專利名稱：一種Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物和生物治療學(xué)領(lǐng)域，涉及免疫靶向治療疫苗載體的構(gòu)建 以及載體和短肽耦聯(lián)的方法。
背景技術(shù)：
針對(duì)慢性疾病的治療性疫苗是目前疫苗研究的熱點(diǎn)，這些疾病包括慢性病毒感 染、過(guò)敏性疾病、腫瘤、糖尿病、高血壓和阿爾采默病等，其中一些治療性疫苗在臨床試驗(yàn)中 有較好的效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。與普通預(yù)防性疫苗不同的是治療性疫苗針對(duì)的是自 身抗原或外來(lái)免疫耐受抗原，因此，治療性疫苗要發(fā)揮治療作用必須首先打破免疫耐受，產(chǎn) 生針對(duì)特定抗原的自身抗體或自身反應(yīng)T細(xì)胞。由于治療性疫苗所針對(duì)的靶抗原一般是短 肽，抗原性較弱，必須與合適的載體結(jié)合后，在免疫佐劑的幫助下才能發(fā)揮作用，因此，選擇 合適的載體及佐劑往往是治療性疫苗成功的關(guān)鍵。在該發(fā)明提出之前，過(guò)去常用的載體如KLH、破傷風(fēng)類毒素等，效力一般不強(qiáng)，必須 使用佐劑，而常用的佐劑如弗氏佐劑雖然有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，但不能應(yīng)用于人體，鋁制 佐劑雖然可應(yīng)用于人體，但存在其他副反應(yīng)如腦動(dòng)脈硬化等。因此，理想的治療性疫苗載 體，應(yīng)該在與靶抗原結(jié)合后，在不應(yīng)用免疫佐劑的情況下，產(chǎn)生抗體或自身反應(yīng)T細(xì)胞，從 而發(fā)揮治療作用。病毒樣顆粒就是這樣一類理想的疫苗載體。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒的衣殼蛋白裝配成的不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，具有 病毒的外形和免疫原性，可通過(guò)和病毒感染一樣的途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以體液免疫為主的反 應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)與之結(jié)合的抗原的抗體，但不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒 感染的風(fēng)險(xiǎn)。由于病毒較細(xì)菌更原始，與哺乳動(dòng)物的種屬差異更大，作為載體其免疫原性極 強(qiáng)(如強(qiáng)于破傷風(fēng)類毒素等)。此外病毒樣顆粒由大量重復(fù)結(jié)構(gòu)的衣殼蛋白單體聚合而成， 進(jìn)入體內(nèi)后可以將特異性B細(xì)胞表面大量B細(xì)胞受體(BCR)聚集到一起，提供足夠強(qiáng)的第 一信號(hào)活化B細(xì)胞，從而有利于突破自身免疫耐受。每個(gè)衣殼蛋白單體一般具有堿性氨基 酸(如賴氨酸)，有些堿性氨基酸側(cè)鏈的氨基(-NH2)朝向顆粒的外表面，短肽等大分子只要 帶有合適的氨基酸(如-SH)，通過(guò)異雙功能交連劑(如Sulfo-SMCC)就能結(jié)合于VLP表面， 刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。已有基于VLP的血管緊張素II疫苗成功進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)，具有良 好的降壓效果。制備用于治療性疫苗載體的病毒樣顆粒，選擇合適的病毒十分重要。雖然病毒樣 顆粒本身不具有感染性，但是能感染人體的病毒可能與人體組織存在交叉反應(yīng)，免疫后可 能產(chǎn)生心肌炎等自身免疫性疾病，并且如果機(jī)體已感染過(guò)該病毒，該載體的免疫作用將減 弱，從而不能發(fā)揮治療作用。因此選擇合適的源病毒是關(guān)鍵，噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線 菌或螺旋體等微生物的病毒，噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的 存在，包括人體排泄物，它只寄居在易感宿主菌體內(nèi)，對(duì)人體無(wú)害。目前國(guó)內(nèi)外已制備出 MS2噬菌體病毒樣顆粒，國(guó)外也有Q β噬菌體病毒樣顆粒用于降壓疫苗的II a臨床試驗(yàn)， 這兩種噬菌體及F2噬菌體均屬單鏈線形RNA病毒，其外形成球形，由其衣殼蛋白組成的病
4毒樣顆粒非常適合用作治療性疫苗的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是構(gòu)建一種病毒樣顆粒，并對(duì)其進(jìn)行改建，使其成為免疫靶向治療的 短肽載體，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度特異性抗體，從而為免疫靶向治療提供平臺(tái)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)人員充分考慮研究了 Qi3噬菌體的生物特 征，因?yàn)镼 β噬菌體屬于III類RNA噬菌體，表面結(jié)構(gòu)和I、II類噬菌體相似，編碼衣殼蛋 白的C基因由兩部分組成，CP蛋白基因，以及CP延伸蛋白基因，CP蛋白基因末端為第一個(gè) 終止密碼子TGA，噬菌體有時(shí)會(huì)錯(cuò)讀終止密碼子而繼續(xù)表達(dá)，從而生成CP延伸蛋白，從而得 到C基因表達(dá)產(chǎn)物-Al蛋白(如圖1)。CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸所在位置是病 毒刺突頂端免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)，在CP蛋白輔助下，Al蛋白可以自行聚合為病毒樣顆粒。這為 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)奠定了良好的基礎(chǔ)和平臺(tái)。本發(fā)明所提供的病毒樣顆粒蛋白Q β _2aa，按下述方法得到步驟1)將Q β噬菌體CP蛋白基因終止密碼子，突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA后，克隆 至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，得到編碼CP蛋白質(zhì)粒pETQi3 -CP ；步驟2)在Qi3噬菌體CP延伸蛋白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)對(duì)應(yīng)基因內(nèi)插入編碼賴氨酸和 亮氨酸的核苷酸(AAGCTT)，并將CP蛋白基因終止密碼子TGA (CP蛋白基因第135位密碼子) 突變?yōu)镚GA后，克隆至原核表達(dá)載體PGEX4T-2中，得到編碼Al蛋白質(zhì)粒PGEXQi^-Al ；步驟3)突變后編碼Qi3噬菌體CP蛋白質(zhì)粒與Al蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘 導(dǎo)后表達(dá)得到病毒樣顆粒蛋白Qi3-2aa。由于Qβ噬菌體編碼衣殼蛋白的基因C由兩部分組成，CP蛋白基因，以及CP延伸 蛋白基因，CP蛋白基因末端為第一個(gè)終止密碼子TGA，即CP蛋白基因第135位密碼子，自 然界中的噬菌體有一定幾率錯(cuò)讀終止密碼子而繼續(xù)表達(dá)，從而生成CP延伸蛋白(如圖1)。 Q^噬菌體C基因表達(dá)產(chǎn)物-Al蛋白必須在CP蛋白的輔助下才能自行聚合為病毒樣顆粒。 本發(fā)明設(shè)計(jì)人通過(guò)步驟1)獲得單純Q0噬菌體CP蛋白，用于輔助Al蛋白組裝；步驟2)所述免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)為Q β噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼 子間部分，其表達(dá)產(chǎn)物位于病毒衣殼蛋白刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)主要識(shí)別區(qū)域，在其間 插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸(AAGCTT)，使得Al蛋白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)新增一個(gè)賴氨 酸和一個(gè)亮氨酸，由賴氨酸提供側(cè)鏈氨基，成為耦聯(lián)短肽的位點(diǎn)；步驟3)獲得Qi3噬菌體病毒樣顆粒蛋白，由于在Al蛋白免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)添加了賴氨 酸和亮氨酸兩個(gè)氨基酸，將新獲得Q β噬菌體病毒樣顆粒命名為Q β _2aa病毒樣顆粒蛋白。帶有Q β -2aa基因的表達(dá)載體有多種選擇，可以是原核表達(dá)載體，真核表達(dá)載體 或昆蟲(chóng)表達(dá)載體，表達(dá)生物可以為大腸桿菌、真核細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供以本發(fā)明獲得的病毒樣顆粒為載體的短肽_病毒樣 顆粒疫苗。本發(fā)明耦聯(lián)短肽抗原Q β -2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的方法，按如下方法制備 步驟1)將Q0噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA后，克隆至 原核表達(dá)載體pET28a (+)中，得到編碼CP蛋白質(zhì)粒pETQ β -CP ；步驟2)在Q β噬菌體CP延 伸蛋白基因中編碼免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)位置，即Q0噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密
5碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突 變?yōu)镚GA后克隆至原核表達(dá)載體PGEX4T-2中，得到編碼Al蛋白質(zhì)粒pGEXQi -Al ；步驟3) 突變后編碼Q3噬菌體CP蛋白質(zhì)粒與Al蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)后表達(dá)得到病 毒樣顆粒蛋白Qi3-2aa。步驟4)使用異雙功能交聯(lián)劑將短肽抗原耦聯(lián)至Q β _2aa噬菌體病 毒樣顆粒。本發(fā)明步驟l)Qi3噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子 TAA;步驟2)所述免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)為Qi3噬菌體CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸間部 分，位于病毒衣殼蛋白刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)主要識(shí)別區(qū)域。將CP蛋白基因終止密碼 子由TGA突變?yōu)镚GA后，使得大腸桿菌可以越過(guò)CP蛋白終止密碼子，繼續(xù)表達(dá)突變后CP延 伸蛋白，最終得到突變后Al蛋白。本發(fā)明在Qi3噬菌體CP蛋白輔助下，突變后Al蛋白自行聚合為病毒樣顆粒 一2ειει0本發(fā)明步驟2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間為編碼賴氨酸和 亮氨酸基因AAGCTT ；步驟3)中表達(dá)得到病毒樣顆粒Al蛋白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)中有賴氨酸和
亮氨酸。本發(fā)明耦聯(lián)短肽抗原為大鼠ATl受體胞外第二環(huán)肽RNVFFIE，在其N端添加一個(gè)半 胱氨酸(C)，使得異雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC可以將短肽抗原N端半胱氨酸，和病毒樣顆粒 Al蛋白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)賴氨酸耦聯(lián)，得到耦聯(lián)短肽抗原病毒樣顆粒Qi3 _2aa。本發(fā)明耦聯(lián)短肽抗原Qi3-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，是將短肽抗原耦聯(lián)到 Q^-2aa病毒樣顆粒而得到的疫苗。本發(fā)明靶抗原可以是T細(xì)胞表位，也可以是B細(xì)胞表位，或者是多種表位的組合。本發(fā)明的優(yōu)越性在于應(yīng)用本發(fā)明的載體可以將短肽展示在病毒樣顆粒免疫優(yōu)勢(shì) 決定區(qū)，從而更好的為機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，通過(guò)與傳統(tǒng)半抗原載體如KLH比較，Qi3-2aa噬 菌體病毒樣顆粒可以大大增強(qiáng)短肽抗原的免疫原性，有效誘導(dǎo)高滴度特異性抗體的生成。通過(guò)化學(xué)耦聯(lián)劑還可以將各種多肽抗原表位展示在病毒顆粒表面，便于免疫細(xì)胞 和免疫分子識(shí)別，在不使用佐劑條件下，誘導(dǎo)高效免疫反應(yīng)，達(dá)到治療病原體感染、腫瘤和 多種慢性疾病的目的，本發(fā)明為免疫靶向治療提供理想載體。本發(fā)明所述的編碼CP蛋白質(zhì)粒其培養(yǎng)物名稱命名為，大腸桿菌DH5 α /pETQ β -CP Escherichia coli DH5 α /pETQ^ -CP,并且在 2009 年 11 月 25 日以保藏號(hào) CCTCCN0 M209281保藏于國(guó)際保藏授權(quán)單位，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。本發(fā)明所述的編碼Al蛋白質(zhì)粒其培養(yǎng)物名稱命名為，大腸桿菌DH5ci/ pGEXQ^ -Al Escherichia coli DH5 α/pGEXQβ-Al，并且在 2009 年 11 月 25 日以保藏號(hào) CCTCCNO :Μ209282保藏于國(guó)際保藏授權(quán)單位，中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心。


圖1 本發(fā)明質(zhì)粒構(gòu)建步驟，將CP蛋白基因終止密碼子TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子 TAA后，亞克隆至pET28a(+)表達(dá)質(zhì)粒；將CP蛋白基因終止密碼子TGA突變?yōu)镚GA，在CP延 伸蛋白基因第72位至73位密碼子間插入核苷酸AAGCTT，亞克隆至PGEX4T-2表達(dá)質(zhì)粒，兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞。圖 2 其中，Ml 禾口 M2 分另Ij 為 TaKaRa 公司 DL2000 和 DL15000DNA Marker ； 1)是 pETQ β -CP 質(zhì)粒；2)是 pGEXQ β -Al 質(zhì)粒；3)是使用 EcoR I/Xho I 酶切 pETQ β -CP 質(zhì)粒得 到約400bp片斷；4)使用EcoR I/Xho I酶切pGEXQ β-Al質(zhì)粒得到約900bp片斷；5)是用 Hind III酶切pGEXQ β -Al質(zhì)粒得到線性化質(zhì)粒。圖 3 其中，圖 3 (a) SDS-PAGE 結(jié)果，M 為 Marke (Fermen tas, CAT#SM0671)，1 泳道為 共轉(zhuǎn)化PETQ β -CP和PGEXQ β -Al質(zhì)粒，未誘導(dǎo)時(shí)大腸桿菌表達(dá)蛋白；2泳道為使用IPTG誘 導(dǎo)后大腸桿菌表達(dá)蛋白；3泳道為裂解后細(xì)菌上清所含蛋白；4泳道為裂解后細(xì)菌沉淀所含 蛋白；5泳道為純化后CP蛋白；6泳道為純化后Al蛋白，圖3(b)WeStern Blot鑒定的His tag CP 蛋白，圖 3 (c)Western Blot 鑒定的 GST tag Al 蛋白。圖4(a)、(b)、(c)透射電鏡所示大腸桿菌中病毒樣顆粒的聚合，箭頭所指為大腸 桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)組裝成功的病毒樣顆粒，圖4(d)為純化后得到的病毒樣顆粒。圖5為各免疫組抗體按1 1000稀釋后，240nm吸光度，Qi3耦聯(lián)免疫組(Pl_Qi3) 和KLH耦聯(lián)免疫組(P 1-KLH)相比較，兩組間240nm吸光度有顯著性差異(P < 0. 05)。具體實(shí)施方法1.Q β噬菌體的培養(yǎng)和提取Q^噬菌體菌株購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)，復(fù)蘇和培養(yǎng)噬菌體方法參考 《分子克隆指南》，具體方法是使用TYG培養(yǎng)基(1%酪蛋白胰酶解物，0. 酵母提取物， 0. 葡萄糖，0. 8%氯化鈉，0. 03% CaCl2 · 2Η20)溶解噬菌體菌株，取0. Iml按比例稀釋數(shù) 個(gè)濃度。使用LB培養(yǎng)基(1%酪蛋白胰酶解物，0. 5%酵母提取物，0. 氯化鈉)擴(kuò)增宿主菌 DH5 α，使之達(dá)到飽和。在TYG培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉，高壓后制備瓊脂平板，另外制備 含0. 5%瓊脂粉的TYG培養(yǎng)基，高壓后待溫度降至約30°C后加入500ul飽和宿主菌DH5 α， 將其倒至已凝固1.5%瓊脂板，待凝固后將不同稀釋濃度Qi3噬菌體滴至平板上，37°C過(guò) 夜，次日可見(jiàn)噬菌斑形成，根據(jù)噬菌斑形成情況確定噬菌體濃度，使用相同方法擴(kuò)增培養(yǎng)噬 菌體。噬菌體培養(yǎng)完成后，刮取表層0.5%瓊脂培養(yǎng)基，12000rpm離心10分鐘，收集上 清，此即為噬菌體懸液，-80°C保存。2. CP蛋白基因亞克隆至pET28a(+)質(zhì)粒使用Trizol (Invitrogen，USA)、氯仿、異丙醇抽提噬菌體總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成 CDNA0設(shè)計(jì)引物如表1，下劃線分別為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增CP蛋白基因，電 泳切膠回收PCR產(chǎn)物。使用DNA Α-Tailing Kit (TaKaRa,大連)在PCR產(chǎn)物3，端加多聚A 尾，使用T4連接酶(TaKaRa)將其和pMD_19T中間質(zhì)粒(TaKaRa)連接，命名為pMD_CP，轉(zhuǎn) 化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明目的基因未發(fā)生突變。 表1引物序列使用EcoR I/Xho I分別酶切pET28a質(zhì)粒和pMD_CP，電泳切膠回收CP蛋白基因和 酶切后pET28a，使用T4連接酶(TaKaRa)連接回收產(chǎn)物，命名為pETQ β-CP。PCR鑒定該質(zhì)粒帶有目的基因，酶切鑒定(見(jiàn)圖2)和測(cè)序結(jié)果均表明目的基因插入正確酶切位點(diǎn)。3. CP蛋白基因終止子的突變，核苷酸AAGCTT的插入及亞克隆至PGEX4T-2質(zhì)粒設(shè)計(jì)引物如表2，下劃線分別是EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。以QP噬菌體總RNA 為模板，RT-PCR擴(kuò)增C基因，切膠回收目的基因。使用DNAA-Tailing Kit (TaKaRa,大連) 在PCR產(chǎn)物3，端加多聚A尾，使用T4連接酶(TaKaRa)將其和pMD_19T中間質(zhì)粒(TaKaRa) 連接，命名為pMD-ΑΙ，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表 明目的基因序列正確。 表2引物序列設(shè)計(jì)引物如表3，以pMD-Al模板，F(xiàn)1/R1、F2/R2、F3/R3為引物PCR擴(kuò)增目的基因， 產(chǎn)物分別命名為PCR1、PCR2、PCR3，電泳切膠回收PCR產(chǎn)物，使用DNA Polymerase(TaKaRa), 以上述PCR產(chǎn)物為模板，F(xiàn)1/R3為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為PCR4，電泳切膠回收PCR產(chǎn) 物，使用EcoRI/Xho I酶切，經(jīng)乙醇沉淀后命名為Insert DNA。 表3引物序列將質(zhì)粒PGEX4T-2用EcoR I/Xho I酶切，電泳回收酶切后質(zhì)粒，使用使用T4連接 酶(TaKaRa)將其和Insert DNA連接，命名為pGEXQ β -Al，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑選 菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，PCR鑒定該質(zhì)粒帶有目的基因，酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明目的基因插 入正確酶切位點(diǎn)，并且在CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間插入序列AAGCTT，見(jiàn)圖 2。4.病毒樣顆粒的表達(dá)和純化將質(zhì)粒pETQ β-CP和pGEXQ β-Al同時(shí)熱轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)大腸桿菌，在含卡那 霉素50ug/ml、氨芐青霉素lOOug/ml的LB瓊脂平板挑選菌落，搖菌過(guò)夜。取飽和菌液，加 入含卡那霉素50ug/ml、氨芐青霉素100ug/ml的LB培養(yǎng)基中，37°C擴(kuò)增至OD6tltl = 0. 6，加 入IPTG(Sigma)至終濃度為ImM，28°C搖菌培養(yǎng)8小時(shí)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。收集菌液，使用超聲 裂解細(xì)菌，全過(guò)程在冰浴中進(jìn)行，裂解結(jié)束后，4°C，13000g離心20分鐘，分別收集上清和沉 淀，用SDS-PAGE分析融合蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明質(zhì)粒pET-CP和pGEX-Al同時(shí)熱轉(zhuǎn)化至 BL2KDE3)大腸桿菌后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以有效表達(dá)，獲得一個(gè)分子量約為60kDa融合蛋白， 此即為突變后Al蛋白；另外，還可以獲得一分子量約為17kDa的融合蛋白CP，SDS-PAGE分 析細(xì)菌裂解后上清和沉淀發(fā)現(xiàn)融合蛋白可溶，見(jiàn)圖3a。對(duì)融合蛋白形成的多聚體，使用S印harose CL-4B(Pharmacia Biotech)層析柱分離獲得病毒樣顆粒Qβ _2aa，BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒(PIERCE，USA)測(cè)定透析產(chǎn)物濃度 后，-80°C分裝保存。SDS-PAGE分析表明經(jīng)過(guò)純化后，目的蛋白純度在90%以上，見(jiàn)圖2a。 Western Blot分析表明GST單克隆抗體和His tag單克隆抗體可以分別和誘導(dǎo)的融合蛋 白特異性結(jié)合，表明獲得的融合蛋白是由被誘導(dǎo)后pETQii -CP和PGEXQii-Al質(zhì)粒表達(dá)，見(jiàn) 圖3b。5.病毒樣顆粒的鑒定電鏡鑒定病毒樣顆粒，以確定突變后病毒顆粒在大腸桿菌內(nèi)正確聚合，將IPTG誘 導(dǎo)12小時(shí)后菌液lml，13000g離心Imi η后使用2. 5%戊二醛固定2小時(shí)，0. IM PBS洗3 次，每次20分鐘，1 %鋨酸后固定60分鐘后0. IM PBS洗3次，依次經(jīng)過(guò)50 %，70 %，90 %， 90%乙醇丙酮，90%丙酮，100%丙酮各5分鐘脫水，丙酮和環(huán)氧樹(shù)酯1 1浸透2小時(shí)后， 純環(huán)氧樹(shù)酯包埋浸潤(rùn)2小時(shí)，超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色各10分鐘后，透射 電鏡(荷蘭FEI Tecna G212)鑒定病毒樣顆粒在細(xì)菌內(nèi)的聚合，純化后的病毒樣顆粒于電 鏡下行磷鎢酸負(fù)染色以觀察病毒顆粒純化情況，結(jié)果表明可以在大腸桿菌胞質(zhì)中看到表 達(dá)的病毒樣顆粒，直徑約30nm ；純化后電鏡鑒定表明直徑約30nm球形蛋白顆粒大小均一， 形態(tài)一致，見(jiàn)圖46.肽段合成采用固相合成法應(yīng)用多肽合成儀(PSSM-8型多肽合成儀ShimadzuCompany， JAlan)自動(dòng)合成大鼠AT1受體胞外第二環(huán)肽CRNVFFIE (Pl)，采用Fmoc化學(xué)合成法，在合成 過(guò)程中，脫阻滯試劑被加到固相載體上，鈉阻滯集團(tuán)被脫阻滯，活化的氨基酸進(jìn)而與脫阻滯 試劑連接，肽段逐漸延長(zhǎng)，每合成一步，剩余的氨基酸被清洗干凈，以免干擾下一氨基酸的 合成，合成的肽段由自動(dòng)運(yùn)行的氮?dú)獯蹈?，具體合成過(guò)程按多肽合成儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。7.肽段Pl分別和Q β噬菌體病毒樣顆粒，以及KLH的耦聯(lián)分別取5mg Q β -2aa噬菌體病毒樣顆粒和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，和Iml 5mg/ml Sulfo-SMCC混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，其間間歇振蕩，使用0. IMPBS透析過(guò)夜，次日更換透析 液，繼續(xù)透析4小時(shí)后用于耦聯(lián)。取IOmg肽段P1，溶于500ul耦聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉緩沖液，0. IM EDTA, 0. 9M氯 化鈉，0. 02 %疊氮鈉，ρΗ7· 2)，后將其分別與結(jié)合Sulfo-SMCC的Q β _2aa噬菌體和KLH混 合，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，PBS透析過(guò)夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時(shí)后-80°C保存，此即 為制備的Pl-QP _2aa蛋白和Pl-KLH蛋白。8. Pl-Q β蛋白免疫SD大鼠8周齡SD大鼠30只隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為空白對(duì)照組，Qi3 _2aa耦聯(lián) 免疫組(Pl_Qi3 _2aa)和KLH耦聯(lián)免疫組(Pl-KLH)，免疫劑量為IOOug/只，皮下多點(diǎn)注射， 每2周加強(qiáng)免疫一次，免疫6次，每次留取血清，_20°C保存。9. ELISA測(cè)定抗體滴度96孔板每孔的包被量約在10 μ g。根據(jù)大鼠ATI受體胞外第二環(huán)肽Pl序列，采用 固相合成法應(yīng)用多肽合成儀自動(dòng)合成。將合成的兩個(gè)多肽片斷分別溶解于0. lmmol/L的碳 酸緩沖液中(pH = 9. 6)，配成100g/ml的抗原包被液，以每100 μ 1的量包被反應(yīng)，4°C過(guò)夜； 棄去孔中液體。5%小牛血清于37°C封閉40min。封閉時(shí)注意加滿各反應(yīng)孔，封閉結(jié)束后用 PBS洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3min。將倍比稀釋(1 1,000-1 50，000)免疫血清加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品至少加雙孔，每孔100 μ 1，置于37°C環(huán)境，40-60分鐘。PBST洗滌液 洗滌3遍，每遍3min。加入1 2000辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)抗體，于37°C下作用30min。加 入底物，每孔100 μ 1，置37°C避光顯色。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液 50 μ 1終止反應(yīng)，于20min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。OD值測(cè)定及結(jié)果判斷在ELX-800型酶標(biāo)儀 (Bio-tek公司，美國(guó))以450nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性、陰 性對(duì)照，測(cè)OD值時(shí)以空白對(duì)照調(diào)零，以保證檢測(cè)結(jié)果可靠性。研究抗體溶液與陰性抗體溶 液的吸光度之比([標(biāo)本OD值-空白對(duì)照OD值]/ [陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照OD值])超 過(guò)2.1倍者判為抗體檢測(cè)陽(yáng)性。 抗體滴度取對(duì)數(shù)后以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì) 作圖采用0rigin7. 5軟件，組間差異性比較采用方差分析(ANOVA)，以P < 0. 05具有顯著 性差異。結(jié)果表明第二次免疫后大鼠體內(nèi)針對(duì)Pl蛋白的抗體滴度開(kāi)始升高(如圖2)， Q β -2aa耦聯(lián)免疫組(P1-Q β -2aa)和KLH耦聯(lián)免疫組(Pl-KLH)特異性抗體滴度在第4次 免疫后達(dá)到穩(wěn)定，Q0-2aa耦聯(lián)免疫組(Pl-Qi3-2aa)抗體滴度約為1 30，000，KLH耦聯(lián) 免疫組(Pl-KLH)約為1 6，000兩組間抗體按1 1000稀釋后，240nm吸光度有顯著性差 異(P < 0.05)，見(jiàn)圖 5。序列表
<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科
<120> 一種Qi3 _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的制備方法及其用途
<160>3
<210>1
<211>402
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ATGGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAACATCGGGAAAGATGGAAAACAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGGTAA
ATCCCACTAACGGCGTTGCCTCGCTTTCACAAGCGGGTGCAGTTCCTGCGCTGGAGAAGCGTGTTACCGTTTCGGTATCTCA
GCCTTCTCGCAATCGTAAGAACTACAAGGTCCAGGTTAAGATCCAGAACCCGACCGCTTGCACTGCAAACGGTTCTTGTGAC
CCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTTTTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTC
GTACAGAGCTTGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTCTGCTGATCGATGCTATTGATCAGCTGAACCCAGCGTATTAA
<210>2
<211>996
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ATGGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAACATCGGGAAAGATGGAAAACAAACTCTGGTTCTCAATCCGCGTGGGGTAA
ATCCCACTAACGGCGTTGCCTCGCTTTCACAAGCGGGTGCAGTTCCTGCGCTGGAGAAGCGTGTTACCGTTTCGGTATCTCA
10
GCCTTCTCGCAATCGTAAGAACTACAAGGTCCAGGTTAAGATCCAGAACCCGACCGCTTGCACTGCAAACGGTTCTTGTGAC
CCATCCGTTACTCGCCAGGCATATGCTGACGTGACCTTTTCGTTCACGCAGTATAGTACCGATGAGGAACGAGCTTTTGTTC
GTACAGAGCTTGCTGCTCTGCTCGCTAGTCCTCTGCTGATCGATGCTATTGATCAGCTGAACCCAGCGTATGGAACACTGCT
CATTGCCGGTGGTGGCTCAGGGTCAAAACCCGATCCGGTTATTCCGGATCCACCGATTGATCCGCCGCCGGGGACAGGTAAG
TATACCTGTCCCTTCGCAATTTGGTCCCTAGAGGAGGTTTACGAGCCTCCTACTAAGAACCGACCGTGGCCTATCTATAATG
CTGTTGAACTCCAGCCTCGCGAATTTGATGTTGCCCTCAAAAAGCTTGATCTTTTGGGCAATACAAAGTGGCGTGATTGGGA
TTCTCGGCTTAGTTATACCACGTTCCGCGGTTGCCGTGGCAATGGTTATATTGACCTTGATGCGACTTATCTTGCTACTGAT
CAGGCTATGCGTGATCAGAAGTATGATATTCGCGAGGGCAAGAAACCTGGTGCTTTCGGTAACATTGAGCGATTCATTTATC
TTAAGTCGATAAATGCTTATTGCTCTCTTAGCGATATTGCGGCCTATCACGCCGATGGCGTGATAGTTGGCTTTTGGCGCGA
TCCATCCAGTGGTGGTGCCATACCGTTTGACTTCACTAAGTTTGATAAGACTAAATGTCCTATTCAAGCCGTGATAGTCGTT
CCTCGTGCTTAG
<210>3
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTA
CTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYGTLLIAGGGSGSKPD
PVIPDPPIDPPPGTGKYTCPFAIWSLEEVYEPPTKNRPffPIYNAVELQPREFDVALKKLDLLGNTKWRDffDSRL
SYTTFRGCRGNGYIDLDATYLATDQAMRDQKYDIREGKKPGAFGNIERFIYLKSINAYCSLSDIAAYHADGVIV
GFWRDPSSGGAIPFDFTKFDKTKCPIQAVIVVPRA
1權(quán)利要求
一種Qβ 2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，按如下方法制備步驟1)將Qβ噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA后，克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，得到編碼CP蛋白質(zhì)粒pETQβ CP；步驟2)在Qβ噬菌體CP延伸蛋白基因中編碼免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)位置，即Qβ噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆至原核表達(dá)載體PGEX4T 2中，得到編碼A1蛋白質(zhì)粒pGEXQβ A1；步驟3)突變后編碼Qβ噬菌體CP蛋白質(zhì)粒與A1蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)后表達(dá)得到病毒樣顆粒蛋白Qβ 2aa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Qi3-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在于在步驟2)中 將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后，使得大腸桿菌可以越過(guò)CP蛋白終止密碼 子，繼續(xù)表達(dá)突變后CP延伸蛋白，最終得到突變后Al蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述Qβ _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在于在Q β噬菌體 CP蛋白輔助下，突變后Al蛋白自行聚合為病毒樣顆粒Q β _2aa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述Qβ -2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在于所述CP延伸蛋 白第72位至73位氨基酸間為Q β噬菌體衣殼蛋白刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要 部位，即病毒樣顆粒的免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)；步驟2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密 碼子間為編碼賴氨酸和亮氨酸基因AAGCTT ；步驟3)中表達(dá)得到病毒樣顆粒Al蛋白免疫優(yōu) 勢(shì)決定區(qū)中有賴氨酸和亮氨酸。
5.一種制備權(quán)利要求1耦聯(lián)短肽抗原Qi3 _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白的方法，按如下 方法制備步驟1)將Q0噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA后，克 隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，得到編碼CP蛋白質(zhì)粒pETQi3 -CP ；步驟2)在Qi3噬菌體CP延伸蛋白基因中編碼免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)位置，即Qi3噬菌體CP 延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并將 CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆至原核表達(dá)載體PGEX4T-2中，得到編碼 Al蛋白質(zhì)粒pGEXQ0-Al ；步驟3)突變后編碼Q3噬菌體CP蛋白質(zhì)粒與Al蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)后 表達(dá)得到病毒樣顆粒蛋白Qi3 _2aa ；步驟4)使用異雙功能交聯(lián)劑將短肽抗原耦聯(lián)至Q β _2aa噬菌體病毒樣顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的耦聯(lián)短肽抗原Qβ _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在于 步驟l)Qi3噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA ；步驟2)所述免 疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)為Q β噬菌體CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸間部分，位于病毒衣殼蛋白 刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)主要識(shí)別區(qū)域，將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后， 使得大腸桿菌可以越過(guò)CP蛋白終止密碼子，繼續(xù)表達(dá)突變后CP延伸蛋白，最終得到突變后 Al蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的耦聯(lián)短肽抗原Qβ _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征 在于在Q β噬菌體CP蛋白輔助下，突變后Al蛋白自行聚合為病毒樣顆粒Q β _2aa。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述耦聯(lián)短肽抗原Qβ _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在于在步驟2)中插入CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間為編碼賴氨酸和亮氨酸基因 AAGCTT ；在步驟3)中表達(dá)得到病毒樣顆粒Al蛋白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)中有賴氨酸和亮氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述耦聯(lián)短肽抗原Qβ _2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在 于所述耦聯(lián)短肽抗原為大鼠ATl受體胞外第二環(huán)肽RNVFFIE，在其N端添加一個(gè)半胱氨酸 (C)，使得異雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC可以將短肽抗原N端半胱氨酸，和病毒樣顆粒Al蛋 白免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)賴氨酸耦聯(lián)，得到耦聯(lián)短肽抗原病毒樣顆粒Q β _2aa。
10.應(yīng)用權(quán)利要求5或9所述耦聯(lián)短肽抗原Qβ -2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，其特征在 于是將短肽抗原耦聯(lián)到Q β _2aa病毒樣顆粒而得到的疫苗。
全文摘要
一種Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白，按如下方法制備步驟1)將Qβ噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺?qiáng)終止密碼子TAA后，克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，得到編碼CP蛋白質(zhì)粒pETQβ-CP；步驟2)在Qβ噬菌體CP延伸蛋白基因中編碼免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)位置，即Qβ噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆至原核表達(dá)載體PGEX4T-2中，得到編碼A1蛋白質(zhì)粒pGEXQβ-A1；步驟3)突變后編碼Qβ噬菌體CP蛋白質(zhì)粒與A1蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)后表達(dá)得到病毒樣顆粒蛋白Qβ-2aa。使用異雙功能交聯(lián)劑將短肽抗原耦聯(lián)至Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101921733SQ20101002890
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者劉祖霞, 周子華, 廖玉華, 張曉麗, 王敏, 邱志華, 陳芬, 陳霄 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院