專利名稱：高β-葡聚糖含量的釀酒酵母突變菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母突變菌株及其應(yīng)用，特別涉及高β -葡聚糖含量的釀酒酵母突變 菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母屬于單細胞真核微生物，細胞壁厚度約為0. 1 0. 3 μ m，占細胞干重的20%， 其主要構(gòu)成為葡聚糖35% 45%、甘露聚糖40% 45%、蛋白質(zhì)5% 10%，另外還含有 少量脂肪等物質(zhì)。酵母葡聚糖屬于結(jié)構(gòu)多糖，位于細胞壁的最內(nèi)層，和原生質(zhì)體膜相連 接，其主要生理功能是維持細胞壁的機械結(jié)構(gòu)，保持細胞正常的生理形態(tài)。酵母葡聚糖 具有顯著的生理功效，研究發(fā)現(xiàn)其可以與特異的巨噬細胞受體結(jié)合以增強機體免疫活力， 還可以通過激活巨噬細胞以起到抗腫瘤、抗菌和愈合傷口的功效。此外，酵母β-葡聚糖還 具有良好的降低膽固醇和血脂的功效。酵母葡聚糖因其突出的功能活性而引起人們的 關(guān)注，目前報道的提高酵母中葡聚糖含量的方法主要有培養(yǎng)基優(yōu)化法、紫外照射法等?？臻g誘變是利用返回式空間飛行器，將植物種子、微生物菌種等材料送入太空，利 用太空特殊的環(huán)境條件，如微重力、空間輻射、超真空等，促使生物發(fā)生有益變異，從而培育 出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種的方法。微生物空間誘變研究目前主要集中在空間誘變對微生物產(chǎn)酶 活性、次級代謝產(chǎn)物以及菌肥活性的影響方面。有研究表明，空間誘變可使大腸桿菌、沙 門氏菌和枯草桿菌的生長加快，生長延遲期縮短，對數(shù)生長期延長。此外，空間誘變能使 嗜油細菌菌落生長率提高，并能使某些碳水化合物發(fā)酵，同化半乳糖。劉志恒等利用 “90105”科學返回衛(wèi)星，研究了 24株微生物空間誘變條件下的生長與代謝性狀，發(fā)現(xiàn)多數(shù) 菌株能夠存活，一些細菌和放線菌的生長速度加快、生物量增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供高β -葡聚糖含量的釀酒酵母突變菌株。本發(fā)明提供的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突變菌株FFLM2. 0016，其 保藏號為CGMCC No. 3730，于2010年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 究所，郵編100101)。所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2. 0016的細胞形態(tài)呈卵圓形， 細胞長度2. 5-3. 8 μ m，寬度2. 2-3. 0 μ m，菌落顏色為乳白色，菌落形態(tài)為球形突起、表面 光滑而光澤、不透明、奶油狀，易挑起。繁殖方式為芽殖，具有完整的細胞核和線粒體等， 細胞壁組成主要為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)等。有發(fā)酵能力，能夠發(fā)酵葡萄糖、 果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖，不能夠發(fā)酵乳糖，該結(jié)果與菌種鑒定手冊中釀酒酵母屬酵母 (Saccharomyce cerevisiae)發(fā)酵糖類結(jié)果一致。能夠同化硫酸銨，但不能夠同化硝酸鉀， 同化結(jié)果符合釀酒酵母對氮源的同化規(guī)律。釀酒酵母的生活史如下子囊孢子在適宜條件 下發(fā)芽產(chǎn)生單倍體營養(yǎng)細胞一單倍體營養(yǎng)細胞生長、出芽繁殖一兩個性別不同的營養(yǎng)細胞結(jié)合，質(zhì)配一核配成二倍體營養(yǎng)細胞一不斷出芽繁殖。所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016 可用于生產(chǎn) β -葡聚糖。具體可在YEPD培養(yǎng)基、32 °C、初始ρΗ為5的條件下培養(yǎng)釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016，以得到高產(chǎn)量的 β -葡聚糖。所述突變菌株，是由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 2. 0016 (Y-8)經(jīng)過 搭載“實踐8號”衛(wèi)星空間誘變后，篩選出的高葡聚糖含量的釀酒酵母突變菌株。該 突變菌株的生物量、細胞壁厚度及葡聚糖含量均比誘變前菌株顯著增加，分別增加了 57.70%、73.2%和169.6%。該突變菌株的獲得對生產(chǎn)β _葡聚糖具有重要的意義。


圖1為突變菌株FFLM2. 0016的生長曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、高β -葡聚糖含量的酵母突變菌株的篩選及測定一、篩選1、空間誘變樣品的培養(yǎng)、制備從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心購買釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)2. 0016 (Y_8)(該菌株由東北科學院大連分所篩選得到，CGMCC菌種保藏手冊 可以查到)，經(jīng)YEPD培養(yǎng)基28°C、160r/min培養(yǎng)72h，收集、洗凈、冷凍干燥。2、“實踐8號”衛(wèi)星搭載過程將冷凍管保存的冷凍干燥后的酵母菌體送入衛(wèi)星裝載艙。衛(wèi)星于2006年9月9 日15時升空，經(jīng)過15d的繞地在軌運行，于2006年9月24日10時分返回地面。衛(wèi)星運行 的近地點高度為180km，遠地點高度為469km，軌道傾角為63°。衛(wèi)星運行期間回收艙內(nèi)溫 度在20. 72 7.21 °C之間。3、衛(wèi)星搭載后返回樣品的初篩將搭載樣品洗脫到IOml無菌水中，稀釋至10_4，取0. Iml涂布于YEPD平板上，28°C 培養(yǎng)72h。選擇生長良好的100個單菌落，每個菌落轉(zhuǎn)接一支YEPD斜面作為原始菌株保藏。 然后，每個菌株接一個搖瓶(100ml YEPD培養(yǎng)基)，28°C震蕩培養(yǎng)72h，選出生物量較高的菌 株20株。4、衛(wèi)星搭載后返回樣品的復篩將上述斜面保藏的生物量較高的菌株，選取3個不同部位菌體，接種于YEPD液體 種子培養(yǎng)基中(50ml YEPD培養(yǎng)基)，12h后接于100ml YEPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基、28°C震蕩培 養(yǎng)72h，選出生物量及葡聚糖含量高的菌株4株。此4株菌株再按照上述方法復篩，得 到1株生物量及β -葡聚糖含量最高的菌株，記為FFLM2. 0016。該突變菌株細胞形態(tài)呈卵圓形，細胞長度為2. 5-3. 8 μ m，寬度2. 2-3. 0 μ m，菌落 顏色為乳白色，菌落形態(tài)為球形突起、表面光滑而有光澤、不透明、奶油狀，易挑起。繁殖方 式為芽殖，具有完整的細胞核和線粒體等，細胞壁組成主要為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)等。有發(fā)酵能力，能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖，不能夠發(fā)酵乳糖，該結(jié) 果與菌種鑒定手冊中釀酒酵母屬酵母(Saccharomycecerevisiae)發(fā)酵糖類結(jié)果一致。能 夠同化硫酸銨，但不能夠同化硝酸鉀，同化結(jié)果符合釀酒酵母對氮源的同化規(guī)律。釀酒酵母 的生活史如下子囊孢子在適宜條件下發(fā)芽產(chǎn)生單倍體營養(yǎng)細胞一單倍體營養(yǎng)細胞生長、 出芽繁殖一兩個性別不同的營養(yǎng)細胞結(jié)合，質(zhì)配一核配成二倍體營養(yǎng)細胞一不斷出芽繁 殖。該突變菌株已于2010年4月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所，郵編100101)。二、測定1、突變菌株FFLM2. 0016的生物量、細胞壁厚度及β -葡聚糖含量測定將誘變的出發(fā)菌株Saccharomyces cerevisiae 2. 0016 (Y-8)和突變菌株 FFLM2. 0016分別接種于50ml YEPD液體種子培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)12h ；然后取3ml種子 培養(yǎng)液接種于100ml YEPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)72h。離心收集菌體，測定 Saccharomyces cerevisiae 2. 0016 (Y-8)和突變菌株 FFLM2. 0016 的生物量、細胞壁厚度 及β-葡聚糖含量。生物量的測定方法如下取發(fā)酵液5ml，4200r/min離心15min，收獲菌體，蒸餾水 洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈無色，洗凈的酵母菌體于80°C下干燥至恒重。細胞壁厚度的測定方法如下取發(fā)酵液5ml，4200r/min離心15min，收獲菌體，蒸 餾水洗5次，戊二醛固定過夜，乙醇脫水，冰點干燥，噴金后使用掃描電子顯微鏡(Hitachi SEM-2500)觀察酵母細胞，隨即選取細胞拍照，使用Photoshop軟件測量照片中細胞壁尺 寸，根據(jù)比例尺計算實際厚度。β-葡聚糖含量測定方法如下取發(fā)酵液5ml，4200r/min離心15min，收獲菌 體，蒸餾水洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈無色，沉淀中加入0. 5ml蒸餾水和0. 5g直徑在 0. 45-0. 55mm的玻璃珠。采用渦流振蕩方法破壁，每次20s循環(huán)4次，離心取沉淀，蒸餾水 洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈無色，得到細胞壁，細胞壁先用72%硫酸100μ 1在室溫條件 下預處理3h，然后稀釋至1ml，使硫酸的最終濃度為4mol/L，在100°C條件下酸水解4h后用 NaOH中和，G0P0D雙酶法測定葡萄糖含量，乘以校正因子0. 9即得β -葡聚糖含量。三次重復實驗的結(jié)果表明突變菌株FFLM2. 0016的生物量為932士4. 2mg/100ml 發(fā)酵液、細胞壁厚度為183. 1 士 1.7nm、β -葡聚糖含量為149. 1 士0. 8mg/100ml發(fā)酵液；原 始菌株 Saccharomyces. cerevisiae 2. 0016 (Y-8)的生物量為 591 士 12. 7mg/100ml 發(fā)酵 液、細胞壁厚度為105.7±4.8nm、β -葡聚糖含量為55. 3士0. 9mg/100ml發(fā)酵液。所述突 變菌株的β-葡聚糖占酵母細胞比重為16. 00%，原始菌株Saccharomyces. cerevisiae 2. 0016 (Y-8)的β-葡聚糖占酵母細胞比重為9. 36%。突變菌株FFLM2. 0016的生物量、細 胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比誘變前菌株Saccharomyces cerevisiae 2. 0016(Y_8)顯 著增加，分別增加了 57.70%、73.2%和169.6%。經(jīng)過連續(xù)15次轉(zhuǎn)接，所述突變菌株的生 物量、β-葡聚糖含量穩(wěn)定，未出現(xiàn)回復突變狀況。2、突變菌株FFLM2. 0016的生理特性測定突變菌株FFLM2. 0016生長曲線測定方法如下先將突變菌株FFLM2. 0016接種
5于YEPD液體種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h，然后取3ml種子培養(yǎng)液接種于YEPD液體發(fā)酵培 養(yǎng)基中。前24h內(nèi)，每隔2h測定菌株生物量與β -葡聚糖含量；24h-48h內(nèi)，每隔4h測定 菌株生物量與β-葡聚糖含量；48h-96h內(nèi)，每隔6h測定菌株生物量與β-葡聚糖含量； 96h-120h內(nèi)，每隔8h測定菌株生物量與β -葡聚糖含量。由突變菌株FFLM2. 0016生長曲線(圖1)測定得出，接種后所述突變菌株未經(jīng)延 遲期便迅速進入對數(shù)生長期，60h后，酵母菌的生長和β -葡聚糖生成量均進入穩(wěn)定期。突變菌株FFLM2. 0016培養(yǎng)條件優(yōu)化方法如下先將突變菌株FFLM2. 0016接種于 YEPD液體種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h后接種于YEPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)條件為溫 度28°C、接種量3ml、起始pH值為4。按照實驗設(shè)計的不同培養(yǎng)條件對基礎(chǔ)培養(yǎng)條件做相應(yīng) 的改變，測定所得酵母生物量及葡聚糖含量。單因素實驗設(shè)計如下培養(yǎng)溫度26°C、 28°C、30°C、32°C、34°C ；接種量:lml、2ml、3ml、4ml、5ml ；起始 pH 值3、4、5、6、7。在單因素 實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過三因素、五水平正交實驗得到該突變菌株FFLM2. 0016的最佳培養(yǎng) 條件為溫度32°C、pH值5、接種量5ml。
權(quán)利要求
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016，其保藏號為CGMCCNo.3730。
2.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016在制備 葡聚糖中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) FFLM2. 0016 在 32°C、pH 為 5 的條件下進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了高β-葡聚糖含量的釀酒酵母突變菌株(Saccharomycescerevisiae)FFLM2.0016。該突變菌株的保藏號為CGMCC No.3730，是由菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)經(jīng)過搭載“實踐8號”衛(wèi)星空間誘變后，篩選出的高3-葡聚糖含量的突變菌株。該突變菌株的生物量、細胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比誘變前菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)顯著增加。
文檔編號C12P19/08GK101880635SQ20101018841
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者劉紅芝, 王強 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所