專利名稱：一種噬菌體核酸酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種噬菌體核酸酶及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核酸酶廣泛存在于病毒、原核生物和真核生物。不同核酸酶的底物專一性和作用 模式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱為核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能 作用于DNA，稱為脫氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶專一性較低，既能作用于RNA也能作 用于DNA，通稱為核酸酶(nuclease)。根據(jù)切割特點(diǎn)可分為核酸外切酶(exonuclease)和 核酸內(nèi)切酶(endonuclease)。有些核酸酶對(duì)底物的切割具有序列特異性，如限制性內(nèi)切酶 (Restrictions enzyme)EcoR I，有些酶對(duì)底物的切割沒(méi)有特別的序列偏好，如DNase I。噬菌體基因組中通常編碼一些核酸酶，這些核酸酶參與了噬菌體DNA復(fù)制、噬菌 體“溶原”過(guò)程與其基因組與宿主基因組的整合，噬菌體“溶菌”過(guò)程中宿主基因組的降解 和自身DNA單元的拆分。如T7噬菌體中就包含T7核酸外切酶和T7核酸內(nèi)切酶I，T7核酸 內(nèi)切酶參與了自身DNA復(fù)制單元的拆分和宿主基因組DNA降解。如Τ4噬菌體中的Τ4核酸 內(nèi)切酶VII，該酶缺失導(dǎo)致分枝DNA中間體的累積。隨機(jī)作用的核酸酶對(duì)DNA的降解過(guò)程有所不同。大致可以分為三種其一，有些核 酸酶只隨機(jī)地在DNA鏈中引入“切刻”，當(dāng)隨機(jī)切刻足夠多，則會(huì)出現(xiàn)相鄰且相對(duì)的兩個(gè)切 刻位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。在這種催化模式中，反應(yīng)初期DNA似乎沒(méi)有被切割(事實(shí)上已 有許多切刻位點(diǎn))，當(dāng)降解達(dá)到一定閾值時(shí)，DNA雙鏈迅速崩解。其二，隨機(jī)切刻的同時(shí)，“切 刻”位點(diǎn)專一性切割的酶聯(lián)合作用，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。這種方式DNA雙鏈的斷裂是漸進(jìn)的 過(guò)程。其三，酶隨機(jī)在DNA雙鏈的某一位置，同時(shí)在兩條鏈上引入切點(diǎn)，導(dǎo)致DNA直接斷裂。 這種方式的結(jié)果與第二種類似。生物體內(nèi)核酸酶的隨機(jī)切割模式主要采用前兩種方式，第 三種切割模式的核酸酶的活力對(duì)細(xì)胞是致命性的，其一旦作用可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，因 而這類酶的活性必然受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。已知的核酸酶在序列上具有非常大的變異，通過(guò)對(duì)大量序列的比較發(fā)現(xiàn)，核酸酶 序列中還是能夠找到一些常見(jiàn)的保守序列模式。如在限制性內(nèi)切酶和一些其它功能的核 酸酶中包含PD_(E/D)XK序列，但反過(guò)來(lái)包含該序列模式的蛋白不一定是核酸酶。Sanger center的蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)中，所有包含PD- (E/D) XK序列的蛋白分在同一個(gè)分枝CL0236，該 分枝中包含了 44個(gè)蛋白家族，其中有17家族功能未知，功能已知的家族中，有的屬于限制 性內(nèi)切酶，有些屬于解析酶，有些屬于轉(zhuǎn)座酶，有些屬于DNA結(jié)合蛋白。大腸桿菌噬菌體phivlO (Escherichia phage phivlO)是一種侵染大腸桿菌的雙 鏈DNA溫和噬菌體，其基因組測(cè)序完成于2006年。但關(guān)于phivlO基因組中各個(gè)基因編碼 產(chǎn)物的功能鮮有報(bào)道。phivl0-p45編碼一種114個(gè)氨基酸殘基的蛋白，該蛋白包含PD-(E/ D) XK基序，屬于功能未知的蛋白家族PF06356 (DUF1064)中的一個(gè)成員。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明高效表達(dá)純化獲得該蛋白，并證明phivl0-p45具有隨機(jī)切刻和隨機(jī)降解雙鏈DNA的能力，并對(duì)其催化特點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為該蛋白家族 首次提供了功能注解，為該家族成員的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供一種噬菌體核酸酶基因，上述基因具有SEQ ID NO. 2的序列。本發(fā)明提供一種合成所述的噬菌體核酸酶基因的方法通過(guò)重疊延伸PCR法將人 工設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列進(jìn)行拼接，得到所述基因，其中，所述寡核苷酸序列如下PhivlO-ICAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCG ； phivlO-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCT ；phiν10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTG ；ph i ν10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTG ；ph i ν10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCC ；phivlO-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT ；phiν10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAAC ；phiν10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCAT ；phiν10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCT ；phiv10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC ；本發(fā)明提供一種噬菌體核酸酶，所述核酸酶帶有SEQ ID NO. 2序列的基因，并進(jìn)一 步具有SEQ ID NO. 1的序列。本發(fā)明提供一種上述的噬菌體核酸酶的制備方法，包括如下步驟1)對(duì)所述噬菌體核酸酶基因進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切；2)將步驟1)所得基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組載體，所述表達(dá)載體優(yōu)選pET28a 和pET2Ia-MBP。其中，所述pET2Ia-MBP載體由pET21a載體改造得到，在Nde I和EcoR I 位點(diǎn)之間插入了 MBP編碼區(qū)；3)用所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，表達(dá)。所述大腸桿菌優(yōu)選大腸 桿菌 ER2566 ；4)收集菌體，破碎，純化。本發(fā)明還提供上述核酸酶在切割雙鏈DNA中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的技術(shù)方案能夠達(dá)到以下效果1、本發(fā)明提供的核酸酶具有隨機(jī)切割雙鏈DNA的能力，在含Mg2+的緩沖溶液中，該 酶可隨機(jī)切刻雙鏈DNA中的一條鏈，在含Mn2+的緩沖溶液中，該酶可隨機(jī)降解雙鏈DNA。2、將該酶開發(fā)為產(chǎn)品，可應(yīng)用于科學(xué)研究、臨床檢測(cè)、工業(yè)生產(chǎn)等過(guò)程。如利用該 酶的隨機(jī)切刻活力，在DNA鏈上產(chǎn)生隨機(jī)切刻，應(yīng)用于經(jīng)典的切刻平移DNA標(biāo)記過(guò)程，可利 用隨機(jī)切刻活性，實(shí)現(xiàn)基于PCR的全基因組擴(kuò)增。利用其隨機(jī)切割活力非專一性的降解 DNA,以降低細(xì)胞或細(xì)菌裂解液的粘度，去除污染的DNA等。3、本發(fā)明提供的噬菌體核酸酶的制備方法，首次高效表達(dá)純化獲得該酶蛋白。


圖1為phivl0-p45所在蛋白家族與其它三個(gè)包含PD_(E/D)XK基序家族的系統(tǒng)發(fā)育分析。圖2為本發(fā)明提供的人工合成的phivl0-p45序列與Genbank中原始序列的比對(duì)。圖3為phivl0-p45在大腸桿菌中的高效融合表達(dá)與純化。圖4為phivl0-p45在不同二價(jià)金屬離子緩沖溶液中的活力檢測(cè)。圖5為phivl0-p45在含Mg2+和Mn2+的緩沖溶液中的催化特征。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以 更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)施方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1. phivl0-p45及其所在蛋白家族與其它已知蛋白家族的關(guān)系在對(duì)TTendonuclease I進(jìn)行BLAST同源序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的功能 未知的蛋白超家族PF06356 (DUF1064)，該家族具有核酸酶中廣泛存在的PD_ (D/E) XK特 征基序。為了弄清該家族成員是否是核酸酶，如果是核酸酶，其催化有什么特點(diǎn)等問(wèn)題， 選出其中跟T7 endonuclease I蛋白序列相似性較高、來(lái)自大腸桿菌噬菌體phivlO的 phivl0-p45, UniPort 數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為 Q286X2。圖1為基于27種包含PD_(D/E)XK基序蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析，從樹型可看出，所 有蛋白清晰地分到了 4個(gè)分枝中。phivlO-45處于一個(gè)獨(dú)立的分枝，該分枝中蛋白的功能 在本申請(qǐng)前標(biāo)注為“功能未知”。另外三個(gè)分枝分別為限制性內(nèi)切酶BamHI家族、噬菌體核 酸酶I和SfsA DNA結(jié)合蛋白家族。多序列比對(duì)使用ClustalW2. 0，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用 Mega4. 0 白勺 Neighbor-joining圖1中序列編號(hào)均為Unitport數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白編號(hào)，其中phivl0-p45單獨(dú)用 和下劃線標(biāo)出，樹的四個(gè)分枝分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)CL0236 clan的四個(gè)蛋白家族， PF03749、PF05367、PF06356 (DUF1064)和 PF02923。實(shí)施例2.phivl0-p45基因的合成以NCBI中大腸桿菌噬菌體phivlO的全基因組序列(NC_007804)為參考，其中編 碼phivl0-p45的基因位于35150到35494bp處，編碼產(chǎn)物為一種114個(gè)氨基酸殘基的小分 子蛋白。以該序列為基礎(chǔ)，利用密碼子優(yōu)化程序，使其密碼子更適合在大腸桿菌中表達(dá)，并 去除序列中部的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，優(yōu)化后的序列如SEQ ID NO. 2所示。圖2為優(yōu)化后的序列與原始序列比對(duì)的結(jié)果。其中phiV10_p45_original為 Genbank中的原始序列，phivl0_p45_synthetic為序列表中SEQ ID NO. 2的序列。采用重疊延伸PCR技術(shù)將10段人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列進(jìn)行拼接，獲得人工合成 的phivl0-p45基因。所使用的10段寡核苷酸序列如下phivl0-lCAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCGphivlO-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCTph i v10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTGphiv10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTGph i v10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCCphivlO-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT
phiv10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAACphiv10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCATphiv10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCTphiv10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC其中phivlO-1和phivl0-10兩段寡核苷酸中分別包含了 EcoR I和Hind III切 點(diǎn)。合成過(guò)程采用重疊延伸PCR，反應(yīng)體系為100 iil，其中包括5U VentDNApolymerase, phivlO-1和phivlO-lO的終濃度為0. ImM，其它8段核苷酸的濃度均為0. OlmM。PCR程序 為95°C 30s,50°C 30s, 72度30s，共循環(huán)30次。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR拼接產(chǎn)物， 出現(xiàn)350bp左右的預(yù)期片段，并利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段。目的片段 經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后分別與pET28a和pET21a_MBP載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a，分別在含有氨芐青霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選，陽(yáng)性重組子 經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序進(jìn)一步進(jìn)行確證，最終獲得兩種包含人工合成phivl0-p45基因的重 組質(zhì)粒pET28a-phivlO-p45 和 pET21a_MBP-phivlO-p45，前者可用于表達(dá) His-tag 融合的 phivl0-p45，后者可用于表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合的phivl0-p45。其中pET21a_MBP 載體由pET21a載體改造而來(lái)，在Nde I和EcoR I位點(diǎn)之間插入了 MBP編碼區(qū)。實(shí)施例3. phivl0-p45的表達(dá)純化將重組載體pET28a-phivlO-p45或pET21a-MBP-phivlO-p45 轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566 感受態(tài)細(xì)胞，獲得抗生素篩選陽(yáng)性克隆。然后轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入 終濃度為0. 5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體，超聲破碎后，分別使用Amylose或Ni_NTA親和 層析進(jìn)行分離純化。圖3為MBP和His-tag融合的phivl0_p45的表達(dá)情況。圖3A為MBP融合的 phivl0-p45的表達(dá)情況，圖3B為His-tag融合的phivl0-p45的表達(dá)情況。其中M泳道為 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，第1泳道不含重組質(zhì)粒的對(duì)照，泳道2為菌體總蛋白，泳道3為菌體可 溶性總蛋白。泳道4分別為純化后的MBP-phivlO-p45和His6-phiv 10_p45。利用軟件分析phivl0-p45的等電點(diǎn)和分子量，結(jié)果表明pi = 9. 44，麗= 13114. IDa。實(shí)施例4. phivl0-p45的酶學(xué)性質(zhì)一、phivl0_p45的離子依賴性以pUC19為底物檢測(cè)phivl0-p45在不同離子中的核酸酶活性。反應(yīng)體系為20iU， 反應(yīng)緩沖液為包含 20mM Tris-HCl pH7. 6,50mM NaCl,2mM DTT，包含 liig pUC19,1 u 1 phivl0-p45蛋白，不同反應(yīng)管中加入了不同的金屬離子(終濃度5mM)，依次為Mg2+、Mn2+、 Ca2\ Ni2+、Cu2\ Co2\ Zn2+，37°C溫浴lh，然后用1. 5%的瓊脂糖凝膠分析pUC19質(zhì)粒的降解 情況，結(jié)果如圖4所示。圖4中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，第1泳道為未加酶的對(duì)照，其余泳道依次為反應(yīng) 體系中加入Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、CU2+、C02+、Zn2+離子的結(jié)果。圖右側(cè)N、L和S分別指示切刻形 式環(huán)狀質(zhì)粒(Nick-form)、線性質(zhì)粒(Linear-form)和超螺旋環(huán)狀質(zhì)粒(Supercoil-form)。 從圖中可看出，在Mg2+、Mn2+和Co2+緩沖液中phivl0-p45具有DNA內(nèi)切酶活力。在Mn2+中活 力最強(qiáng)，其次是Mg2+和Co2.。在Ca2+、Ni2+、Cu2\ Zn2+緩沖液中檢測(cè)不到DNA內(nèi)切酶酶活力。二、phivl0-p45在含Mg2+和Mn2+緩沖溶液中的作用模式
為進(jìn)一步分析phivl0-p45在含Mg2+和Mn2+緩沖溶液中的作用模式，使用了逐級(jí)降 低酶濃度的方法(Titration)。20 ii 1 反應(yīng)體系包含 20mM Tris_HClpH7. 6、50mM NaCl、2mM DTT、5mM MgCl2 或 MnCl2、1 y g pUC19 和不等量的 phivl0_p45 蛋白。37°C溫浴 lh，然后用 1. 5%的瓊脂糖凝膠分析pUC19質(zhì)粒的降解情況，結(jié)果如圖5所示。圖5中，M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，左側(cè)為Mg2+緩沖體系，右側(cè)為Mn2+緩沖體系，第 6和12泳道未加酶，第1 5、7 11泳道酶濃度依次減半。由圖5可知，在含Mg2+的緩沖 溶液中，超螺旋質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌汰h(huán)狀形式，隨著酶量的增加，質(zhì)粒保持切刻環(huán)狀狀態(tài)。 在含Mn2+的緩沖溶液中，超螺旋質(zhì)粒也首先轉(zhuǎn)化為切刻環(huán)狀形式，隨后又轉(zhuǎn)化為線性形式， 隨著酶濃度增加，質(zhì)粒DNA被降解為更小片段，直至完全降解。因此在含Mg2+的緩沖溶液中，phivl0-p45具有隨機(jī)切刻活力。在含Mn2+的緩沖溶 液中，phivl0-p45具有隨機(jī)降解DNA的能力。以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種噬菌體核酸酶基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO.2的序列。
2.一種合成權(quán)利要求1所述的噬菌體核酸酶基因的方法，其特征在于，通過(guò)重疊延 伸PCR法將人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列進(jìn)行拼接，得到所述基因，其中，所述寡核苷酸序列如 下phiν 10-1CAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCG ；phiν 10-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCT ；phiν 10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTG ；phiν 10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTG ；phiv 10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCC ；phiν 10-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT ；phiv 10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAAC ；phiν 10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCAT ；phiν 10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCT ；phiv 10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC。
3.—種噬菌體核酸酶，其特征在于，所述核酸酶由SEQ ID NO. 2序列編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的噬菌體核酸酶，其特征在于，所述核酸酶具有SEQID NO. 1的 序列。
5.權(quán)利要求3所述的噬菌體核酸酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)對(duì)所述噬菌體核酸酶基因進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切；2)將步驟1)所得基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組載體；3)用所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，表達(dá)；4)收集菌體，破碎，純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為載體pET28a和 pET2Ia-MBP。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述pET21a-MBP載體由pET21a載體 改造得到，在Nde I和EcoR I位點(diǎn)之間插入了 MBP編碼區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌ER2566。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述純化方法為使用 Amylose或Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化。
10.權(quán)利要求3所述核酸酶在隨機(jī)切刻或切割雙鏈DNA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種噬菌體核酸酶及其制備和應(yīng)用。所述噬菌體核酸酶基因具有SEQ ID NO.2的序列。所述噬菌體核酸酶具有SEQ ID NO.1的序列。所述的噬菌體核酸酶的制備方法，包括如下步驟1)通過(guò)重疊延伸PCR方法人工合成該噬菌體核酸酶基因；2)將步驟1)所得基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組載體；3)用所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，表達(dá)；4)收集菌體，破碎，親和純化。上述核酸酶具有隨機(jī)切刻和切割雙鏈DNA的能力。本發(fā)明提供的方法能高效表達(dá)純化獲得該酶蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101851633SQ20101018725
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者單麗偉, 梁亞峰, 范三紅, 郭藹光 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)