專利名稱：一種定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
人工皮膚是一種能夠在人體實(shí)現(xiàn)無損傷修復(fù)的皮膚組織。與傳統(tǒng)的皮膚修復(fù)不 同，人工皮膚修復(fù)既不是自體皮膚修復(fù)，也不是異體皮膚移植式手術(shù)，其原理是將真皮成纖 維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)替代物混合制成人工皮膚，或單純使用多孔的細(xì)胞外基質(zhì)替代真皮植 入創(chuàng)面，上面移植上皮細(xì)胞覆蓋或待自身上皮覆蓋取代病損的皮膚。對(duì)于燒傷整形外領(lǐng)域 來說，由于運(yùn)用組織工程皮膚來進(jìn)行修復(fù)皮膚缺損和瘢痕，重建功能形態(tài)，不必考慮自身皮 源缺乏的問題，因此是一種解決大面積創(chuàng)面修復(fù)的理想方法。隨著組織工程的發(fā)展，目前已經(jīng)生產(chǎn)出了在組織學(xué)和功能上完全接近天然皮膚的 人工皮膚，雖然它并不完全具備所有的成分，但它具備角質(zhì)層，它是皮膚的最外層，對(duì)皮膚 能夠起到屏障保護(hù)、自我提供皮膚養(yǎng)分和支持性的作用，因此人工皮膚角質(zhì)層的屏障功能 對(duì)于人工皮膚的功能具有非常重要的影響。但是，目前人工皮膚角質(zhì)層的屏障功能只能根據(jù)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)觀察來進(jìn)行評(píng)價(jià)， 屬于主觀性評(píng)價(jià)，準(zhǔn)確度不高，而目前尚未有能夠定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種能夠定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì) 層屏障功能的方法。本發(fā)明的定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，包括下列步驟(1)從人工 皮膚中分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量；(4)獲得角質(zhì) 層對(duì)SDS屏障作用的定量數(shù)值；(5)根據(jù)(2)至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層 屏障功能的定量數(shù)值。優(yōu)選地，本發(fā)明的定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，包括下列步驟(1)從人工皮膚中分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)電鏡觀察并記錄角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量提取角質(zhì)層總脂質(zhì)成分，用高效薄層色譜法進(jìn)行分析 定量并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸和膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)；(4)獲得角質(zhì)層對(duì)SDS屏障作用的定量數(shù)值將不同濃度的SDS作用于人工皮膚 的角質(zhì)層15小時(shí)，MTT檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算出各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率；(5)根據(jù)(2)至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值。本發(fā)明的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)第(1)至(3)項(xiàng)的數(shù)值進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，第(1)項(xiàng)中的細(xì)胞層數(shù)可以分為5種等級(jí)，其中15-25層為4分，9-14層為3分，5_8層或者大于25層為2分， 1-4層為1分，O層為O分；第(2)項(xiàng)中的磷脂、游離脂肪酸和膽固醇含量之和占總脂含量的 相對(duì)百分?jǐn)?shù)也分為5種等級(jí)，其中75-85%為4分，65-74%為3分，50-64%或者大于85% 為2分，11-50%為1分，0-10%為0分；第(3)項(xiàng)中的各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率(IC50，單 位mg/ml)也分為5種等級(jí)，其中2. 1-2. 5為4分，2. 6-3. 0為3分，1. 6-2. 0為2分，1-1. 5 為1分，小于1.0或者大于3.0為0分；最后根據(jù)第(1)至(3)項(xiàng)的得分結(jié)果，計(jì)算出人工 皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值，分為四種等級(jí)其中11-12分為優(yōu)等，9-10分為良好，6-8 分為合格，小于6或者任一單項(xiàng)為0分為不合格。本發(fā)明的定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法具有如下技術(shù)效果1、本方法屬于定量評(píng)價(jià)，相對(duì)于只根據(jù)表面形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，更加準(zhǔn)確嚴(yán) 謹(jǐn)；2、本發(fā)明的方法簡單，便于操作。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明的所有實(shí)施例中的人工皮膚總脂質(zhì)成分的提取是按照參考文獻(xiàn)(Bligh， Ε. G, Dyer, W. J. ,1959. A rapid method of total lipidextraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37，911-917.)的方法進(jìn)行。實(shí)施例1本實(shí)施例中，定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，包括下列步驟(1)從人工皮膚中分離出角質(zhì)層將人工皮膚放入0.01%蛋白酶K的PBS溶液 37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，用鑷子機(jī)械分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)電鏡觀察并記錄角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)，有18層，得4分；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量提取角質(zhì)層總脂質(zhì)成分，用高效薄層色譜(HPLC)進(jìn)行 分析定量并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸和膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)為80%， 得4分；(4)獲得角質(zhì)層對(duì)SDS(十二烷基硫酸鈉)屏障作用的定量數(shù)值將不同濃度的 SDS作用于人工皮膚的角質(zhì)層15小時(shí)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì) 算出各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率，為2. 8，得3分；(5)根據(jù)⑵至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值， 得12分，表明人工皮膚角質(zhì)層屏障功能是優(yōu)等。實(shí)施例2實(shí)施例2的步驟與實(shí)施例1相同，其結(jié)果如下電鏡觀察出細(xì)胞層數(shù)有10層，得3分；HPLC分析定量并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸 和膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)為71%，得3分；MTT檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算 出各濃度下細(xì) 半數(shù)致死率，為2. 6，得3分；按照上述的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層 屏障功能的定量數(shù)值，得9分，表明人工皮膚角質(zhì)層屏障功能是良好。實(shí)施例3實(shí)施例3的步驟與實(shí)施例1相同，其結(jié)果如下
電鏡觀察出細(xì)胞層數(shù)有8層，得2分；HPLC分析定量并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸和 膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)為60%，得2分；MTT檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算出 各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率，為1.6，得2分；按照上述的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏 障功能的定量數(shù)值，得6分，表明人工皮膚角質(zhì)層屏障功能是合格。實(shí)施例4 實(shí)施例4的步驟與實(shí)施例1相同，其結(jié)果如下電鏡觀察出細(xì)胞層數(shù)有3層，得1分；HPLC分析定量并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸和 膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)為70%，得3分；MTT檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算出 各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率，為1. 5，得1分；按照上述的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏 障功能的定量數(shù)值，得5分，表明人工皮膚角質(zhì)層屏障功能是不合格。
權(quán)利要求
一種定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，其特征在于，包括下列步驟(1)從人工皮膚中分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量；(4)獲得角質(zhì)層對(duì)SDS屏障作用的定量數(shù)值；(5)根據(jù)(2)至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，其特征在于，包 括下列步驟(1)從人工皮膚中分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)電鏡觀察并記錄角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量提取角質(zhì)層總脂質(zhì)成分，用高效薄層色譜法進(jìn)行分析定量 并計(jì)算出磷脂、游離脂肪酸和膽固醇含量之和占總脂含量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)；(4)獲得角質(zhì)層對(duì)SDS屏障作用的定量數(shù)值將不同濃度的SDS作用于人工皮膚的角 質(zhì)層15小時(shí)，MTT檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算出各濃度下細(xì)胞半數(shù)致死率；(5)根據(jù)(2)至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法，包括下列步驟(1)從人工皮膚中分離出角質(zhì)層；(2)獲得角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)；(3)獲得角質(zhì)層脂類含量；(4)獲得角質(zhì)層對(duì)SDS屏障作用的定量數(shù)值；(5)根據(jù)(2)至(4)項(xiàng)的總體結(jié)果，計(jì)算出人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的定量數(shù)值。本發(fā)明的定量評(píng)價(jià)人工皮膚角質(zhì)層屏障功能的方法具有如下技術(shù)效果1、本方法屬于定量評(píng)價(jià)，相對(duì)于只根據(jù)表面形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，更加準(zhǔn)確嚴(yán)謹(jǐn)；2、本發(fā)明的方法簡單，便于操作。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK101865899SQ20101020402
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者曹玉萍, 蔣明軍, 鄒運(yùn)動(dòng) 申請人:鄒運(yùn)動(dòng)