攜帶hsl基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，尤其涉及一種利用攜帶HSL基因的重組腺病毒進行降低血脂的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活水平的提高，大量高脂、高熱量食品被人們廣泛食用，同時，隨著生活節(jié)奏的加快，生活壓力加大，運動量減少，人類身體狀態(tài)每況愈下，三高人群逐年遞增，并開始成為誘使人類死亡的主要原因。
[0003]在基因研宄過程中，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)是脂肪分解的一種限速酶，其能夠水解甘油三酯(TG)、甘油二酯(PG)、膽固醇酯和其他脂質(zhì)及水溶性底物，并產(chǎn)生游離脂肪酸。HSL主要存在于脂肪組織中，在胰腺、睪丸、肌肉、腎上腺等組織中也有少量表達。
[0004]隨著基因工程的深入，探討基因工程對降低血脂的影響和作用，確定出可行、有效的降血脂方法，就成為本發(fā)明的主要目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于上述現(xiàn)有情況，本發(fā)明旨在提供一種利用攜帶HSL基因的重組腺病毒進行降血脂的應(yīng)用，以滿足人類需要，改善血脂含量，促進身體健康。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0007]一種攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用。
[0008]其中，HSL為人激素敏感性脂肪酶，其基因序列記載于Langin D，Laurell H，Holst LS，Belfrage P，Holm C.Gene organizat1n and primary structure ofhuman hormone-sensitive lipase:possible significance of a sequence homologywith a lipase of Moraxella TA144，an Antarctic bacterium.Proc Natl Acad SciU.S.A.1993June I ；90(11):4897-9010
[0009]所述攜帶HSL基因的重組腺病毒采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法制備取得。具體步驟包括:將HSL基因克隆到穿梭質(zhì)粒pXCJLl-CMV/pA的多克隆位點；然后與腺病毒載體GT4050通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使其進行細(xì)胞內(nèi)同源重組，通過HEK293細(xì)胞包裝獲得攜帶HSL基因的重組腺病毒Ad-HSL。對獲得的重組腺病毒Ad-HSL進行擴增，采用CsCl密度梯度離心進行純化和滴度測定，得到的產(chǎn)品在純度和滴度方面均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
[0010]所述降血脂方面的應(yīng)用包括降低血糖濃度、減輕體重和/或改善血脂代謝異常。
[0011]本發(fā)明所述的攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用，其通過對Ad-HSL在D1小鼠或db/db小鼠模型的治療得出:Ad-HSL可明顯降低小鼠體重和血脂含量，改善血脂代謝異?，F(xiàn)象。故證明，Ad-HSL在降血脂方面應(yīng)有積極、有效、可靠的作用，為降低血脂、血糖提供了新的解決思路。
【附圖說明】
[0012]圖1治療后小鼠體重變化曲線對照圖；
[0013]圖2治療后小鼠血脂指標(biāo)含量的對比直方圖；
[0014]圖3治療后小鼠血糖濃度變化的對比直方圖；
[0015]圖4治療小鼠經(jīng)q-PCR檢測后mRNA含量的對比直方圖。
【具體實施方式】
[0016]為證明上述應(yīng)用，下面結(jié)合附圖1-4對本發(fā)明所述的攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用進行詳細(xì)驗證說明:
[0017]一、實驗動物模型構(gòu)建
[0018]ULeprdb db (db/db)小鼠模型構(gòu)建
[0019]Lprdb db小鼠，5-6周齡，雄性，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h/12h黑白交替。每3天稱量小鼠體重，每4天檢測小鼠隨機血糖，待平均體重至30g，隨機血糖大于18mmol/L時開始治療。
[0020]2、飲食誘導(dǎo)肥胖(Diet-1nduced-Obese，D1)小鼠模型構(gòu)建
[0021]3-4周齡C57BL/6J雄性小鼠，普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)I周后，按空腹體重隨機選擇8只小鼠設(shè)為正常對照組(Normal)，喂飼普通飼料，其余小鼠喂飼高脂飼料(60Kcal%脂肪，7Kcal%蔗糖)。每5天稱量一次小鼠體重。喂養(yǎng)4周后，在高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠中，選擇體重高于對照組平均體重20%的個體，按體重平均分組。
[0022]二、動物模型的治療
[0023]雄性D1小鼠或db/db小鼠平均分成兩組，每組8只，在實驗第I天和第15天兩次給予尾靜脈注射給藥。兩組分別注射Ad-GFP(2X109IU/0.1mL生理鹽水)和Ad-HSL (2 X 109IU/0.1mL生理鹽水)，同時，以8只雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組(Normal)進行對照。其中，Ad-GFP治療組的設(shè)置是為了排除腺病毒載體本身在治療過程中可能存在的作用，其制備過程與Ad-HSL相同；而正常對照組的設(shè)置則是為了提供正常指標(biāo)作為參考。
[0024]三、動物試驗相關(guān)指標(biāo)檢測
[0025]1、稱量體重
[0026]每周兩次稱量小鼠體重，根據(jù)小鼠平均體重繪制體重變化曲線。
[0027]2、空腹血糖檢測
[0028]實驗開始后，每周測一次小鼠空腹血糖。方法為:小鼠禁食10小時后，尾部取血，滴在血糖試紙的反應(yīng)端，通過血糖測試儀顯示出血糖濃度，繪制血糖變化曲線。
[0029]3、血脂指標(biāo)檢測
[0030]實驗結(jié)束后，摘除小鼠眼球收集外周血，3000rpm離心1min分離血清，樣品進行甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)檢測。
[0031]四、實驗結(jié)果
[0032]UAd-HSL可抑制小鼠體重增長
[0033]如圖1所示，與Ad-GFP治療組相比:Ad_HSL治療組小鼠體重增長速度較慢，可明顯抑制小鼠體重增長。
[0034]2、Ad-HSL可顯著改善小鼠血脂代謝異常
[0035]如圖2所示，與Ad-GFP治療組相比:Ad_HSL治療組小鼠的血脂代謝異常得到改善、接近正常值，表現(xiàn)為:總膽固醇(CHOL)含量下降，高密度脂蛋白(HDL-C)含量下降，低密度脂蛋白(LDL-C)含量下降。
[0036]3、Ad-HSL可顯著改善小鼠血糖濃度
[0037]如圖3所示，與Ad-GFP治療組相比:在各治療周期內(nèi)，Ad-HSL治療組小鼠的血糖濃度顯著降低。
[0038]4、Ad-HSL可提高棕色脂肪特異性基因的mRNA含量
[0039]如圖4所示，經(jīng)q-PCR檢測，Ad-HSL治療組小鼠脂肪組織中，棕色脂肪特異性基因uncoupling protein I(UCP-1)，PRDl-BFl-RIZlhomologous domain containing 16(Predm16)的mRNA含量顯著提高。其中，棕色脂肪可以分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，棕色脂肪特異性基因UCP-1和Predml6的mRNA含量的提高，表明Ad-HSL治療組小鼠體內(nèi)白色脂肪的代謝能力提高，即有利于減輕體重。
【主權(quán)項】
1.一種攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用，其特征在于，所述攜帶HSL基因的重組腺病毒采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法制備取得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用，其特征在于，所述降血脂方面的應(yīng)用包括降低血糖濃度、減輕體重和/或改善血脂代謝異常。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種攜帶HSL基因的重組腺病毒在降血脂方面的應(yīng)用，其中，攜帶HSL基因的重組腺病毒Ad-HSL采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法制備取得；降血脂方面的應(yīng)用包括降低血糖濃度、減輕體重和/或改善血脂代謝異常。通過Ad-HSL治療DIO小鼠或db/db小鼠模型實驗得出：Ad-HSL可明顯降低小鼠體重和血脂含量，改善血脂代謝異?，F(xiàn)象。Ad-HSL在降血脂方面有積極、有效、可靠的作用，為降低血脂、血糖提供了新的解決思路。
【IPC分類】A61K48-00, A61P3-06, A61K38-46
【公開號】CN104623691
【申請?zhí)枴緾N201510067611
【發(fā)明人】段海峰, 胡顯文, 劉金, 王友亮, 劉廣洋
【申請人】北京吉源生物科技有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月10日