專利名稱：產(chǎn)冠菌素桑丁香假單胞菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株產(chǎn)冠菌素桑丁香假單胞菌株M4-13及 其發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)冠菌素(Coronatine，C0R，C18H25NO4)于1977 年首次由 Ichihara 等從丁 香假單胞菌絳紅致病變種(Pseudomonas syingaepv. atropurpurea)的培養(yǎng)液中分離獲得。 冠菌素由兩個(gè)特殊的部分構(gòu)成，即雙環(huán)羧酸，稱為冠面酸(Coronafacicacid，簡(jiǎn)稱CFA)和 環(huán)丙基氨基酸，稱為冠氨酸(Coronamic acid，簡(jiǎn)稱CMA)。冠菌素作為新型的多功能復(fù)合型植物激素，具有著極其廣泛的功能與應(yīng)用前景。 不僅與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，并且與植物自身防御系統(tǒng)有著重大的關(guān)聯(lián)。它能夠調(diào)控生長(zhǎng)、抑制衰 老、促進(jìn)細(xì)胞分化、提高葉綠素含量和植物抗逆性(提高抗旱性、抗寒性、抗鹽性)，生物活 性比茉莉酸C12H18O3(jasmonic acid, JA)高100 10000倍。還可以促進(jìn)多種植物次級(jí)代 謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，如大豆抗毒素和類黃酮，水稻田滅草(提高水稻葉中的櫻花素和二萜內(nèi)酯A 含量，它們對(duì)稻田雜草有較高的抑制活性)，抗腫瘤藥物紅豆杉紫杉醇的產(chǎn)生，改善煙草品 質(zhì)等，總之，COR應(yīng)用濃度低，并且誘導(dǎo)次生物質(zhì)產(chǎn)量大大提高，具有其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)所無(wú) 法比擬的優(yōu)勢(shì)，有進(jìn)一步研究的價(jià)值和開發(fā)潛力。目前對(duì)于冠菌素的生產(chǎn)研究大多集中于發(fā)酵法生產(chǎn)，早期人們雖然建立了化學(xué)合 成冠菌素的方法，取得了冠菌素生產(chǎn)研究歷史上里程碑式的成功，不過除了理論研究上的 意義之外，其極低的產(chǎn)率與高昂的代價(jià)，使得人們對(duì)于通過化學(xué)合成法獲得大量冠菌素的 設(shè)想落空，因此人們開始關(guān)注發(fā)酵法獲得大量冠菌素的研究，進(jìn)展迅速。如日本北海道大學(xué) 市原狄民等(1998)用發(fā)酵法從250升發(fā)酵液中得到冠菌索、冠菌酸和冠烷酸共200毫克 (其中冠菌素60毫克)；張國(guó)棟(2003)發(fā)酵兩次共得到發(fā)酵液約300升，提取獲得結(jié)晶成 品1克左右和部分母液，總數(shù)約1. 3克(母液折成成品計(jì))。其他少有大規(guī)模發(fā)酵的報(bào)道， 吳曉玉等在培養(yǎng)基中添加適量錳離子可促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)及其冠毒素產(chǎn)量提高。吳慧玲等誘 變得2株在常溫下產(chǎn)生冠菌素的突變株MFB132和MFB141。該突變株發(fā)酵溫度由18°C上升 到28°C，MFB141的冠菌素產(chǎn)量達(dá)到37. 66mg/L。因此，采用發(fā)酵法生產(chǎn)冠菌素是工業(yè)化生 產(chǎn)的可行方法。不過，以往報(bào)道的產(chǎn)冠菌素菌株生產(chǎn)COR的發(fā)酵過程均需在低溫(< 28°C )下進(jìn) 行，因此低溫發(fā)酵成為其工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。因?yàn)槔么笠?guī)模發(fā)酵法發(fā)酵生產(chǎn)COR就必定 會(huì)產(chǎn)生大量熱量，而降溫設(shè)備造成成本昂貴，利用化學(xué)法合成又無(wú)法滿足大規(guī)模應(yīng)用的需 求，因此，尋找合適的耐高溫產(chǎn)冠菌素菌株是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)冠菌素的基礎(chǔ)。本專利首次 從桑樹的桑疫病組織中分離致病菌桑丁香假單胞菌，并在高溫培養(yǎng)條件(32°C )下檢測(cè)到 冠菌素產(chǎn)生，說明了其高溫條件下的產(chǎn)冠菌素活性。一方面，傳統(tǒng)的產(chǎn)冠菌素菌株報(bào)道的產(chǎn) 冠菌素活性范圍在28°C以下，本菌株首次突破了這一溫度限制，雖然產(chǎn)量不高，但作為良好 的出發(fā)菌株，有助于突破長(zhǎng)期以來(lái)困擾冠菌素大規(guī)模發(fā)酵的低溫限制性因素，為相關(guān)的應(yīng)
3用于研究奠定的基礎(chǔ)；另一方面，本專利提供的菌種作為桑樹的桑疫病致病菌，其產(chǎn)冠菌素 特性的發(fā)現(xiàn)對(duì)于揭示桑疫病傳播和流行機(jī)理提供了重大線索，對(duì)于我國(guó)蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康發(fā) 展有著至關(guān)重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題針對(duì)以上問題，本發(fā)明分離篩選桑疫病致病菌桑丁香假單胞菌，并分別 在首次從發(fā)酵液中分離檢測(cè)到冠菌素，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，可使之表現(xiàn)穩(wěn)定的產(chǎn)冠菌素能 力。技術(shù)方案一株桑丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae pv. mori)M4_13 菌株， 保藏日期為2010年2月1日，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3621。桑丁香假單胞菌M4-13的篩 選和發(fā)酵條件的優(yōu)化。在溫度25 40°C的培養(yǎng)基中接菌，搖瓶培養(yǎng)1 14天得發(fā)酵液， 所述培養(yǎng)基的PH 7. 5 8. 0，培養(yǎng)基質(zhì)量百分比為磷酸氫二鉀0. 2% 0. 6%、磷酸二氫 鉀0. 05 % 0. 6 %、氯化銨0. 01 % 0. 5 %、七水合硫酸鎂0. 001 0. 1 %、葡萄糖0. 1 % 5 %，氯化高鐵1 15 μ M ； 18°C下7天(32°C下3天)取發(fā)酵液，NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH至9 12，乙酸乙酯反復(fù)萃取兩次，取水相，再調(diào)節(jié)PH至2 5，乙酸乙酯萃取兩次，取有機(jī)相，減壓 蒸餾致結(jié)晶，以甲醇溶解，得冠菌素甲醇溶液。有益效果本發(fā)明的微生物分類命名為桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori)M4-13菌株，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏單位地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào) 是CGMCC No. 3621，保藏時(shí)間是2010年2月1日。本發(fā)明首次從桑疫病組織中分離致病菌桑丁香假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)冠菌素特 性，且在高溫(32°C )下檢測(cè)到冠菌素產(chǎn)生，說明了其高溫條件下的產(chǎn)冠菌素活性。一方面， 傳統(tǒng)的產(chǎn)冠菌素菌株報(bào)道的產(chǎn)冠菌素活性范圍在28°C以下，本菌株首次突破了這一溫度限 制，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種新的出發(fā)菌株，有助于突破長(zhǎng)期以來(lái)困擾冠菌素大規(guī) 模發(fā)酵的低溫限制性因素，為相關(guān)的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)；另一方面，作為桑疫病致病菌， 其產(chǎn)冠菌素特性的發(fā)現(xiàn)對(duì)于揭示桑疫病傳播和流行機(jī)理提供了重大線索，對(duì)于我國(guó)蠶桑產(chǎn) 業(yè)的健康發(fā)展有著至關(guān)重要的意義。本發(fā)明菌株桑丁香假單胞菌系從桑疫病發(fā)病部位中分離得到，觀察分析了該菌形 態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理特性及代謝特征，結(jié)果表明該菌株具有以下特征(1)形態(tài)學(xué)特征 生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)成的菌落白色，正反面顏色均一，呈圓形，鼻涕狀(見附圖1)，革蘭氏染色為陰 性(見附圖2) ； (2)培養(yǎng)特征利用標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基，與優(yōu)化HSC培養(yǎng)基均能正常生長(zhǎng)，(3) 生理特征對(duì)碳源、氮源及溫度有廣泛的適應(yīng)性，易培養(yǎng)；(4)代謝特征將該菌液體擴(kuò)大培 養(yǎng)后應(yīng)用HPLC分析發(fā)現(xiàn)，其在18°C和32°C條件下均有冠菌素產(chǎn)生。
四

圖1為桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4_13菌株經(jīng)培養(yǎng)的形 態(tài)學(xué)特征；圖2為桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4_13菌株經(jīng)革蘭氏染 色結(jié)果。五具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例說明桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4_13菌株的篩 選過程。采集染桑疫病桑枝和葉片，搗碎放入50mL無(wú)菌水的錐形瓶中，加入20顆左右的玻 璃珠，劇烈震蕩20min，使組織完全搗碎，靜置。在每只50mL無(wú)菌水的三角瓶中加入ImL 土 壤樣品懸浮液，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，37°C下培養(yǎng)2天。取懸液涂布于初篩MG平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行產(chǎn)酶菌株的初篩。每升初篩培養(yǎng)基的組 分為蛋白胨5. Og，甘露醇5. Og，谷氨酸鈉1. 15g，生物素0. OOOlg，磷酸氫二鉀0. 25g，氯化 鈉0. lg，七水合硫酸鎂0. lg，瓊脂llg。溫度32°C，培養(yǎng)時(shí)間1 6天。挑選產(chǎn)生菌落較大 的菌株20株，接種到King’ B斜面培養(yǎng)基。King’ B培養(yǎng)基基本配方，每升組分為蛋白胨 20. 0g，磷酸氫二鉀1. 5g，七水合硫酸鎂1. 5g，瓊脂15g，ph7. 2士0. 2 ；使用方法稱取基本配 方38g，加入蒸餾水1L，并加入IOml甘油，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，每管5ml，制 成斜面。32°C斜面培養(yǎng)過夜，接種至HSC培養(yǎng)基，HSC培養(yǎng)基基本配方，每升組分為磷酸氫 二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂0. 2g、氯化高鐵2 μ Μ、葡萄糖20g，18 度培養(yǎng)七天，取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)。HPLC法的檢測(cè)條件為色譜柱AlltimaC18(150mmX4. 6mm)；流動(dòng)相0· 5g/L 磷酸甲醇(40 60，V/ V)；檢測(cè)波長(zhǎng):230nm ；流速:lmL/min ；柱溫:30°C ；進(jìn)樣量:20μ L。實(shí)施例2本實(shí)施例說明桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4_13菌株利用 標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基于18°C下的產(chǎn)冠菌素活性。每升培養(yǎng)基組成蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉10g，將桑丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae pv. mori)M4_13以1 %的接種量接種于培養(yǎng)基中，于溫度18°C好氣 培養(yǎng)7天，取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)，濃度為0. 54mg/L。實(shí)施例3本實(shí)施例的方法與實(shí)施例2相同，改用優(yōu)化HSC培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)其產(chǎn)冠菌素活 性。每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂 0. 2g、氯化高鐵2μΜ、葡萄糖20g，將桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori) M4-13以的接種量接種于培養(yǎng)基中，于溫度18°C好氣培養(yǎng)7天，取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)， 濃度為2mg/L。實(shí)施例4本實(shí)施例的方法與實(shí)施例3相同，改變溫度至32度，檢測(cè)其產(chǎn)冠菌素活性。
每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂 0. 2g、氯化高鐵2μΜ、葡萄糖20g，將桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori) M4-13以的接種量接種于培養(yǎng)基中，于溫度32°C好氣培養(yǎng)3天，取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)， 濃度為 0. 003mg/L。實(shí)施例5本實(shí)施例的方法與實(shí)施例3相同，改變溫度及發(fā)酵時(shí)間，檢測(cè)其產(chǎn)冠菌素活性。每升培養(yǎng)基組成磷酸氫二鉀4. lg、磷酸二氫鉀3. 6g、氯化銨lg、七水合硫酸鎂 0. 2g、氯化高鐵2μΜ、葡萄糖20g，將桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori) M4-13以的接種量接種于培養(yǎng)基中，于溫度32°C好氣培養(yǎng)1天，變溫至18°C發(fā)酵2天， 取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)，濃度為3. 5mg/L。
權(quán)利要求
一株桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4 13菌株，該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2010年2月1日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.3621。
2.利用權(quán)利要求1所述的桑丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae pv. mori)M4-13 菌株發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的方法，其特征在于利用桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4-13菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)冠菌素培養(yǎng)在溫度25 40°C的培養(yǎng)基中接菌，搖瓶培養(yǎng) 1 14天得發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH7. 5 8. 0，培養(yǎng)基質(zhì)量百分比為磷酸氫二鉀0. 2 % 0. 6%、磷酸二氫鉀0. 05% 0. 6%、氯化銨0. 01% 0. 5%、七水合硫酸鎂0. 001 0. 1%、 葡萄糖0. 1 % 5 %，氯化高鐵1 15 μ M ；在18°C下培養(yǎng)，發(fā)酵5 14天所得發(fā)酵液，經(jīng) HPLC均檢測(cè)到冠菌素生成；在32°C下培養(yǎng)，發(fā)酵3天所得發(fā)酵液，經(jīng)HPLC檢測(cè)到冠菌素生 成。
3.利用權(quán)利要求1所述的桑丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae pv. mori)M4-13 菌株發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的方法，其特征在于在溫度25 40°C的培養(yǎng)基中接菌，所述培養(yǎng)基 的pH7. 5 8. 0，培養(yǎng)基質(zhì)量百分比為磷酸氫二鉀0. 2% 0. 6%、磷酸二氫鉀0. 05% 0. 6%、氯化銨0. 01% 0. 5%、七水合硫酸鎂0. 001 0. 1%、葡萄糖0. 5%，氯化高 鐵1 15 4 11，于溫度321好氣培養(yǎng)1天，變溫至18°C發(fā)酵2天，取發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)到冠 菌素生成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)冠菌素桑丁香假單胞菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的方法。發(fā)明中涉及的一株桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌已保藏，保藏日期為2010年2月1日，保藏登記號(hào)為CGMCC No.3621。桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13的高溫(32℃)產(chǎn)冠菌素活性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101948764SQ201010171338
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者呂榮斌, 吳福安, 方水琴, 梁垚, 王俊, 陳明勝 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)