACAAAGGTGTAATGCGAC-3' (SEQ ID NO 4)
R5'-TCAGGTCAGCACGGTCATGAA-3‘(SEQ ID NO 5)
YF25'-TGTTCACCAAGGTGCTCGG-3‘(SEQ ID NO 6)
YR25'-GGTCGAAGAAGTAGATGGTC-3‘(SEQ ID NO 7)
YF35'-GCCTCCATCATGTGTCCTTC-3‘(SEQ ID NO 8)
YR3 5' -TGTGTCGGTCATGGAGATCA-3‘ (SEQ ID NO 9)R02 5' -TCAGGTCAGCACGGTCATGAATCGTTCGTTGAGAAT-3' (SEQ ID NO 10)FO 5' -CCATGGCTATGAACAAAGGTGTAATGCGAC-3‘ (SEQ ID NO 11)RO 5' -AAGCTTTCAGGTCAGCACGGTCATGAA-3‘ (SEQ ID NO 12)用I^rimeSTAR HS DNA Polymerase (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編 號(hào)為DR010A)，以 A. xylosoxidans LHB21 菌株基因組 DNA 為模板，F(xiàn)/R，YF2/YR2, F/YR3, YF3/R02為引物，PCR擴(kuò)增。一次 PCR 反應(yīng)體系dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5 μ 1,5 X PrimeSTAR PCR 緩沖液 5μ 1，基因組 DNA 1 μ 1，弓丨物 F(20 μ Μ) 1 μ 1，引物 Ι (20μΜ)1μ 1，加蒸餾水至 50 μ 1。反應(yīng)條件起始解鏈溫度為98°C，時(shí)間為;3min ；在隨后的每個(gè)循環(huán)節(jié)中，解鏈在 940C 10s，退火在55°C 30s，延伸在72°C lmin，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存 在 4°C。二次 PCR 反應(yīng)體系dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5 μ 1,5 X PrimeSTAR PCR 緩沖液 5μ1，一 次 PCR 精制產(chǎn)物 Ιμ ，弓丨物 YF2(20yM)ly 1,弓丨物 YR2 (20 μ M) 1 μ 1 (或弓丨物 F(20 μ Μ) 1 μ 1，YR3 (20 μ Μ) 1 μ 1 或 YF3 (20 μ Μ) 1 μ 1, R02(20yM)ly 1)加蒸餾水至 50 μ 1。反應(yīng)條件解鏈在98°C 10s，退火在55°C 15s，延伸在72°C 30s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存在4°C。三次PCR 反應(yīng)體系dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5 μ 1,5 X PrimeSTAR PCR 緩沖液 5μ 1，二次 PCR 精制產(chǎn)物 1 μ 1，引物 F(K20 μ Μ) 1 μ 1， 弓丨物 RO (20 μ Μ) 1 μ 1。反應(yīng)條件解鏈在98°C 10s，退火在55°C 15s，延伸在72°C lmin，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系保存在4°C。2. PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物電泳(圖2)，分離l，000bp左右的條帶。圖2中，M表示DNA標(biāo) 準(zhǔn) DL2, 000DNA，A 表示 PCR 產(chǎn)物。使用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (產(chǎn)品編號(hào)DV805)純化電泳PCR產(chǎn)物，使用TaKaRa DNAA-Tailing Kit (產(chǎn)品編 號(hào)D404)對(duì)純化產(chǎn)物加 A 尾，使用 TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer. 2. 0 (產(chǎn)品編 號(hào):D404)精制。3. C230基因克隆至pMD19-T Simple載體并測(cè)序?qū)⒓兓蟮腄NA片段與pMD19-T Simple載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公 司，產(chǎn)品編號(hào)為D104，該產(chǎn)品結(jié)構(gòu)如圖3)用DNA連接試劑盒(購(gòu)自寶生物工程(大連)有 限公司，產(chǎn)品編號(hào)為D6023TS或D6023)連接。反應(yīng)體系為pMD19-TSimple 載體 Q5fmol)和 DNA (25 250fmol) 5 10μ 1，連 接緩沖液5 10 μ 1。反應(yīng)條件為16°C，30min。3. 3 轉(zhuǎn)化將連接液全部熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為:D3050)中。3. 4 檢驗(yàn)取100 μ 1轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109加入900 μ 1 SOC培養(yǎng)基37°C 160 225rpm振蕩 培養(yǎng)1小時(shí)。取100 μ 1培養(yǎng)液涂含有100 μ g/ml Ampicillin L-瓊脂平板。37°C培養(yǎng)過(guò) 夜。3. 4 植菌挑選陽(yáng)性菌落植入5ml LB培養(yǎng)基中，37°C 160 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3. 5質(zhì)粒提取用TAKARA MINIBEST Plasmid purification kit ver. 2· 0 (購(gòu)自寶生物工程(大 連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為DV801A)提取質(zhì)粒。3. 6 測(cè)序以pMD19-T Simple 載體的測(cè)序引物 RV-M(如 SEQ ID NO 13 所示)禾口 M13_47 (如 SEQ IDNO 14所示)進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例3 :C230基因表達(dá)以pET_32a(+)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體pDSFLOl (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)。測(cè) 序結(jié)果表明，pDSFLOl表達(dá)載體上的C230基因?yàn)槿L(zhǎng)C230基因。挑取陽(yáng)性表達(dá)子單菌落接種于含1001g/ml氨芐青霉素2ml液體培養(yǎng)基中37°C， 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，在6ml LB培養(yǎng)基中，接入100 μ 1含有pDSFLOl的大腸桿菌JM109的培養(yǎng) 物培養(yǎng)至OD6J). 55 0. 7，加入IPTG使終濃度達(dá)到1. OmM, 30°C誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。收集菌 體電泳分析。SDS-PAGE 電泳結(jié)果(見(jiàn)圖 6)，圖 6 中 M =Protein MW marker (Broad) (kDa)， A :pET-32a(+)全細(xì)胞，B :pET-32a(+)上清，C :pET-32a(+)沉淀，D :pDSFL01 全細(xì)胞，E pDSFLOl 上清，F(xiàn) pDSFLOl 沉淀。實(shí)施例4 :C230基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的分離與純化以Ni2+親和層析柱純化C230蛋白，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切，經(jīng)!feparin 親和層析分離得到了 C230基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳表明融合蛋白分子量為 51.59KDa(見(jiàn)圖7，B帶)，目的蛋白質(zhì)分子量為35. 16KDa (見(jiàn)圖7，A帶)。實(shí)施例5 :C230基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的酶活測(cè)定25°C時(shí)，分光光度計(jì)法測(cè)定375nm，C230催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為2_羥粘糠酸半醛的 增加量。酶活定義為，每分鐘轉(zhuǎn)化Iymol底物所需要的酶量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C230基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的酶活為32U/mg。
權(quán)利要求
1.一種分離自木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans LHB21，簡(jiǎn)寫(xiě)為 A. xylosoxidans LHB21)的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因，其具有如SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。
2.一種由權(quán)利要求1所述的基因編碼的鄰苯二酚2，3_雙加氧酶，其具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組克隆載體，其包含權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1所述的基因。
5.一種由權(quán)利要求3所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.一種由權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明是提供一種分離的編碼鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的基因(C230)，其來(lái)源于一種木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans LHB21，簡(jiǎn)寫(xiě)為A.xylosoxidans LHB21)菌株。該C230基因全長(zhǎng)為924bp，是以ATG起始密碼子開(kāi)始，TGA終止密碼子結(jié)束。該C230基因編碼307個(gè)氨基酸殘基，所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子量為35.16kDa，所表達(dá)蛋白質(zhì)的酶活為32U/mg。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102094031SQ20101016262
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者張慶芳, 李兵, 遲乃玉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)