一種中性蛋白酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中性蛋白酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個(gè)將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶，后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適pH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應(yīng)的最適PH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。
[0003]蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)遭、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。
[0004]蛋白酶已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶，既節(jié)省時(shí)間，又改善勞動(dòng)衛(wèi)生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎，以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對(duì)外科化膿性創(chuàng)口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療，還可用于將組織處理成為單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞組織培養(yǎng)。加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產(chǎn)品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血潰和蛋白污物，但使用時(shí)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)，引起皮疹、濕疹等過敏現(xiàn)象。
[0005]目前對(duì)于中性蛋白酶的研究還很少，主要在涉及生產(chǎn)高級(jí)調(diào)味品和食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化齊U，以及皮革脫毛、軟化、羊毛絲綢脫膠等加工領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種中性蛋白酶生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明通過將米曲霉(.Aspergillus orjzae)的中性蛋白酶基因轉(zhuǎn)入里氏木霉reesei )中，構(gòu)建得到里氏木霉工程菌株，能高效分泌表達(dá)中性蛋白酶，可廣泛應(yīng)用于食品和皮革加工領(lǐng)域。
[0007]本發(fā)明一方面提供一種里氏木霉，其攜帶有表達(dá)中性蛋白酶的重組載體。
[0008]所述中性蛋白酶為
Ca)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的酶；
(b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有中性蛋白酶活性的酶。
[0009]所述中性蛋白酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0010]本發(fā)明還提供了上述里氏木霉的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明購(gòu)建的里氏木霉工程菌能高效重組表達(dá)中性蛋白酶，發(fā)酵酶活達(dá)到5000U/mL。本發(fā)明所述中性蛋白酶的最適作用pH為7.0,且在pH50-8.0時(shí)能保持60%以上的酶活性；最適作用溫度為65°C，且在55-70°C時(shí)能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可廣泛應(yīng)用于食品和皮革加工領(lǐng)域。其中，利用所述中性蛋白酶水解豬皮中的膠原蛋白，水解率高達(dá)68%，效率高，污染少，應(yīng)用效果好。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明所述中性蛋白酶作用pH-相對(duì)酶活曲線。
[0013]圖2為本發(fā)明所述中性蛋白酶作用溫度-相對(duì)酶活曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1LOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br>[0015]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計(jì)數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICT1NARY OF MICROB1LOGY AND MOLECULARB1LOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICT1NARY B1LOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般性解釋。
[0016]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0017]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細(xì)胞是表達(dá)在天然(非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因。
[0018]術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
[0019]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0020]術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。
[0021]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0022]術(shù)語(yǔ)“載體”指被設(shè)計(jì)用來將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0023]術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
[0024]術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。
[0025]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個(gè)序列時(shí)所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0026]由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0027]術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0029]實(shí)施例1蛋白酶基因的克隆
以米曲霉(Aspergillus orjzae)基因組總DNA為模板,利用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C lmin 30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大基因進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，回收得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。將上述序列通過NCBI Blast比對(duì)分