專利名稱：一種提高脂肪酶活力持續(xù)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)脂肪酶以提高該酶活力持續(xù)性的方法。
背景技術(shù)：
酯是一大類在化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的重要產(chǎn)品或中間體，僅用作食用香料的酯即達(dá)數(shù)百種。各種酯的合成路線相同，均以羧基供體(如酸、酸酐)和羥基供體 (如醇、淀粉等)為原料，通過酯化反應(yīng)制備。脂肪酶能催化許多種酯的生物合成。與酯的化學(xué)合成相比，酯的生物合成具有效率更高、反應(yīng)條件溫和、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。但目前應(yīng)用的脂肪酶存在酶活力持續(xù)性不足這一問題。包括脂肪酶在內(nèi)的各種酶的重組表達(dá)方式有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種，這兩種酶的重組表達(dá)方式使酶分子與宿主細(xì)胞之間沒有關(guān)聯(lián)，即酶分子不是宿主細(xì)胞的組成部分，從而很容易失活。如果使酶分子成為細(xì)胞的有機(jī)組成部分，則只要細(xì)胞保持存活狀態(tài)酶分子也會(huì)保持活力，從而可以顯著提高酶的活力持續(xù)性。本發(fā)明開發(fā)一種使脂肪酶成為釀酒酵母細(xì)胞有機(jī)組成的技術(shù)，即將脂肪酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細(xì)胞的組成部分，只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活則脂肪酶始終保持活性狀態(tài)，從而顯著提高了脂肪酶活力持續(xù)性。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的脂肪酶活力持續(xù)性不足的問題，本發(fā)明提供一種使脂肪酶成為釀酒酵母細(xì)胞有機(jī)組成部分的技術(shù)，使脂肪酶只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高脂肪酶活力持續(xù)性。本發(fā)明的一種提高脂肪酶活力持續(xù)性的方法，包括以下步驟將脂肪酶基因(Genbank號連接(常規(guī)方法)在釀酒酵母細(xì)胞壁成份 FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(常規(guī)方法)釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子(Genbank號:AY428072)下游MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GALl啟動(dòng)子+MF α 1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有4. 2-6. 8% (重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培養(yǎng)基中本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將脂肪酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活狀態(tài)，脂肪酶即可保持活力。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述
實(shí)施例1脂肪酶展露表達(dá)將脂肪酶基因(來自Rhizopus oryzae, Genbank號AF22943Q連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank號S73336)的 N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子(來自釀酒酵母表達(dá)載體pYES263，Genbank 號AY428072)下游MF α 1信號肽序列(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank號M17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框(從N端到C端):GAL1啟動(dòng)子+MF α 1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列。將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞 (Saccharomycescerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)JlJMF α 1信號肽將引導(dǎo)脂肪酶向釀酒酵母細(xì)胞外分泌，而脂肪酶下游的FLO序列則錨定在釀酒酵母細(xì)胞壁中，從而使脂肪酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面。實(shí)施例2脂肪酶展露表達(dá)的誘導(dǎo)在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，添加4. 2-6. 8%半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. , Ltd.), 則表達(dá)框“GALl啟動(dòng)子+MF α 1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GALl啟動(dòng)子就會(huì)活化，誘導(dǎo)脂肪酶在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)。實(shí)施例3半乳糖對脂肪酶展露表達(dá)的作用在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，如果不含半乳糖，則未檢測到脂肪酶活性，這是因?yàn)楸磉_(dá)框“GAL1啟動(dòng)子+MF α 1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GALl啟動(dòng)子無法活化。實(shí)施例4脂肪酶展露表達(dá)后其活力持續(xù)性顯著提高按照實(shí)施例1和實(shí)施例2所示步驟進(jìn)行展露表達(dá)的脂肪酶活性為512U/mL(4. 2% 半乳糖)和505U/mL(6. 8%半乳糖)，半衰期均為65天，即第65天時(shí)能保持起始活性的一半。而如果在實(shí)施例1和實(shí)施例2所示的展露表達(dá)表達(dá)框“GAL1啟動(dòng)子+MFa 1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中去除FLO序列序列，則脂肪酶進(jìn)行分泌表達(dá)，活性為141U/ mL (4. 2%半乳糖)和137U/mL(6. 8%半乳糖)，半衰期均僅為7天，即第7天時(shí)能保持起始活性的一半。因此，將脂肪酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細(xì)胞的組成部分，只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活則脂肪酶始終保持活性狀態(tài)，從而顯著提高了脂肪酶活力持續(xù)性。對脂肪酶活性測定采用脂肪酸釋放測定法，活性單位定義為在pH 7.0的25% 橄欖油(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.，Ltd.)溶液中，每分鐘釋放出1 μ mol脂肪酸(標(biāo)準(zhǔn)品購自上海生工生物工禾呈有P艮公司，Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.，Ltd.)的酶量定義為1個(gè)脂肪酶活力單位(U)。最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高植酸酶活力持續(xù)性的方法，其特征在于包括以下步驟將植酸酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子下游MFa 1信號肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動(dòng)子+MF α 1信號肽序列+植酸酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有重量百分比3-6. 5%半乳糖的YPD培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明的一種提高脂肪酶活力持續(xù)性的方法，包括以下步驟將脂肪酶基因(Genbank號AF229435)連接(常規(guī)方法)在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(常規(guī)方法)釀酒酵母表達(dá)載體GAL 1啟動(dòng)子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動(dòng)子+MFα1信號肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將脂肪酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活狀態(tài)，脂肪酶即可保持活力。
文檔編號C12R1/865GK102242088SQ20101017180
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風(fēng)蘭 申請人:浙江大學(xué)