專利名稱：：人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體(RVFab3)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)，特別是涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體；本發(fā)明還涉及該抗體在制備預(yù)防或治療狂犬病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性人獸共患病，一旦發(fā)病100%死亡。目前世界上87個(gè)國(guó)家有狂犬病報(bào)道，每年約有5萬(wàn)多人死于狂犬病(KnobelDL,etal.2005)。狂犬病暴露后預(yù)防是防治狂犬病的主要措施。對(duì)于嚴(yán)重暴露的人，世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization,WHO)建議采用狂犬疫苗注射結(jié)合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabiesimmuneglobulin,RIG)的方法。目前使用的兩類RIG為人抗狂犬病毒免疫球蛋白(humanrabiesimmuneglobulin,HRIG)禾口馬抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equinerabiesimmuneglobulin,ERIG)。由于ERIG副反應(yīng)比較嚴(yán)重，而且對(duì)某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制，而HRIG價(jià)格昂貴，供應(yīng)量有限并且有潛在的病原威脅。因此制備高效、價(jià)廉、副反應(yīng)小的被動(dòng)免疫制劑是我們的目標(biāo)。含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊。以抗原免疫動(dòng)物獲得多抗血清的途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典方法，但缺乏特異性和均一性。繼而建立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)使得眾多科學(xué)家通過細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)，其特異性強(qiáng)，性質(zhì)均一，易于大量生產(chǎn)。然而McAb多為鼠源性，鼠源McAb的異源性反應(yīng)極大地限制了McAb作為治療制劑在人體的應(yīng)用。免疫球蛋白(Vacciniaimmuneglobulin,VIG)作為抗體成分主要來(lái)自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清，從獲得陽(yáng)性血清到通過安全性檢測(cè)均需花費(fèi)大量的人力和財(cái)力，這就使其大量制備受到限制，同時(shí)由于來(lái)源于血清所以容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。因此使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，而人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和廣闊前景。通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來(lái)越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景。人源抗狂犬病毒單克隆抗體的研制和噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的產(chǎn)生為解決被動(dòng)免疫制劑問題提供了新的思路?？袢畣慰寺】贵wCR57和CR4098做成的單克隆抗體雞尾酒中和了26種典型的街毒株。對(duì)動(dòng)物的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)表明，利用單克隆抗體雞尾酒進(jìn)行治療具有可行性和優(yōu)越性(GoudsmitJ，etal.2006)。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來(lái)了新的希望，在抗病毒感染生物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(AntibodyDrug)。如同當(dāng)初血源性疫苗向基因工程疫苗的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在也急需用基因工程抗體替代血源性VIG，如通過嵌合抗體技術(shù)(Boulianne，G.L.etal.，1984；Morrison,S.L.etal.，1984)、人源化抗體技術(shù)(Jones,P.Τ.etal.，1986)、攜帶人單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)(Green,L.L.etal.，1994)、異體雜交瘤技術(shù)(James,K.etal.，1987)、噬菌體表面展示技術(shù)(Barbas,C.F.etal.，1991)等產(chǎn)生人源化抗體，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的重大方向，并正在逐步走向成功。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體及其活性片段。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備預(yù)防或治療狂犬病藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，采集多個(gè)具有高滴度狂犬病毒抗體的疫苗注射者外周血淋巴細(xì)胞，通過基因工程手段構(gòu)建了人源抗狂犬病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異抗狂犬病毒基因工程抗體Fab段。獲得的Fab段抗體命名為RVFab3。這株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的功能性抗體。它特異性識(shí)別狂犬病毒顆?？乖揖槍?duì)狂犬病毒糖蛋白G，與狂犬病毒具有明顯的免疫熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。RVFab3特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗狂犬病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來(lái)源于中國(guó)狂犬病毒疫苗免疫者外周血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，RVFab3隸屬于抗體重鏈家族VH4?？贵w蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定發(fā)明中抗體的抗原結(jié)合特征和抗狂犬病毒功能特征。決定中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列及其比較結(jié)果如表1所示表1FabsVRCDRlCDR2CDR3VHSVNFYWSYIYYSGSTNYNPSLKSERLTTGAMDVRVFab3----_VLSGSSSNIGSNTVNSNNQRPS_AAWDDSLNAWVRVFab3輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。編碼RVFab3輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNo.3所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQIDNo.4所示。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響Fab抗體活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQIDNo.1-2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高變區(qū)將具有類似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行替換，如將RVFab3的重鏈VH序列的第8位的Val替換為Ala。此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對(duì)編碼上述Fab段抗體的基因序列進(jìn)行修改，獲得編碼相同抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。進(jìn)一步，本發(fā)明將上述Fab抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得分子量更小的單鏈抗體(ScFv)，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別狂犬病毒表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)免疫的作用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用?？蓪⑸鲜鼍幋aFab抗體的基因、ScFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。此外，可將上述Fab抗體的輕鏈編碼基因和重Fd段基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗狂犬病毒的全抗免疫球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將上述Fab抗體RVFab3的輕鏈和重Fd段基因分別克隆入全抗體表達(dá)載體PAC-L-Fc并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全抗體的分泌型表達(dá)，得到全抗體RVIgG3。利用ELISA、IFA、SDS-PAGE對(duì)獲得的全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明人源IgG全抗體RVIgG3針對(duì)aG株和CTN株狂犬病毒顆粒均有特異性結(jié)合，與桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)ERA、CVS、CTN和aG株四種狂犬病毒株糖蛋白均有特異性結(jié)合。利用狂犬病毒快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)(RFFIT)對(duì)全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明RVIgG3具有較好的中和活性，能達(dá)到813.3IU/mg，完全具備了中和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-Il株的能力。本發(fā)明運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，成功地獲得了特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的人源中和性抗體；利用上述獲得的人源中和性抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和狂犬病毒感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療狂犬病的特異性抗體藥物。圖1是抗狂犬病毒人源Fab抗體與ERA、CVS、CTN和aG株狂犬病毒糖蛋白免疫熒光分析；圖2是純化后IgG的SDS-PAGE電泳圖；圖3是抗狂犬病毒人源IgG抗體針對(duì)CVS-Il狂犬病毒快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。材料和方法1.病毒、細(xì)胞、載體狂犬病毒aG株，CTN株，CVS株和ERA株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。人免疫用毒株P(guān)M株為進(jìn)口人用疫苗株，用于狂犬病毒體外中和實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為BHK-21(ATCC)。菌株為XLI-Blue(美國(guó)Stratagene)，載體為pComb3(40kb)，由美國(guó)Scripps研究所提供。桿狀病毒表達(dá)載體為pAC-L_Fc(德_PROGENPR3003)(Liang,Μ.F.，Stefan,D.，Li,D.X.，Queitsch,I.，Li,W.，andBautz,Ε.F.BaculovirusexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumanIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247:119-130.)。昆蟲細(xì)胞Sf9來(lái)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)中心(ATCC)。2.抗原制備2.1真核表達(dá)狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)分別利用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所提供的狂犬病毒aG株，CTN株，CVS株和ERA株的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增糖蛋白(G)基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)2端均引入BamHI酶切位點(diǎn)，并且在3’段添加6-His標(biāo)簽。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI酶切，將酶切后的片段回收，直接克隆到同樣經(jīng)BamHI酶切的桿狀病毒表達(dá)載體pAcUW51中，使HA基因在多角體啟動(dòng)子的控制下，經(jīng)PCR鑒定目的基因插入方向后，獲得重組質(zhì)粒為pAc-HA。通過將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞制備重組桿狀病毒進(jìn)行蛋白表達(dá)，表達(dá)采用美國(guó)Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5μg的重組質(zhì)粒DNA與0.5μg的BaculoGold線性DNA混合混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)密度為50%的Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)4天后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定和擴(kuò)增。具體操作見Baculovirusexpressionvectorsystem手冊(cè)。獲得的表達(dá)狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，45天后收獲感染細(xì)胞制成重組狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)抗原片。2.2狂犬病毒純化分別收獲狂犬病毒aG株和CTN株感染BHK-21細(xì)胞后培養(yǎng)上清，經(jīng)甲醛滅活和安全檢查后，用20%50%連續(xù)蔗糖密度梯度35000g，4°C離心3h純化病毒顆粒(BeckmanSW28)。3.噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建用淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma)從具有高滴度狂犬病毒抗體的疫苗注射者的抗凝血液中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasyMiniKit(德國(guó)QIAGEN)提取總細(xì)胞RNA，用Oligo-dT引物將提取的RNA采用Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTMIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR.CatNo.18080-051)M轉(zhuǎn)錄成cDNA，用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa和Lambda引物，對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為-MVlmin,54°Clmin，72°C2min，35個(gè)循環(huán)。建庫(kù)方法基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas,C.Fill.，Kang,A.S.，andlamer,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978_7982)。4.噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選及Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá)篩選抗原為超速離心純化的滅活病毒顆粒aG和CTN株。使用時(shí)用0.lm/LNaHC03(pH8.6)的溶液稀釋，包被免疫管，用4%脫脂奶-PBS，37°C封閉2h后，加入上述噬菌體抗體庫(kù)，每管1ml，37°C孵育2h，用5%Tween-20-TBS反復(fù)洗20遍，最后用每管ImlpH2.2的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，pH9.6的Tris液中和。洗脫后的噬菌體繼續(xù)感染2ml新鮮的OD6tltl=1.0左右的XLl-Blu菌，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13(美國(guó)Stratagene)感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此反復(fù)篩選45次。具體富集篩選方法及Fab段的誘導(dǎo)表達(dá)基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas，C.Fill.，Kang,Α.S.，andlarner,R.A.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurface:thegeneIIIsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978_7982)。5.人源抗狂犬病毒Fab抗體的ELISA檢測(cè)5.IFab表達(dá)的檢測(cè)用0.lm/LNaHCO3(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗體(美國(guó)Sigma,12000稀釋使用)于酶標(biāo)板，4°C過夜；4%脫脂奶封閉，37°Clh，加入表達(dá)的Fab抗體，370CIh；加入酶標(biāo)抗人Fab抗(美國(guó)Sigma，12000稀釋使用)，37°CIh；顯色液顯色，2MH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值。5.2間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Fab與狂犬病毒結(jié)合活性用純化的滅活狂犬病毒顆粒作為包被抗原，隨后的步驟同上。6.間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)利用已構(gòu)建的表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，45d后收獲感染細(xì)胞制成重組狂犬病毒糖蛋白抗原片。加入表達(dá)的Fab，37°C溫育30min，沖洗，加入FITC標(biāo)記的抗Fab抗體(美國(guó)Sigma)，37°C溫育30min，沖洗，晾干，顯微鏡下觀察。7.人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析用QiagenMiniprepKit(德國(guó)QIAGEN)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測(cè)序引物分別為5‘-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3‘(如SEQIDNo.5所示)和5'-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3‘(如SEQIDNo.6所示)。測(cè)序結(jié)果和InternetV-Base基因庫(kù)中IgG基因序列比較。8.全抗體重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將獲得的Fab抗體的輕鏈先用Xbal/SacI酶切，用末端補(bǔ)平酶(K片段)補(bǔ)平，克隆入pAC-L-Fc載體(德國(guó)PROGENPR3003)(Liang,M.F.，Stefan,D.,Li,D.X.,Queitsch,I.,Li,W.,andBautz,Ε.F.BaculovirusexpressioncassettevectorsforrapidproductionofcompletehumanIgGfromphagedisplayselectedantibodyfragments.JournalofImmunologicalMethods.247119-130.)，再將重鏈Fd段利用Xhol/Spel位點(diǎn)克隆進(jìn)去，構(gòu)建成全抗體表達(dá)載體。9.轉(zhuǎn)染及重組病毒感染與增殖采用美國(guó)Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5μg的重組質(zhì)粒DNA與0.5μg的BaculoGold線性DNA混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)密度為50%的Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)4d后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定和擴(kuò)增。具體操作見Baculovirusexpressionvectorsystem手冊(cè)(BDBiosciencesPharmingen,USA)。10.全抗體IgG分泌表達(dá)和純化重組病毒感染生長(zhǎng)密度70%左右的Sf9細(xì)胞，27°C吸附lh.改用SF-900IISFM無(wú)血清培養(yǎng)液，27°C培養(yǎng)35d后收集上清。采用Amersham公司的Protein-Α親和層析柱直接純化表達(dá)上清(HarlowE，LaneD.Antibodies:ALaboratoryManual[Μ].NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1988.)。利用ELISA及IFA對(duì)所獲純化的IgG抗體功能特性進(jìn)行鑒定。具體操作見材料方法5、6部分。11.人源抗狂犬病毒抗體快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)(RFFIT)取抗體及抗體標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度50μ1于96孔培養(yǎng)板中，加入中和用病毒CVS-11，50μ1/孔，同時(shí)設(shè)空白孔對(duì)照，以及中和用病毒對(duì)照孔，混勻后置37°C中和1小時(shí)，每孔加入1X106/mlBHK-21細(xì)胞懸液50μ1，置37°C5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)。待培養(yǎng)結(jié)束吸干培養(yǎng)液，每孔中加入100μ1/PBS清洗并吸干后，每孔加入預(yù)冷至4°C的80%丙酮50μ1，_30°C固定10分鐘，棄丙酮，待揮發(fā)干燥后加入工作濃度的熒光標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白抗體，50μ1/孔，37°C孵育30分鐘，甩掉液體，用PBS洗板23次，甩干液體，每孔加入80%甘油50μ1，熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)組中能使熒光灶抑制>50%的抗體最高稀釋倍數(shù)，即為被檢抗體的中和抗體滴度。根據(jù)Reed&Muench公式，計(jì)算各抗體樣品及標(biāo)注品的ED5tl，從而得出各待檢抗體的效價(jià)。12.非高變區(qū)突變后的抗體對(duì)狂犬病毒抗性的研究基于RVIgG3重鏈可變區(qū)氨基酸序列，將SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第8位的Val替換為Ala，將RVIgG3輕鏈可變區(qū)(SEQIDNo.1所示)的第10位的Gly替換為Gin。分別合成RVIgG3的重鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子gtg替換為gcc)以及輕鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子ggg替換為cag)。按照上述811的方法，將輕鏈基因和重鏈Fd段克隆到pAC-L-Fc中，并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，并對(duì)該突變體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。結(jié)果1.人源抗狂犬病毒抗體庫(kù)的篩選用純化的狂犬病毒顆粒aG株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，2輪篩選后隨機(jī)挑取6000個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(sigma公司，12000稀釋使用)、狂犬病毒顆粒aG株抗原包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(Sigma公司，12000稀釋使用)檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得2984株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆，如表2所示。2984個(gè)人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆中，有181個(gè)克隆對(duì)狂犬病毒顆粒aG株特異性結(jié)合，其中36株Fab克隆被確定為針對(duì)狂犬病毒糖蛋白。表2aG株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)富集篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用純化的狂犬病毒顆粒CTN株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，經(jīng)2輪篩選后隨機(jī)挑取2400個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(sigma公司，12000稀釋使用)、狂犬病毒顆粒aG株抗原包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(Sigma公司，12000稀釋使用)檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得1833株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆，如表3所示。1833個(gè)人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆中，有79個(gè)克隆對(duì)狂犬病毒顆粒CTN株特異性結(jié)合，其中34株Fab克隆被確定為針對(duì)狂犬病毒糖蛋白。表3CTN株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)富集篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.人源抗狂犬病毒Fab抗體的序列分析用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析處理，比較InternetV-Base基因庫(kù)中的IgG序列，上述70株特異性結(jié)合狂犬病毒糖蛋白的人源Fab單克隆抗體中，其中有11株序列不同。因此本研究成功篩選并克隆11株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列及其組合的抗體，其重鏈可變區(qū)主要分類在IgGVH4和VH3家族，其輕鏈可變區(qū)主要分類在IgGVL1、VL2、VL3和VKl家族，將11株特異性結(jié)合狂犬病毒糖蛋白的人源Fab單克隆抗體命名為RVFab1-11。其中選取RVFabl、RVab3、RVFab5、RVFab8和RVFab9比較序列如下表4人源抗狂犬病毒糖蛋白Fab抗體可變區(qū)基因的氨基酸序列比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>aVR,variableregion(可變區(qū))；VH,heavychaininVR(重鏈可變區(qū))；VL，lightchaininVR(輕鏈可變區(qū)).bCDR,complementaritydeterminingregion(互補(bǔ)決定區(qū))·3.人源抗狂犬病毒Fab抗體對(duì)狂犬病毒糖蛋白的特異性結(jié)合為了證實(shí)所獲得的重組Fab抗體對(duì)不同狂犬病毒株糖蛋白的結(jié)合特異性，我們進(jìn)一步通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定原核表達(dá)Fab抗體的功能活性。如圖1所示，RVFabl與ERA、CVS、CTN和aG株四種狂犬病毒毒株糖蛋白免疫熒光均為陽(yáng)性，與正常sf9細(xì)胞對(duì)照反應(yīng)為陰性，其余10株人源Fab抗體與不同狂犬毒株糖蛋白免疫熒光結(jié)果與RVFabl相同。免疫熒光結(jié)果證明從抗體庫(kù)篩選獲得的11株Fab陽(yáng)性抗體均針對(duì)狂犬病毒糖蛋白，且反應(yīng)普較廣。4.全抗體IgG表達(dá)和純化將5株已完成功能鑒定的Fab抗體(RVFab1、RVFab3、RVFab5、RVFab8、RVFab9)的輕鏈和重鏈Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-L-Fc后轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，分別命名為RVIgGl，RVIgG3,RVIgG5,RVIgG8及RVIgG9。采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清，通過SDS-PAGE檢驗(yàn)全抗體IgG的表達(dá)及純化情況，結(jié)果證實(shí)得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈，分別位于約28kD、55kD處。如圖2所示。5.人源抗狂犬病毒抗體快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)(RFFIT)為了進(jìn)一步研究5株全抗體IgG(RVIgGl、RVIgG3、RVIgG5、RVIgG8、RVIgG9)的中和活性，我們采用了快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗體在體外與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-Il株的中和反應(yīng)，結(jié)果顯示5株人源抗狂犬病毒全抗體RVIgGl、RVIgG3、RVIgG5、RVIgG及RVIgG9的中和效價(jià)分別為866.6IU/mg，813.3IU/mg，689.8IU/mg，876.6IU/mg，428.5IU/mg，根據(jù)WHO狂犬病專家委員會(huì)評(píng)定中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml即表示該抗體具有中和活性，因此本研究所獲得的5株人源單抗針對(duì)狂犬病毒均具有中和活性。其中RVIgG9的中和活性較弱，其余4株具有較好的中和活性，完全具備了中和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-Il株的能力，如圖3所示。6.非高變區(qū)突變后的抗體對(duì)對(duì)狂犬病毒抗性影響按照上述811的方法，將基于RVIgG3修改后的輕鏈基因和重鏈基因克隆到PAC-L-Fc中，并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，得到突變體RVIgG3’。對(duì)該突變體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明RVFab3’能特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白G，采用了快速免疫熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗體在體外與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-Il株的中和反應(yīng)，結(jié)果顯示其性質(zhì)與RVIgG3基本相同。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體，其特征在于，其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3以及重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表所示2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列和重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。3.如權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，其為單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白lgG.4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的抗體經(jīng)過改造得到的衍生抗體，所述改造包括氨基酸的缺失、替換和/或插入，并且不改變抗體的活性。5.編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體的基因。6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。7.含有權(quán)利要求5或6所述基因的表達(dá)載體。8.含有權(quán)利要求7所述表達(dá)載體的宿主。9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體在制備預(yù)防或治療狂犬病的藥物中的應(yīng)用。10.含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體的藥物或檢測(cè)試劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體RVFab3，該抗體是運(yùn)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選獲得。本發(fā)明的抗體特異性識(shí)別狂犬病毒顆粒抗原，且均針對(duì)狂犬病毒糖蛋白G，與狂犬病毒具有明顯的免疫熒光反應(yīng)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能?？蓪⒈景l(fā)明抗體制成預(yù)防和治療狂犬病的特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由狂犬病毒引起的狂犬病。文檔編號(hào)C12N15/13GK101812132SQ20101017161公開日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年5月6日優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日發(fā)明者孫麗娜,李川,李德新,梁米芳,陳哲申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所